Name: In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a rastrear células marcadas con 19F en ratones mediante resonancia magnética in vivo. Este protocolo permite cuantificar células dendríticas inmunoterapéuticas sin señal de fondo confusa en entornos clínicos y preclínicos.

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Nos gustaría reconocer Nadine Henn y Arend Heerschap por su valiosa ayuda. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Holandés de Medicina Regenerativa (NIRM, FES0908), el Encite programa FP7 de la UE (SALUD-F5-2008 a 201842) y TargetBraIn (SALUD-F2-2.012-279.017), una beca de la Fundación Volkswagen ( I/83 443), la Organización Holandesa para la Investigación Científica (Veni Vidi 700.10.409 y 917.76.363), ERC (Advanced Grant 269 019), y la Universidad de Radboud Nijmegen Medical Centre (AGIKO-2008-2-4).

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<li>Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+two+methods+for+measuring+the+signal+to+noise+ratio+on+MR+images%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images.</a> Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

El protocolo descrito aquí describe el procedimiento general para el seguimiento in vivo de células 19 F resonancia magnética. A pesar de el método de co-incubación descrito, hay varios protocolos diferentes para etiquetar las células con un agente de 19 F. Sin embargo, la co-incubación se usa con más frecuencia y puede optimizarse por ejemplo, mediante la adición de agentes de transfección 6. El protocolo de etiquetado real de células dependerá del tipo de célula. Sólo...

En el seguimiento de células in vivo es esencial para la optimización y la supervisión de la terapia celular 1. Debido a su naturaleza no invasiva, tratamiento de imágenes ofrece excelentes oportunidades de observar las células in vivo. Imagen de Resonancia Magnética (IRM) es independiente de la radiación ionizante y permite una resolución de imagen superior y el contraste intrínseco de tejido blando. Seguimiento de células basada en RM ya se ha utilizado clínicamente para seguir las células dendríticas en pacientes con melanoma 2. MRI clínica convencional se lleva a cabo en el núcleo 1 H, presentes en el agua móvil en los tejidos. También es posible llevar a cabo resonancia magnética en otros núcleos activos, tales como 13 C, 19 F y 23 Na. Sin embargo, sólo el 19 F MRI se ha aplicado con éxito para el seguimiento in vivo de células, ya que ofrece la más alta sensibilidad después del 1 de H. La ausencia de la RM-detectable endógena 19 F en los tejidos permite una alta selectividad de la señal para lala detección de agentes de contraste exógenos 19 F y permite la cuantificación de la concentración de flúor directamente de los datos de imagen. Para una discusión detallada sobre 19F MRI, consulte 3-5. Una cuestión clave con 19 F RM es la necesidad de desarrollar y optimizar los marcadores adecuados de células 19 F, aunque se han desarrollado varias etiquetas, con una tendencia hacia los agentes multimodales 6. El protocolo se describe aquí se basa en los estudios realizados por nuestros grupos de 7-9, incluyendo los primeros artículos que describían in vivo cuantitativa 19 celular basada en RM F seguimiento 10,11. El procedimiento general de seguimiento celular utilizando 19 F RMN se resume en la Figura 1. Se describe un protocolo general para el etiquetado y la formación de imágenes de células dendríticas (DCs) utilizando un agente de contraste de perfluorocarbono a medida 8. El protocolo de formación de imágenes es generalmente aplicable a diferentes tipos de células, las etiquetas y los modelos animales. Lamodelo de tipo celular y animal descrito aquí debe tomarse sólo como un ejemplo, y por lo tanto no proporcionan información sobre el aislamiento de células y el etiquetado, sino que más bien se centran en el protocolo de obtención de imágenes. Las modificaciones serán necesarias para cada etiqueta, tipo de célula, modelo animal, y la configuración de la imagen, y estos se pueden encontrar en la literatura o pueden necesitar ser optimizado por los investigadores. Algunas modificaciones comunes se incluyen en la discusión.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00131855</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Ketavet)</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr><tr><td>Ophtosan </td><td>Produlab Pharma</td><td>2702</td><td>ungüento oftálmico</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Nombre del material</fuerte> </td></tr><tr><td>escáner de resonancia magnética</td><td>Bruker Biospec</td> Espectrómetro de RMN Bruker Biospec <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo mri de 19f para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI permite el seguimiento cuantitativo de células sin el uso de la radiación ionizante. Es una técnica no invasiva que se puede aplicar a los seres humanos. Aquí se describe un protocolo general para el etiquetado de células, formación de imágenes y procesamiento de imágenes. La técnica es aplicable a diversos tipos de células y modelos animales, aunque en este caso nos centramos en un modelo típico de ratón para el seguimiento de las células inmunes murinos. Los temas más importantes para el etiquetado de las células se describen, ya que son relevantes para todos los modelos. Del mismo modo, los parámetros clave de formación de imágenes se enumeran, aunque los detalles pueden variar dependiendo del sistema de resonancia magnética y la configuración individual. Por último, se incluye un protocolo de tratamiento de la imagen para la cuantificación. Variaciones para esta y otras partes del protocolo, se evalúan en la sección de Discusión. Basándose en el procedimiento detallado se describe aquí, el usuario tendrá que adaptar el protocolo para cada tipo específico de células, etiqueta celular, modelo animal, y la configuración de imágenes. Tenga en cuenta que la pROTOCOLO también se puede adaptar para el uso humano, siempre y cuando se cumplan las restricciones clínicos.

