Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino
7 de diciembre de 2013
Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.
El objetivo general de este procedimiento es caracterizar y cuantificar las lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico IM. Esto se logra diseccionando primero un corazón extraído para separar la porción apical y localizar el seno aórtico. A continuación, se preparan bloques de parafina con la porción apical procesada del corazón.
A continuación, se secciona el seno aórtico y se monta en portaobjetos. Finalmente, se tiñen las secciones de tejido. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran diferentes tamaños y composiciones de lesiones ateroscleróticas mediante análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos.
El encargado de demostrar el procedimiento será Daniel Venga penal, un estudiante graduado de mi laboratorio. La Junta de Ética de Investigación Animal de la Universidad McMaster ha aprobado previamente todos los procedimientos descritos en este documento: después de anestesiar a un ratón LDLR doble negativo y extraer la sangre, sacrificarlo y fijarlo antes de aislar el corazón de acuerdo con el protocolo de texto, use un bisturí para hacer un corte transversal en el corazón perpendicular a la aorta ascendente. Coloque la porción apical o superior del corazón en un casete de inclusión y sumérjalo en Formin.
A continuación, coloque el casete en un procesador de pañuelos y procese durante la noche. Usando el programa descrito en el protocolo de texto para la histología, los moldes derriten la cera de parafina durante la noche a 62 grados centígrados. Coloque cada tejido de proceso en un molde de histología profunda, asegurándose de que la interfaz del corazón toque la base del molde, y luego vierta cera de parafina derretida para llenar completamente el molde.
Use un casete de plástico etiquetado para cubrir el molde. Después de enfriar los moldes sobre hielo o una superficie fría, separe el bloque del molde para seccionar la aorta. Coloque el bloque en el portamuestras del micrótomo de manera que pueda seccionarse desde el interior hacia la parte superior del corazón.
Ajuste el micrótomo a 10 micras y corte el corazón. Recoja secciones en un portaobjetos de vidrio y examínelas bajo un microscopio óptico para determinar la posición y la orientación. El seno debe aparecer como tres bases valvulares bipartitas con valvas adjuntas.
Cuando una o dos válvulas del seno aórtico se hagan evidentes, ajuste el ángulo del bloqueo según sea necesario. Cuando se alcancen las válvulas, ajuste el micrótomo para cortarlo de cuatro a cinco micras. Montando las primeras 10 secciones, cada una en la parte superior de los portaobjetos de vidrio individuales, y luego montando cada grupo subsiguiente de 10 secciones en la siguiente posición.
En las diapositivas. Continúe recolectando secciones hasta que no se observe ninguna lesión aterosclerótica. Para teñir secciones con hematina y eoína para visualizar las lesiones, coloque los portaobjetos en un secador de aire durante ocho minutos.
A continuación, despare las secciones utilizando xileno para lavarlas cuatro veces durante tres minutos cada una. Lave los portaobjetos en etanol al 100% tres veces durante tres minutos cada uno. Luego 70%etanol y 50%etanol.
Tres veces durante tres minutos cada una. Use agua destilada para enjuagar los portaobjetos y luego sumérjalos en ellos. Hematina de MA durante 15 minutos.
Lavar y correr. Agua del grifo durante cinco minutos. A continuación, lavar y destilar agua durante cinco minutos después de sumergirla en eoína Y durante uno a cinco minutos.
Lave y destile el agua tres veces durante cinco minutos cada una. 50%etanol dos veces durante dos minutos cada una. Luego 70%etanol tres veces durante dos minutos cada lavado, y 100%etanol.
Tres veces durante dos minutos cada una. A continuación, lave y lave el xileno cuatro veces durante dos minutos cada uno. Utilice un medio de montaje a base de xileno para montar las secciones y capturar imágenes bajo un microscopio óptico.
Utilice software de diagnóstico por imágenes para identificar y cuantificar lesiones, que se pueden determinar a distancias específicas del seno aórtico a intervalos de 40 a 50 micras, dependiendo del grosor de las secciones, consulte el protocolo de texto para tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. LDLR de cinco semanas de edad. Los ratones positivos fueron alimentados con una dieta estándar o una dieta alta en grasas durante 10 semanas antes de que sus corazones fueran fijados, aislados y seccionados, como se muestra aquí.
Cuando los ratones son alimentados con una dieta estándar de comida, el desarrollo aterosclerótico es muy limitado y puede no ser detectable a las 15 semanas de ocho. Una dieta alta en grasas acelera significativamente la aterogénesis en este modelo e induce la formación de grandes lesiones avanzadas que contienen núcleos acelulares crónicos y casquetes fibrosos. Las lesiones ateroscleróticas se pueden caracterizar aún más mediante tinción para detectar la presencia de tipos de células específicos y factores que definen las etapas del desarrollo de la lesión.
La infiltración de monocitos en la íntima representa uno de los primeros eventos de la aterogénesis íntima. Los monocitos se diferencian en macrófagos que engullen los desechos celulares y los lípidos. Los macrófagos hinchados de lípidos, conocidos como células espumosas, crean una veta de grasa en la pared de la arteria que se ve aquí.
