Name: Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende el trasplante subretinal de precursores de fotorreceptores en ratones adultos mediante MACS con CD73. Este método permite analizar la integración celular por microscopía de inmunofluorescencia para investigar la regeneración retiniana.

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Nos gusta agradecer a Anand Swaroop por proporcionar ratones Nrl-GFP, Jochen Haas por soporte técnico y Sindy Böhme y Emely Lessmann por la cría de animales.	
	Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, el CRTD Seed Grant Program, el SFB 655 y el ProRetina e.V. fundación, el DIGS-BB Graduate Program Dresden, y la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Declaración de uso ético y cuidado de los animales:
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las leyes de la Unión Europea y Alemania (Tierschutzgesetz) y se adhirieron a la Declaración arvo para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la TU Dresden y la Landesdirektion Dresden (número de aprobación: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Antes de iniciar la disociación de celdas y la clasificación de celdas
<ol><li>Etiquete tres tubos de reacción de 15 ml con: Lavado (W), Fracción positiva (+) y Fracción negativa (-).</li>
</ol>2. Disociación de la retina
<ol><li>Decapitar los cachorros PN 4 usando una tijera.</li>
	<li>Enjuague la cabeza de las crías en breve en etanol al 70% seguido de lavado en PBS.</li>
	<li>Transfiera la cabeza a HBSS frío y enuclee el ojo (repita este paso para todas las cabezas). Para enuclear, abra los párpados y fije el ojo con fórceps curvos en la región del nervio óptico. A continuación, tire del ojo con cuidado fuera de la órbita.</li>
	<li>Después de enucleating todos los ojos, aislar la retina: introducir una tijera cerrada en el nervio óptico y abrir las cuchillas. Peal el RPE/chorid hacia fuera. Retire las lentes y los vasos sanguíneos con fórceps curvos.</li>
	<li>Transfiera las retinas aisladas a un tubo de reacción de 1,5 ml que contenga la solución de papaína (proporcionada por el kit de disociación de papaína).</li>
	<li>Incubar las retinas en la solución de papaína durante 30-60 min en un baño de agua o agitadora (400 rpm) a 37 °C.<ol>
<li>Mientras las retinas se incuban en la solución de papaína, pipetear 1 ml de solución ovomucoide a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "1").</li>
			<li>Añadir 60 μl de DNasa I (10 mg/ml) + 60 μl de solución ovomucoide (proporcionada por el kit) + 520 μl de EBSS a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "2").</li>
		</ol>
</li>
	<li>Después de la incubación de la papaína, transferir la solución de papaína que contiene las retinas parcialmente digeridas al tubo de reacción "2".</li>
	<li>Utilizando una pipeta pulida contra fuego, realizar la disociación mecánica (10x arriba y abajo).</li>
	<li>Pipetear la suspensión unicelular al tubo de reacción "1". Trate de generar 2 capas colocando suavemente la suspensión celular en la parte superior de la solución ovomucoide.</li>
	<li>Centrífuga durante 5 min a 300 x g (aproximadamente 1.300 rpm).</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspend las células en 500 μl de buffer MACS.</li>
</ol>3. Clasificación de celdas mediante clasificación de celdas asociadas magnéticas (MACS)
<ol><li>Añadir X μl de anticuerpo anti-CD73 de rata a los 500 μl para lograr una concentración final de 10 μg/ml.</li>
	<li>Incubar 5 min sobre hielo.</li>
	<li>Llene el tubo de reacción de 15 ml a 10 ml con tampón MACS y centrífugalo durante 5 min a una velocidad de 300 x g.</li>
	<li>Retire el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 480 μl macs buffer y añadir 120 μl de cabra anti-rata IgG microperlas.</li>
	<li>Incubar 15 min sobre hielo; no agitarlo, agitarlo ni mezclarlo.</li>
	<li>Llene el tubo de reacción de 15 ml a 5 ml con tampón MACS y centrífugalo durante 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Como el tubo de reacción se centrifuga:<ol>
<li>Ajuste una columna LS en el soporte magnético.</li>