Aquí se muestran los resultados típicos de un protocolo que implica la transferencia de 19 células marcadas con F mensajeras a un ganglio linfático de drenaje. Figura 2 muestra un espectro de RMN de 19 F 10 6 células marcadas utilizando una referencia TFA. La configuración de formación de imágenes se llevó a cabo como se describe en el protocolo (Figura 3). Para la formación de imágenes in vivo, se utilizó una referencia consistente en un cilind...

Se describe un protocolo general para el seguimiento de las células in vivo mediante resonancia magnética en un modelo de ratón con ex vivo las células marcadas. Un protocolo típico para el etiquetado de células, el procesamiento de adquisición de imágenes y la cuantificación se incluye.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes y cuantificar el número de células marcadas con 19 F in vivo utilizando 19 FMRI. Esto se puede hacer en un entorno clínico o preclínico. Esto se logra marcando primero las células con un agente 19 F adecuado.En la mayoría de los casos, esto se hace ex vivo. El segundo paso es cuantificar el contenido de 19 F por celda, lo que se puede hacer usando 19 F y MR con una referencia conocida. Se supone que el contenido de 19 F por celda permanece constante durante el experimento, de lo contrario, se deben calcular los factores de corrección.A continuación, se obtienen imágenes del sujeto in vivo utilizando una H y 19 FMRI para localizar las células marcadas transferidas. Una referencia conocida y los parámetros de imagen apropiados son esenciales para la cuantificación a partir de los datos de imagen. El paso final es procesar los datos de la imagen para calcular el número de celdas.En la medida de lo posible, se pueden utilizar técnicas histológicas ex vivo u otras técnicas para corroborar los datos. En última instancia, se pueden utilizar 19 FMRI para el seguimiento celular in vivo para estudiar las células transferidas en términos de su localización y número durante el período de tiempo relevante, dadas ciertas suposiciones como se describe en el texto. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como una HMRI que utiliza etiquetas de células superparamagnéticas, es que no hay una señal de fondo confusa y que el número de células se puede determinar directamente a partir de los datos de la imagen.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapéutica celular, como dónde están las células y cuántas están presentes en varios puntos temporales. Para comenzar este protocolo, primero agregue una etiqueta 19 F a las células dendríticas inmaduras a una concentración de cuatro miligramos por 1 millón de células en dos mililitros de medio. Luego revuelva suavemente para mezclar.A continuación, incube las células dendríticas con la etiqueta durante tres días antes de madurar y cosechar. A continuación, recoja las células y retire el exceso de etiqueta lavando al menos tres veces. En el recuento de PBS, las células resultantes se resuspenden en un pequeño volumen de PBS para su inyección o pruebas adicionales.Tenga en cuenta que el protocolo descrito aquí es relevante para estas células dendríticas específicas y la etiqueta. Por lo tanto, será necesario encontrar un protocolo para otro tipo de célula en la literatura u optimizarlo por el investigador. Coloque un número conocido de células marcadas en un tubo de RMN.A continuación, añada 10 microlitros de 5% de tri Fluor o ácido ácido, o TFA. Si la frecuencia de resonancia de TFA no es adecuada debido a la superposición con la etiqueta, utilice un compuesto soluble alternativo. Coloque una muestra en un espectrómetro de RMN y obtenga el espectro de flúor 19.A continuación, calcule las áreas relativas bajo los picos de la referencia y la muestra o el pico principal de la muestra, y luego calcule el número medio de fluoruros por célula en la muestra. Tenga en cuenta que todo este proceso debe repetirse en promedio para alcanzar la significación estadística. Esto también se puede hacer usando espectroscopía directamente en el escáner de resonancia magnética.También tenga en cuenta que este procedimiento revela solo la carga promedio de flúor 19 para un gran número de células, no la variabilidad entre células. La comprobación de la uniformidad de la absorción celular requiere la presencia de un componente fluorescente con el agente 19 F. Aquí solo el escenario tres muestra el marcaje homogéneo de las células, aunque esto siempre se asume en los cálculos, esto se puede verificar utilizando técnicas complementarias como la microscopía configurada para la obtención de imágenes colocando un ratón completamente anestesiado en una cuna e inmovilizándolo para evitar el movimiento durante la exploración.Además, conecte el control de temperatura y respiración para