Las células espumosas de macrófagos se pueden detectar en todas las etapas del desarrollo de la lesión mediante la tinción con anticuerpos contra marcadores específicos de macrófagos como F four 80 y MAC three. Las células del músculo liso vascular o v SMC están confinadas a la capa medial de una arteria sana. Las VSC son inducidas a migrar y proliferar en la íntima durante el desarrollo de una lesión avanzada.
Como se puede observar en este panel, las V SMCs pueden ser identificadas mediante la tinción con un anticuerpo contra la alfa actina después de su desarrollo. Esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades cardiovasculares exploraran el desarrollo y la progresión de las lesiones ateroscleróticas en los bastones.
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Descripción general
Este artículo describe procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón. Los métodos implican el corte preciso del seno aórtico y de la aorta ascendente, seguido de análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología cardiovascular
- Histología
Antecedentes
- La aterosclerosis es una enfermedad cardiovascular importante.
- Los modelos de ratón se utilizan comúnmente para estudiar las lesiones ateroscleróticas.
- Las técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas son esenciales para el análisis.
- Comprender las características de las lesiones puede contribuir al desarrollo de terapias.
Objetivo del estudio
- Caracterizar lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico.
- Cuantificar el tamaño y la composición de las lesiones.
- Utilizar técnicas histológicas avanzadas para un análisis detallado.
Métodos Utilizados
- Disecar el corazón extraído para localizar el seno aórtico.
- Preparar bloques de parafina a partir del corazón procesado.
- Seccionar el seno aórtico y montar las secciones sobre portaobjetos.
- Tinción de las secciones de tejido para su análisis.
Resultados principales
- Se identificaron diferentes tamaños de lesiones ateroscleróticas.
- Se observaron variaciones en la composición de las lesiones mediante tinción.
- El análisis histoquímico e inmunohistoquímico proporcionó información detallada.
- Los resultados pueden orientar investigaciones futuras sobre la aterosclerosis.
Conclusiones
- Los métodos descritos son efectivos para estudiar lesiones ateroscleróticas.
- La caracterización de las lesiones puede mejorar la comprensión de las enfermedades cardiovasculares.
- Estas técnicas pueden aplicarse a otros modelos de investigación cardiovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo de lesiones en modelos de seno aórtico murino permite una evaluación rigurosa de la progresión de la aterosclerosis y del impacto terapéutico en las fases iniciales de descubrimiento y preclínicas. La medición precisa del área y volumen de la lesión, combinada con la caracterización celular, respalda la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas para carteras de fármacos cardiovasculares. Este flujo de trabajo sustenta la continuidad traslacional desde la biología del descubrimiento hasta la evaluación de modelos preclínicos en la investigación de la aterosclerosis.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite pruebas cuantitativas de hipótesis sobre los factores moleculares implicados en modelos de aterosclerosis.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la correlación de características de las lesiones con intervenciones genéticas o dietéticas.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante el perfilado celular y composicional de las lesiones.
- Proporciona datos sólidos para la selección de carteras y decisiones tempranas de avance/no avance.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece puntos finales histológicos estandarizados y reproducibles para la selección de compuestos.
- Proporciona métricas cuantitativas de lesiones adecuadas para comparaciones entre grupos.
- Permite la evaluación escalable de la eficacia de intervenciones en sistemas murinos validados.
- Apoya la preparación del ensayo para selecciones mecanicistas o fenotípicas posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Correlaciona los fenotipos de lesiones en modelos murinos con características relevantes para enfermedades humanas, facilitando el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la cuantificación consistente de lesiones.
- Proporciona datos cuantitativos y celulares sobre lesiones que informan decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Ofrece conocimientos mecanicistas para apoyar la desviación predictiva de riesgos en líneas de desarrollo cardiovascular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de análisis cuantitativo de lesiones se integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica en las líneas de investigación cardiovascular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar la respuesta de las lesiones a la modulación genética o dietética.
- Selección: Proporciona puntos finales cuantitativos y reproducibles para evaluar intervenciones candidatas.
- Análisis: Permite la comparación estadística del área, volumen y composición celular de las lesiones entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos en modelos murinos con las características de la enfermedad humana mediante el análisis celular y composicional de las lesiones.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado y adaptable para diversos modelos de aterosclerosis y estudios de intervención.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas en aterosclerosis.
- Valor operativo: Proporciona una cuantificación estandarizada, reproducible y escalable de lesiones entre estudios.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al ofrecer datos preclínicos robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos cardiovasculares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección cardiovascular de roedores y procesamiento histológico.
- Exige acceso a infraestructura de microtomía, tinción e imagen para corte y análisis reproducibles.
- Necesita estandarización entre equipos en los ángulos de corte y los puntos anatómicos de referencia para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a diversos modelos de aterosclerosis inducida por dieta o de origen genético, con modificaciones del protocolo.
- Depende de la identificación y cuantificación cuidadosa de las lesiones para asegurar la integridad de los datos.