			<li>Coloque el filtro de preseparación encima de la columna LS.</li>
			<li>Hidrate el filtro de preseparación y la columna LS con tampón MACS de 3 ml y recoja el tampón MACS en el tubo de lavado (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Retire el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 500 μl macs tampón.</li>
	<li>Cargue la suspensión de celda de 500 μl en el filtro, luego agregue un tampón MACS de 1 ml al filtro y recoja la fracción negativa en el tubo de reacción de fracción negativa (-).</li>
	<li>A continuación, agregue 3 x 3 ml de búfer MACS a la columna para lavar las celdas que no están unidas a la columna</li>
	<li>Una vez que estos 9 ml estén a través de la Columna LS, retire la columna del soporte magnético e instálela encima del tubo de reacción de fracción positiva (+).</li>
	<li>Cargue rápidamente 5 ml de búfer MACS en la columna LS y coloque el émbolo en la columna LS y presione hacia abajo hasta que todo el búfer esté a través de la columna.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de reacción que contiene la fracción positiva durante 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, resuspend en 500 μl de tampón MACS y manténgalo a 4 °C.</li>
	<li>Cuente la cantidad total de celdas que utilizan un dispositivo de recuento de celdas común.</li>
	<li>Preparar una suspensión celular a partir de la fracción clasificada positiva que contenga 2 x 105 células/μl en tampón MACS y conservarla a 4 °C</li>
</ol>4. Trasplante de células precursoras de fotorreceptores clasificadas por MAC en la retina del ratón
<ol><li>Asegúrese de tener todas las siguientes soluciones listas: 1 ml de PBS estéril o HBSS, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml de H2O desionizado estéril, alícuotas de las fracciones de suspensión celular a 4 °C.</li>
	<li>Anestesiar el ratón adulto(es decir, 2-4 meses de edad) con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), ketamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Luego haga una inyección subcutánea de buprenorfina (0.05 mg/kg de peso corporal) para aliviar el dolor.</li>
	<li>Dilatar las pupilas con una gota de Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5%.</li>
	<li>Fije el ratón en el soporte de la cabeza del ratón y colótelo bajo microscopio estéreo.</li>
	<li>Aplique una gota de gel visídico para evitar el secado del ojo.</li>
	<li>Hacer un pequeño agujero en el borde entre esclerótica y córnea (respectivamente ora serrata)usando un estéril 30 G 1/2 en aguja.</li>
	<li>Corte un portaobjetos de cubierta común en piezas pequeñas (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando una pluma de diamante, coloque una de estas piezas en la parte superior de la córnea, permitiendo la visualización directa de la retina.</li>
	<li>Enjuague la jeringa de microlitro presterilizada varias veces con agua desionizada.</li>
	<li>Cargue la jeringa de microlitro con 1 μl de suspensión celular, dirija la aguja tangencialmente a través de la conjuntiva y la esclerótica y colóquela bajo control visual en la mitad nasal de la retina.</li>
	<li>Perforar suavemente un agujero en la retina hasta llegar al espacio subretinal, inyectar la suspensión celular en el espacio subretinal.</li>
	<li>Observe el desprendimiento bullar de retina, que debe ser uniforme, cubriendo aproximadamente 1/4 del espacio retiniano sin ningún sangrado.</li>
	<li>Retire la jeringa suavemente, el agujero de la retina se sella automáticamente.</li>
	<li>Enjuague la jeringa del microlitro varias veces con agua desionizada.</li>
	<li>Suelte el ratón del soporte de la cabeza.</li>
	<li>Despertar el ratón mediante la inyección de clorhidrato de atipamozol para la reversión del efecto de clorhidrato de medetomidina.</li>
	<li>Coloque el ratón para la hora de despertar en una cámara oscura cálida (aproximadamente 25 °C).</li>
	<li>Los próximos 2 días después del trasplante, la buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) debe administrarse mediante inyección subcutánea por la mañana y por la tarde para aliviar el dolor.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

El trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores representa una herramienta confiable para lograr la integración de estas células sensibles a la luz en las retinas del huésped en números significativos1,2. Esto podría permitir el establecimiento de una terapia celular para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en el futuro6. La población donante de células, actualmente aislada de las retinas PN 4, es una mezcla de diferentes tipos de células, de las que sólo las células precursora...

La visión es uno de los principales sentidos de los seres humanos. El deterioro de este sentido y la ceguera son una de las principales razones de la discapacidad en los países industrializados. La causa predominante para la debilitación de la visión o la ceguera es la degeneración retiniana, caracterizada por la pérdida de la célula del fotorreceptor, pues puede ser observada en la degeneración macular, el pigmentosa de la retinitis, la distrofia de la cono-barra, y otras condiciones. Hasta la fecha, una terapia eficaz para restaurar la visión perdida no está disponible. En 2006 y 2008 dos laboratorios diferentes reportaron, independientes entre sí, un trasplante exitoso de células precursoras de fotorreceptores de varilla en retinas adultas de ratones de tipo salvaje1,2. Así, surge la posibilidad de trasplante de células precursoras de fotorreceptores también en una retina degenerada, para reemplazar los fotorreceptores degenerados y restaurar la visión. De hecho, se ha demostrado recientemente, que tales células precursoras de fotorreceptores trasplantados provocan criterios morfológicos de fotorreceptores maduros de tipo salvaje, como segmentos externos correctamente desarrollados3,terminales sinápticos en estrecha proximidad a las células bipolares endógenas y un cuerpo de células redondas situado en la capa nuclear externa2-4,así como la capacidad de integrarse funcionalmente en los circuitos neuronales del huésped5-7. Uno de los principios fundamentales de esta estrategia es el uso de retinas de ratones jóvenes postnatales de día 4 (PN 4, PN0 se define como día de nacimiento), lo que resulta en una mezcla de diferentes tipos de células para trasplante. En el fondo de una futura aplicación terapéutica, esta mezcla tiene que ser purificada para las células precursoras de fotorreceptores. CD73 se ha descrito como el primer marcador de superficie celular específico para fotorreceptores jóvenes en la retina8-10. Aquí, se demuestra un método de purificación de células precursoras de fotorreceptores basado en este marcador de superficie celular y con el uso de la técnica de clasificación de células asociadas magnéticamente (MACS). Macs podría tener ventajas en comparación con las técnicas de clasificación de células activadas por fluorescentes, debido a los tiempos de clasificación rápidos y el ajuste más fácil a las condiciones GMP. Podríamos demostrar un enriquecimiento del ~90% y un índice más alto de la integración del hasta 3 dobleces al trasplantar la población enriquecida al espacio subretinal en el salvaje-tipo adulto retinas. Así, el enriquecimiento macs-basado de la célula del precursor del fotorreceptor y el trasplante subretinal, son técnicas confiables y prometedoras para el desarrollo de una estrategia terapéutica regenerativa para el tratamiento de la degeneración retiniana.

<table><tbody><tr><td>Sistema de disociación de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>suministrada La DNasa I no se utiliza en el método</td></tr><tr><td>Anti-ratón purificado CD73, clon TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>Concentración de existencias 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rata IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>Volumen total de 2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Se utiliza para contar el número total de células</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>Se utiliza para la disociación de las retinas</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>Se utiliza para contar el número total de células</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina 2.5%-Tropicamid 0.5%</td><td>Clínicas Universitarias Dresden Farmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de preseparación</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio pulido al fuego Pipeta Pasteur</td><td>Marca</td><td>74777 20</td><td>La pipeta' Las puntas deben pulirse al fuego y esterilizarse en autoclave.</td></tr><tr><td>Gradilla de tubos MACS de 15 ml</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento de células</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td> Se puede utilizar <td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>en lugar de Olympus SZX10</td></tr><tr>Se puede utilizar<td>Olympus SZX10</td><td>en</td><td></td><td>lugar de Leica M651 MSD</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico invertido Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo de reacción</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tubo de reacción</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para cabeza de ratón</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 en</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton jeringa de microlitros 5 &micro; l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>entregado sin agujas</td></tr><tr><td>Hamilton RN aguja especial 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>romo, 12 mm</td></tr><tr><td>de longitud Vannas-T&uuml; Tijeras de resorte bingen - 5 mm Hojas rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7 - Titanio Biologie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de diamante</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm Cubreobjetos</td><td>Sparks</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

trasplante subretinal de macs purificado fotorreceptores precursores de células en la retina del ratón adulto

