Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra
24 de octubre de 2013
Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.
El objetivo general de este procedimiento es combinar dos protocolos previamente descritos de degeneración retiniana inducida por luz, con el fin de dañar tanto los fotorreceptores de bastones como los de conos en toda la retina. Esto se logra primero exponiendo peces cebra adultos adaptados a la oscuridad a luz ultravioleta durante 30 minutos. El segundo paso consiste en transferir inmediatamente los peces tratados con luz UV a tanques rodeados por cuatro lámparas halógenas de 250 vatios y exponerlos a luz continua durante hasta cuatro días.
El paso final consiste en sacrificar el pez y enucleizar los ojos para su posterior análisis. Finalmente, se utiliza la microscopía de inmunofluorescencia para mostrar la pérdida constante de los fotorreceptores de bastones y conos en toda la retina. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el tratamiento con luz UV o el tratamiento con lámpara de halógeno, es que la combinación de ambos métodos provoca la ablación de los fotorreceptores de bastones y conos en toda la retina.
El daño a los fotorreceptores induce una respuesta de proliferación generalizada que finalmente resulta en la regeneración de los fotorreceptores perdidos. Esta técnica será demostrada por Jennifer Thomas, una estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar, utilice un plato de Petri de vidrio invertido con un diámetro de 15 centímetros como soporte y sujételo con cinta adhesiva a la bancada del laboratorio para la exposición a luz ultravioleta.
Retire el filamento de luz UV del microscopio estereoscópico fluorescente. Luego, sujete con cinta el filamento de luz UV por encima de la placa de Petri invertida, dejando que aproximadamente dos milímetros del extremo del filamento sobresalgan sobre la placa de Petri. A continuación, cubra la mitad de los lados inferiores y la parte trasera de un vaso de precipitados de vidrio de 250 mililitros con papel de aluminio, asegurándose de que el lado brillante del papel quede orientado hacia el interior del vaso.
A continuación, llene el vaso de precipitados con 100 mililitros de agua del sistema de la instalación para peces. Coloque este vaso de precipitados dentro de un vaso de precipitados de cuatro litros. Luego, llene el vaso de precipitados de cuatro litros con agua hasta que el nivel del agua coincida con la marca de 100 mililitros en el vaso de precipitados de 250 mililitros.
Coloque como máximo 10 peces tratados en oscuridad en el vaso de precipitados de 250 mililitros y cúbralo con un pequeño trozo de papel de aluminio. A continuación, coloque todo el aparato de vaso inmediatamente adyacente al filamento UV. El filamento debe tocar el exterior del vaso de precipitados de cuatro litros y estar orientado hacia la parte expuesta del vaso de precipitados de 250 mililitros.
Asegúrese de que el vaso de precipitados de 250 mililitros esté centrado en el fondo del vaso de precipitados de cuatro litros. Posteriormente, coloque una pantalla opaca grande detrás del vaso de precipitados de cuatro litros, lo que permite exponer a los animales, pero impide que el personal del laboratorio vea la punta del filamento de luz ultravioleta. Luego encienda la fuente de alimentación ultravioleta.
Configure el temporizador durante 30 minutos y coloque las etiquetas de advertencia necesarias para asegurarse de que el personal del laboratorio no se exponga accidentalmente a la radiación UV. Después de 30 minutos, apague la fuente de energía UV. Luego, retire el vaso de precipitados de 250 mililitros con los peces.
En este procedimiento, transfiera el pez desde el vaso de precipitados de 250 mililitros a un acuario transparente de acrílico de 1,8 litros. A continuación, llene el acuario hasta la marca de desbordamiento para configurar el área de tratamiento con luz de lámpara halógena. Coloque dos lámparas halógenas utilitarias de 250, en la misma dirección y separadas 29 centímetros del acuario.
Luego, coloque las otras dos lámparas de manera similar en el lado opuesto, dejando aproximadamente 73 centímetros entre ambos juegos de lámparas. A continuación, coloque el ventilador a igual distancia entre los dos juegos de lámparas, justo fuera del área de tratamiento lumínico. Posteriormente, coloque dos tanques de 1,8 litros llenos de agua en el centro del área de tratamiento lumínico, equidistantes entre ambos juegos de lámparas.
Luego, coloque un aireador de oxígeno en cada tanque. Cubra cada tanque con tapas de acrílico transparente, dejando una separación de dos centímetros en el extremo más cercano al ventilador. Coloque el ventilador de manera que sople aire hacia esta abertura, y coloque un termómetro en uno o ambos tanques.
A continuación, encienda la energía del ventilador de las luces y de los aeradores. Mantenga el tratamiento lumínico hasta por cuatro días. No se debe alimentar a los peces durante el tratamiento lumínico, ya que esto afectará la calidad del agua y provocará mayor estrés en los animales.
