Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema de cultivo que recapitule de cerca el microambiente celular e intracelular de la médula ósea humana. En primer lugar, la superficie de un pocillo de cultivo de tejidos se recubre con la matriz industrial. Luego, las células mononucleares de la médula ósea u otras células de interés se mezclan con la matriz de la médula ósea.

Posteriormente, se retira la matriz industrial y se añade al pocillo la mezcla de la matriz celular. Una vez que la matriz se ha gelificado, se superpone con medio de crecimiento. En última instancia, las células se pueden visualizar directamente en la matriz o se pueden aislar para análisis posteriores en comparación con los métodos existentes para cultivar células.

Por ejemplo, los métodos estándar de cultivo de tejidos o los modelos de cocultivo en los que las células se cultivan en plástico. El principal beneficio de usar un método de cultivo 3D es que las células crecen dentro del microambiente fisiológico y, por lo tanto, le permite estudiar las células dentro de las condiciones nativas del tejido. Prepare una placa de 48 pocillos en la que se colocarán las celdas.

Al agregar primero 65 microlitros de solución de recubrimiento industrial en cada uno, distribuya bien la solución de manera uniforme para cubrir toda la superficie del pozo. Este método también es escalable a otras superficies. Deje que las placas se incuben a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.

Mientras tanto, prepare la suspensión celular de 50, 000 células por microlitro de PBS. Prepare lo suficiente para agregar 10 microlitros a cada pocillo y luego en un tubo de einor, mezcle la suspensión celular con 100 microlitros de matriz ósea reconstruida por per. Mezclar bien suavemente y evitar introducir burbujas.

Mantenga la mezcla en hielo para que la matriz no se gelifique cuando el plato haya terminado. Incubación, retire todo el líquido y dote la solución de recubrimiento por aspiración. Luego agregue 100 microlitros de suspensión celular bien mezclada con matriz a cada uno.

Bueno, incline rápidamente la placa con una pipeta para cubrir toda la superficie del pozo de manera uniforme. Siga mezclando la suspensión entre los rellenos de los pocillos, ya que las celdas se agruparán una vez que estén completamente cargadas. Incubar la placa durante 30 a 60 minutos sin agitar hasta que la matriz se solidifique.

A continuación, precaliente el medio de crecimiento de la médula ósea en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos de incubación, verifique que la matriz se haya fraguado correctamente. Una buena matriz forma una capa suave similar a un gel que no se mueve cuando se inclina la placa.

Cuando la matriz esté lista, superpóngala suavemente con un mililitro de medio gota a gota con una pipeta serológica. A continuación, devuelva el cultivo de matriz ósea reconstruido ensamblado a la incubadora durante un máximo de 30 días sin cambios en el medio. Si se requiere un cambio de medio, cambie solo la mitad del medio a la vez.

Retire el medio suavemente sin alterar la capa de la matriz. Incline la placa y drene el medio suavemente con una pipeta. No aspire el medio sobre la matriz más tarde.

Al teñir las células. Utilice esta técnica para los cambios de solución. Para eliminar los medios de los pozos de un cultivo 3D, es muy importante que se eliminen del lado del pozo.

De lo contrario, la matriz se alterará y las células podrían perderse si se mantiene la misma técnica. Lave las células dos veces con un XPBS estéril. Luego agregue medio mililitro de solución de recuperación de celdas heladas a cada uno.

Bueno, retire toda la capa de la matriz junto con las células pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo. Para cada uno, transfiera la colección a un tubo de microcentrífuga y colóquelo en hielo. Luego agregue medio mililitro adicional de solución de recuperación al mismo pozo y recoja todo el material restante.

Transporta todas las colecciones e incubalas durante una hora en hielo. Durante la hora, agite los tubos cada 15 minutos para facilitar la liberación celular de la matriz. Después de una hora, revise la mezcla en busca de grumos visibles de matriz.

No debe haber ninguno, pero si lo hay, transfiera la mezcla a un tubo más grande y agregue de dos a cinco mililitros adicionales de solución de recuperación de células. Luego incube las células durante otros 30 a 60 minutos. Vórtice periódicamente y vuelva a comprobar la ausencia de grupos de matriz.

Cuando la matriz ya no está agrupada. Centrifugar la mezcla a 1000 RPM durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en un mililitro de XPBS frío.

Repita la centrifugación. Reemplace el sobrenadante con PBS fresco y repita el lavado. Una tercera vez.

Después del tercer lavado de PBS, recupere las células en la solución adecuada para el siguiente procedimiento. Las células de la médula ósea se cultivaron en una matriz ósea reconstruida durante 30 días y se obtuvieron imágenes periódicas mediante microscopía óptica con un aumento de 200 veces. Los elementos estromales se detectaron por primera vez el quinto día, pero eran claramente evidentes el día 14.

En el transcurso del período de cultivo, las células migraron a través de la matriz y se agregaron en grupos distintos. Las masas de células malignas se expandieron con el tiempo para evaluar la composición de los componentes estromales que crecen en la RBM. Se evaluó la morfología de las células en la transición entre el RBM y el recubrimiento industrial.

Las células se tiñeron para fibronectina, actina y núcleos. Se demostró que las células de visualización con morfología estromal eran preosteoblastos con altos niveles de actividad de fosfatasa alcalina. Eran capaces de mineralizar el calcio según lo determinado por la tinción con rojo zarin, las células con presencia visible de gotas de lípidos se identificaron como adipocitos en base a la tinción positiva con aceite.

Los glóbulos rojos con múltiples núcleos ocasionales se reconocieron como preosteoclastos y fueron positivos para la fosfatasa ácida resistente al tartrato. Después del aislamiento de células de una cultura 3D, puede hacer una variedad de cosas. Por ejemplo, se pueden estudiar los fenotipos celulares de varias células cultivadas en el microambiente.

Se puede estudiar la expresión de genes y proteínas e incluso se puede determinar qué tipo de moléculas son secretadas por estas células en condiciones 3D.