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

La deficiencia visual y la ceguera debidas a la pérdida de las células sensoras de luz de la retina, es decir, los fotorreceptores, representan la principal razón de discapacidad en los países industrializados. El reemplazo de fotorreceptores degenerados por el trasplante de la célula representa una opción posible del tratamiento en usos clínicos futuros. De hecho, los estudios preclínicos recientes demostraron que los fotorreceptores inmaduros, aislados de la retina neonatal del ratón en el día postnatal 4, tienen el potencial de integrarse en la retina adulta del ratón después del trasplante subretinal. Las células dispensadoras de aceite generaron una morfología madura del fotorreceptor incluyendo segmentos internos y externos, un cuerpo de la célula redonda situado en la capa nuclear externa, y terminales sinápticos en gran proximidad a las células bipolares endógenas. De hecho, informes recientes demostraron que los fotorreceptores donantes se integran funcionalmente en los circuitos neuronales de los ratones huésped. Para un uso clínico futuro de tal acercamiento del reemplazo de la célula, las suspensiones purificadas de las células de la opción tienen que ser generadas y ser colocadas en la posición correcta para la integración apropiada en el ojo. Para el enriquecimiento de los precursores de fotorreceptores, la clasificación debe basarse en antígenos específicos de la superficie celular para evitar la modificación genética de las células donantes. Aquí mostramos la clasificación de células asociadas magnéticas (MACS) - enriquecimiento de precursores de fotorreceptores de varilla trasplantables aislados de la retina neonatal de ratones reporteros específicos de fotorreceptores basados en el marcador de superficie celular CD73. La incubación con los anticuerpos anti-CD73 seguidos por los anticuerpos secundarios conjugados micro-grano permitió el enriquecimiento de los precursores del fotorreceptor de la barra por los MACS al aproximadamente 90%. En comparación con la citometría de flujo, macs tiene la ventaja de que puede ser más fácil de aplicar a los estándares GMP y que altas cantidades de células se pueden clasificar en períodos de tiempo relativamente cortos. La inyección de suspensiones de células enriquecidas en el espacio subretinal de ratones adultos de tipo salvaje resultó en una tasa de integración 3 veces mayor en comparación con las suspensiones celulares no clasificadas.

Con el fin de evaluar la capacidad de los fotorreceptores de varilla para integrarse en la retina del ratón, se utilizó una línea de reportero de ratón, en la que la GFP es impulsada por el promotor de la cremallera de leucina de la retina neural (Nrl, Nrl-GFP)11. Nrl es el marcador más temprano de fotorreceptores de varilla que comienza su expresión en E12.5 a lo largo de la edad adulta, lo que permite un etiquetado específico de las células fotorreceptoras de varilla donante.
Los ...

El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.

Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en trasplantar células precursoras de fotorreceptores enriquecidas a la retina de un ratón receptor. Esto se logra primero aislado el ojo con retina de animales donantes jóvenes. En un segundo paso, las células precursoras de fotorreceptores posnatales se aíslan de la población celular retiniana mediante clasificación magnética de células asociada a CD73.A continuación, los precursores de fotorreceptores se trasplantan al espacio subretiniano de animales receptores para facilitar su integración en la retina receptora. En última instancia, el potencial de integración y el comportamiento de las células precursoras de fotorreceptores trasplantadas pueden analizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración retiniana, como cuál es la capacidad de los fotorreceptores trasplantados para integrarse en la circuitería neural del huésped y restaurar la visión.Las implicaciones de esta técnica van más allá del tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina. Una vez que la instalación y el enriquecimiento de precursores fotorreceptores mediante max se puedan adaptar fácilmente a condiciones GMP, la demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de trasplante son difíciles de aprender y el manejo sutil y la colocación de la aguja en el espacio subretiniano son cruciales para garantizar el máximo éxito y la reproducibilidad. Para disociar las retinas, comience por enjuagar brevemente las cabezas de crías de día postnatal cuatro en etanol al 70 %, seguido de un lavado con PBS.Luego, transfiera las cabezas a HBSS frío para aislar los ojos individualmente. Primero, abra el párpado. A continuación, utilizando un par de pinzas curvas.Sujete el órgano en la región del nervio óptico y extraiga cuidadosamente el ojo de la órbita. A continuación, para aislar la retina, introduzca la punta de un par de tijeras cerradas en el nervio óptico y abra las hojas. Retire la capa del epitelio pigmentario de la retina y la coroides, y utilice pinzas curvas para eliminar el cristalino y los vasos sanguíneos.Incube las retinas aisladas en un tubo de reacción de 1,5 mililitros que contenga solución de papaina durante 30 a 60 minutos en un agitador a 400 RPM y 37 grados Celsius. Mientras las retinas están en incubación, distribuya un mililitro de solución OVO moid en un tubo de reacción de 15 mililitros, etiquetado como uno, y luego transfiera a un tubo de reacción de 2 mililitros etiquetado como dos: 60 microlitros de ADN uno, 60 microlitros de solución OVO MOID y 520 microlitros de EBSS. Después de la incubación, transfiera la solución de papaina que contiene las retinas parcialmente digeridas al tubo de reacción dos y luego pase las retinas 10 veces a través de una pipeta con punta flameada.Coloque suavemente la suspensión de células individuales encima de la solución OVO MOID en el tubo de reacción uno y centrifugue la solución celular durante cinco minutos a 300 Gs y temperatura ambiente. Luego deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 500 microlitros de tampón max. Para ordenar por max, incube primero las células en 10 microgramos por mililitro de anticuerpo rat anti CD 73 en hielo.Después de cinco minutos, lave las células con 10 mililitros de tampón max. A continuación, re suspenda el precipitado en 480 microlitros de tampón max e incube las células con 120 microlitros de microesferas de IgG anti-RET go en hielo sin agitación, agitado ni mezcla. Después de 15 minutos, lave las células con cinco mililitros de tampón max; durante el lavado, coloque una columna LS sobre un imán max y coloque un filtro de separación previo encima de la columna.A continuación, hidrate el filtro y la columna con tres mililitros de tampón max. Recoja el tampón en un tubo de 15 mililitros etiquetado con W para lavado. Cuando las células hayan terminado de centrifugarse, re suspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón max y cargue las células en el filtro.Añada un mililitro de tampón máx. encima de las células y luego recoja la fracción negativa en un tubo de reacción de 15 mililitros etiquetado con menos para negativo. A continuación, añada tres mililitros de tampón máx. a la columna tres veces para lavarla. Ahora retire la columna del soporte magnético.Instálelo encima de un tubo de reacción de 15 mililitros etiquetado como más para positivo. Y cargue rápidamente cinco mililitros de tampón max en la columna. Pase todo el tampón a través de la columna y, después de centrifugar la fracción positiva, re suspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón max.Coloque las células a cuatro grados Celsius y cuéntelas. Luego ajuste la concentración a dos veces 10 a la quinta células por microlitro en tampón max, manteniendo las células a cuatro grados Celsius para el trasplante de las células precursoras de fotorreceptores aisladas. Dilate las pupilas de un ratón adulto sedado con una gota de fenil efedrina tópica mientras las pupilas se dilatan. Use un lápiz de diamante para cortar una lámina de cubierta en trozos de aproximadamente cinco por cinco milímetros.Coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico, sujete al animal en un soporte para cabeza de ratón y luego aplique una gota de gel ICIC en cada ojo para evitar que se sequen. Ahora use una aguja de calibre 30 y media pulgada para hacer un pequeño orificio en el borde entre la esclerótica y la córnea. Luego coloque uno de los trozos de cubreobjetos de cinco por cinco milímetros encima de la córnea, lo que permite la visualización directa de la retina.A continuación, enjuague varias veces una jeringa microlitro previamente esterilizada con agua desionizada estéril y luego cargue la jeringa con una de las suspensiones celulares clasificadas. Dirija la aguja diagonalmente a través de la conjuntiva y la esclerótica, colocándola en la mitad nasal de la retina. Luego, perfore suavemente un orificio a través de la retina hasta el espacio subretiniano e inyecte las células.Confirme la desinserción ampollosa y uniforme de la retina, que debería cubrir aproximadamente un cuarto del espacio retiniano sin presencia de sangrado. Luego, retire suavemente la jeringa y enjuáguela varias veces más con agua ionizada. Finalmente, suelte al ratón del sujetador.Inyecte al animal con clorhidrato de aamaz para revertir los efectos de la anestesia y permita que se recupere en una cámara oscura a 25 grados Celsius con el fin de evaluar la capacidad de los fotorreceptores en bastón para integrarse en la retina del ratón. Se utilizó una línea de ratón reportera en la cual la GFP está controlada por el promotor del gen perdedor del cierre de la retina neural o promotor NRL, como se muestra en estos histogramas. La suspensión inicial de células retinianas contenía un 30,4 % de fotorreceptores en bastón positivos para GFP.Tras la clasificación y el enriquecimiento basados en CD73, se observó un máximo del 86,9 % de células precursoras de fotorreceptores positivas para GFP en la fracción positiva para CD73, mientras que en la fracción negativa para CD73 solo el 9,9 % de las células fueron positivas para GFP. También se observa el enriquecimiento de células positivas para N-R-L-G-F-P tras la separación máxima basada en CD73.Después de sembrar in vitro, las células donantes permanecen en el sitio de inyección tal como lo define la retina huésped separada en forma de ampolla e integran la capa nuclear externa de la retina huésped, adquiriendo la morfología de fotorreceptores maduros. Una vez que se puede realizar la clasificación magnética asociada de células maestras, el procedimiento puede completarse en menos de dos horas si se realiza correctamente. Este procedimiento también puede adaptarse para el enriquecimiento de fotorreceptores derivados de células madre o incluso de otras células madre retinianas.Dada la disponibilidad de anticuerpos específicos para responder preguntas adicionales con respecto a la restauración o rescate mediante la transmutación celular en la retina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el trasplante de células precursoras de fotorreceptores enriquecidas fotoquímicamente al espacio subretiniano de ratones receptores.

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