Monitoree la temperatura y el nivel de agua diariamente y mantenga la temperatura entre 30 y 33 grados Celsius. Si es necesario, ajuste la velocidad del ventilador y la distancia entre los tanques y las luces. Asimismo, llene cada tanque diariamente con agua del sistema.
48 horas después del inicio del tratamiento con luz halógena, retire los peces del área de tratamiento. A continuación, prepare etanol formal fresco para fijar y eutanizar el pez cebra con una sobredosis anestésica de etoxietanol. Después de eso, transfiera el pez cebra eutanizado a una toalla de papel y, luego, enucleé el ojo utilizando un par de pinzas curvas.
Mantenga los ojos nucleados y el fijador durante la noche a cuatro grados Celsius para criopreservar. Proteja los ojos. Lávelos con sacarosa al 5 % en PBS 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego, reemplácelo por una solución fresca de sacarosa al 5 % en PBS 1X y conserve los ojos durante dos horas. Después de dos horas, lave los ojos con sacarosa al 30 % en PBS 1X durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave los ojos en una proporción uno a uno de medio de congelación y solución de sacarosa al 30 % en PBS 1X durante la noche a cuatro grados Celsius.
Posteriormente, incluya los ojos en medio de congelación para tejidos al 100 %, orientados según el eje dorsal-ventral. A continuación, almacénelos a menos 80 grados Celsius durante al menos dos horas antes de realizar el corte por criomicrotomía. Ahora realice la criomicrotomía del tejido y colóquelo sobre portaobjetos de vidrio.
Luego caliente las laminillas durante dos horas a 55 grados Celsius. Después de eso, almacene las laminillas a menos 80 grados Celsius o realice inmediatamente inmunohistoquímica estándar y obtenga imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Esta figura muestra los cambios en la respuesta de proliferación tras varios paradigmas de daño lumínico.
Aquí se muestran secciones de la retina de un pez cebra albino adulto, marcadas inmunológicamente con PCNA para mostrar la proliferación celular indicada en rojo en las mitades dorsal y ventral de la retina tras diferentes paradigmas de daño lumínico a cero horas. La proliferación estuvo ausente en la capa intercalar a las 48 HLT. Células progenitoras individuales estuvieron presentes en la capa nuclear interna a través de la retina dorsal y en una pequeña porción de la retina ventral.
A las 48 HPUV. Columnas de células progenitoras estaban presentes en la retina dorsal, mientras que solo se observaban células progenitoras individuales en una pequeña porción de la retina ventral. A las UV más 48, grandes columnas de células progenitoras estaban presentes a lo largo de la retina dorsal y ventral.
Esta figura muestra la pérdida de fotorreceptores en bastones y conos en peces cebra pigmentados tras diversos paradigmas de daño lumínico. Aquí se muestran secciones retinianas teñidas con Pro tres para visualizar los núcleos en azul y marcadas inmunológicamente con zpr R tres para mostrar los segmentos externos de los bastones en magenta o con zpr R uno para mostrar los conos dobles en dorado, tras cada uno de los paradigmas de daño lumínico. Se observaron disminuciones significativas en los núcleos de los fotorreceptores en bastones en la retina dorsal a las 48 HLT y en la retina dorsal y ventral a las UV más 48 HLT.
Aunque los núcleos estaban hipertrofiados en la retina dorsal a las 48 HPUV, no se observaron disminuciones significativas en los núcleos de los conos dobles a las 48 HLT ni a las 48 HPUV. Hubo disminuciones significativas en los núcleos en la retina dorsal y ventral a las UB más ocho H lt. Combinar este procedimiento con otros métodos, como inhibidores farmacológicos específicos para genes o la inhibición in vivo de proteínas, puede revelar el papel de genes individuales en la degeneración de fotorreceptores y la consiguiente respuesta de regeneración.
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Descripción general
Este protocolo describe un método mejorado para inducir degeneración retiniana en peces cebra adultos mediante el daño a los fotorreceptores de bastones y conos. La técnica combina la exposición a luz ultravioleta con un tratamiento de luz continua para lograr una pérdida extensa de fotorreceptores en toda la retina.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Regeneración Retiniana
- Biología de los Fotorreceptores
Antecedentes
- Los fotorreceptores son cruciales para la visión y su daño puede provocar una alteración visual significativa.
- El pez cebra es un modelo valioso para estudiar la regeneración retiniana debido a sus capacidades regenerativas.
- Los métodos existentes para inducir daño retiniano tienen limitaciones en cuanto a eficacia.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar los métodos para lograr una ablación más eficaz de los fotorreceptores.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para inducir degeneración retiniana en peces cebra.
- Asegurar daño tanto en fotorreceptores de conos como de bastones.