el monitoreo fisiológico durante la exploración. Si es necesario, coloque una referencia externa al lado del animal, tanto la referencia como la región de interés deben estar en el centro de la bobina. Comience la adquisición con una resonancia magnética de protones convencional como referencia anatómica para las imágenes de 19 F.A continuación, ajuste el sistema a la frecuencia de 19 F del marcador celular y realice una exploración de 19 FMRI. Idealmente, la exploración de 19 FMRI tendrá el mismo campo de visión y selección de corte que una resonancia magnética convencional, aunque probablemente con una resolución más baja. A continuación, determine la ganancia de pulso de referencia de 19 F utilizando la fórmula que se ve aquí y adquiera un espectro de 19 FNMR para determinar la frecuencia de 19 F.Estimación del factor C dependiente de la bobina de radiofrecuencia en un experimento in vitro separado. El uso de una bobina de radiofrecuencia con un perfil B uno homogéneo, como una bobina de superficie, puede dificultar la cuantificación de datos de 19 F. Ya que la señal depende no solo de la concentración de 19 F, sino también de la distancia a la bobina.Por lo tanto, adquiera un mapa B uno en el canal H para corregir retrospectivamente los datos de 19 F. Esto requiere que los perfiles de bobina de un H y 19 F sean idénticos, excepto por el factor de proporcionalidad C, y que se proporcione suficiente señal de fondo de un H en regiones de 19 F. Aquí vemos mapas de ángulo inverso de tubos con TFA en agua adquiridos en el canal uno H y 19 F. Para corregir los datos de 19 F, primero adquiera un mapa de ángulo de volteo de una H con el método de dos ángulos de volteo.Utilice un escaneo de eco de gradiente con un TR muy largo que sea más de tres veces mayor que uno HT con un ángulo de giro estimado de poco menos de 90 grados cerca de la bobina. A continuación, adquiera un segundo escaneo de eco de gradiente con el doble del ángulo de giro del primer escaneo. Calcule el ángulo de giro alfa de una H en vle X, Y, Z a través de la señal y los sentidos del primer y segundo escaneo ECHO de gradiente.El ángulo de giro de 19 F será idéntico, excepto por el factor uno, C, debido a los perfiles B uno proporcionales, la atenuación de la intensidad de la señal de 19 F de una secuencia de eco de espín con excitación, ángulo de volteo alfa, reenfoque alfa, ángulo de volteo dos alfa durante la recepción de la señal se ve en la pantalla aquí. Aquí se observa la atenuación debida a la excitación imperfecta. A continuación, se puede calcular la atenuación general.Tenga en cuenta que se normaliza a uno en el caso de 90 grados, excitación de 180 grados, ángulo de giro de reenfoque, el B uno corregido, 19 F corregidas, las intensidades de señal de imagen SI 19 F corregidas se calculan a través de esta fórmula para crear imágenes superpuestas de una H y 19 F. Exporte los datos de la imagen y abra los archivos en un programa de procesamiento de imágenes como la imagen J, aplique los ajustes de imagen según sea necesario, asegurándose de mantener los ajustes iguales para todas las imágenes. A continuación, renderice las imágenes 19 F en color falso y luego superpóngalas sobre las imágenes H correspondientes.Para localizar la señal, seleccione la imagen de magnitud 19 F con las celdas relevantes y el ROI visible de referencia sobre las celdas relevantes, la referencia y una región fuera del sujeto para el valor de ruido como se muestra en la muestra. Tenga en cuenta que aquí se muestra el escaneo anatómico de una H para mayor claridad. La proporcionalidad simple y el valor de 19 F por celda se pueden usar para estimar el número de celdas en el ROI.Estas imágenes son de los resultados típicos de un protocolo que implica la transferencia de células marcadas con 19 F a un ganglio linfático de drenaje. Aquí vemos un espectro de 19 FNMR de 1 millón de células marcadas utilizando una referencia TFA A, y aquí vemos una imagen procesada representativa para las imágenes in vivo. Entre las patas del ratón se colocó una referencia que consistía en un recipiente sellado de la misma etiqueta utilizada para las celdas.Al aplicar el protocolo descrito, calculamos un número de celda de aproximadamente 1,2 millones basado en la imagen bruta de magnitud 19 F. La imagen de 19 F se superpone en color falso sobre la imagen anatómica de protones en escala de grises. Al configurar un nuevo experimento, es importante validar el flúor.Resultados de resonancia magnética con histología, imágenes ópticas u otros métodos. Por ejemplo, es importante tener en cuenta que la etiqueta de flúor puede permanecer en el tejido cuando las células mueren y dar lugar a una señal de falso positivo.

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