- Facilitar el análisis adicional de los mecanismos de regeneración retiniana.
Métodos Utilizados
- Los peces cebra adultos adaptados a la oscuridad se exponen a luz UV durante 30 minutos.
- Luego, los peces se transfieren a tanques con lámparas halógenas para exposición continua a la luz durante hasta cuatro días.
- Tras la exposición, los peces se sacrifican y los ojos se enuclean para su análisis.
- Se emplea microscopía de inmunofluorescencia para evaluar la pérdida de fotorreceptores.
Resultados principales
- Se observó una pérdida constante de los fotorreceptores de bastones y conos a lo largo de la retina.
- El método combinado de exposición a la luz resultó más efectivo que los protocolos anteriores.
- Esta técnica permite un análisis completo de la degeneración y regeneración retiniana.
- Los resultados respaldan el uso de este método para estudios futuros en biología retiniana.
Conclusiones
- El protocolo mejorado daña con éxito ambos tipos de fotorreceptores.
- Este método puede utilizarse en diversos estudios relacionados con la regeneración retiniana.
- Investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para explorar enfoques terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo aborda un desafío clave en la investigación de la regeneración retiniana al permitir la ablación constante de fotorreceptores de bastones y conos en pez cebra adulto, un modelo con alta relevancia traslacional para enfermedades retinianas humanas. El enfoque combinado de luz UV y halógena mejora la confianza predictiva en estudios mecanicistas al reducir la variabilidad en el grado de degeneración, lo que favorece una validación de objetivos más confiable y un análisis más preciso de las vías implicadas. Esto sitúa al método como una herramienta escalable para reducir riesgos en las primeras etapas del descubrimiento de estrategias de reparación de fotorreceptores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la inducción de una pérdida amplia y reproducible de fotorreceptores para estudiar los mecanismos de regeneración.
- Valor operativo: Proporciona un paradigma estandarizado de degeneración que facilita la cuantificación consistente de la respuesta de los progenitores en diferentes experimentos.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en los estudios de interacción con el blanco al garantizar que tanto las vías de bastones como de conos se vean afectadas de manera uniforme.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera una lectura cuantificable de degeneración-regeneración compatible con ensayos de proliferación basados en inmunofluorescencia y marcadores de fotorreceptores.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante parámetros definidos de exposición a la luz (30 min de UV + hasta 4 días de halógena), aplicables en cepas pigmentadas y albinas.
- Escalabilidad: Elimina la necesidad de líneas albinas transgénicas, permitiendo su uso en fondos genéticamente diversos o modelos de enfermedad.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Relaciona la inducción de la degeneración con resultados medibles de regeneración, lo que apoya la evaluación preclínica de compuestos pro-regenerativos.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite su combinación con inhibidores específicos de genes o su silenciamiento para desentrañar el papel individual de cada gen en la degeneración y la reparación.
- Confianza Predictiva: Permite el análisis dependiente de la dosis y del tiempo de la proliferación de progenitores y la reorganización de fotorreceptores para la optimización de compuestos prometedores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, actuando como un modelo estandarizado de lesión para iniciar estudios de regeneración antes de la selección de compuestos o los esfuerzos de validación de dianas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las vías de degeneración de los fotorreceptores y la activación de progenitores mediada por células gliales.
- Selección: Genera resultados cuantificables (por ejemplo, progenitores PCNA+, pérdida de marcadores de fotorreceptores) para evaluar el efecto de compuestos.
- Análisis: Permite comparar el grado de degeneración y la cinética de regeneración entre diferentes condiciones mediante microscopía de inmunofluorescencia.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al modelar procesos de pérdida y reparación de fotorreceptores relevantes para humanos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de degeneración reutilizable aplicable en múltiples proyectos dirigidos a la reparación retiniana.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista mediante la ablación constante y pan-fotorreceptores.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad a través de la exposición estandarizada a la luz y controles ambientales (temperatura, calidad del agua, alimentación).
- Valor estratégico: Aumenta la fiabilidad de las decisiones de avance/no avance al minimizar el ruido biológico en las lecturas de regeneración.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas basándose en la eficacia de regeneración en un sistema validado y relevante para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, protocolos de seguridad con luz y procesamiento de tejidos para crioseccionado.
- Necesita fuente de luz UV, lámparas de halógeno, tanques con control de temperatura e infraestructura para microscopía de inmunofluorescencia.
- Exige estandarización de la adaptación a la oscuridad, duración de la exposición a la luz y monitoreo ambiental entre los equipos.
- Debe tener en cuenta la sensibilidad específica a la luz según la especie al adaptarse a otros modelos.
- Limitado por la necesidad de adaptación a la oscuridad y la configuración de equipo especializado, aunque cuenta con orientación procedimental detallada.
