Name: Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende un método mejorado para inducir degeneración retiniana en peces cebra adultos mediante exposición combinada a luz UV y halógena. Esta técnica daña tanto los bastones como los conos fotoreceptores para facilitar estudios de regeneración ocular.

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Los autores desean agradecer a Xixia Luo excelente para la cría de peces y soporte técnico. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R21EY019401 (RT) y P30EY04068 (RT), y los fondos de puesta en marcha a la temperatura ambiente, incluida una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera a la Universidad Estatal de Wayne, Departamento de Oftalmología. JT fue apoyado por una beca Thomas C. Rumble proporcionado por la Escuela de Graduados de la Universidad Estatal Wayne.

Todos los procedimientos descritos en este protocolo fue aprobado por el comité de la utilización de animales en la Facultad de Medicina de Wayne State University. 1. Adaptación a la oscuridad <ol><li> Transferencia ~ 10 peces adultos albino o pigmentado del sistema de vivienda normal en un recinto oscuro. Si está disponible, utilizar un recinto oscuro que está integrado en el módulo de vivienda pez cebra, que permite el flujo normal de agua a través del tanque. (Si tal sistema no está disponible, colocar el tanque de peces en un recinto completamente oscuro, asegurándose de airear el pescado con el oxígeno). </li><li> Mantener a los peces en la oscuridad durante 10 días. Cuando la alimentación de los animales o la adición de nuevos peces a la caja oscura, asegúrese de avanzar lo más rápidamente posible para evitar la exposición de los peces a un largo período de luz. </li></ol> 2. Exposición a la luz UV <ol><li> Asegúrese de que la alimentación de la fuente de radiación UV es OFF. Retire el filamento de la luz UV fluorescentes estereoscópica. <ol><li> Use un invertida15 cm de diámetro de cristal placa de Petri (o algo parecido a 2 cm de altura) como soporte para el filamento UV. Tape la placa de Petri para la mesa del laboratorio. </li><li> Tape el filamento de luz UV al principio del plato invertido Petri. Organizar de manera que ~ 2 mm del extremo de los salientes de filamentos de la placa de Petri. </li></ol></li><li> Obtener un vaso de 250 ml de vidrio. Cubra la mitad de la parte inferior, lados, y la parte posterior del vaso de precipitados con papel de aluminio, asegurándose de que el lado &quot;brillante&quot; de la lámina se enfrenta al interior del vaso de precipitados. Si se graduó el vaso, cubrir la mitad redactado del vaso con papel de aluminio, dejando el claro de la mitad de la copa expuesta. </li><li> Llenar el vaso de precipitados de 250 ml con 100 ml de agua del sistema de instalación de peces. </li><li> Coloque el vaso de 250 ml en un vaso de precipitados de 4 l. Llenar el vaso con 4 L de agua hasta que el nivel del agua está aún con la línea de agua de 100 ml en el vaso de 250 ml. </li><li> Añadir un máximo de 10 animales tratados oscuro al vaso de 250 ml. Cubrir el vaso de 250 ml con una pequeña pieza de aluminiopapel de aluminio. </li><li> Colocar todo el aparato vaso de precipitados inmediatamente adyacente al filamento UV. El filamento debe estar en contacto con el exterior del vaso de precipitados de 4 L y frente a la parte expuesta del vaso de precipitados de 250 ml. Asegúrese de que el vaso de precipitados de 250 ml se centra en la parte inferior del vaso de precipitados de 4 l. </li><li> Coloque una grande, detrás de la pantalla opaca vaso de precipitados de 4 l, lo que permite a los animales a ser expuestos, pero la prevención de cualquier personal de laboratorio de ver la punta del filamento de UV. ADVERTENCIA: asegúrese de que esta barrera es en su lugar antes de conectar la alimentación a la fuente de UV. </li><li> Encienda la fuente de alimentación de UV. Ajuste del temporizador durante 30 min. Coloque lo que las etiquetas de advertencia necesarias para asegurar que el personal de laboratorio desprevenidos no querer exponerse a la radiación UV. </li><li> Después de 30 minutos, apague la fuente de energía UV. Retire el vaso de 250 ml con el pescado. NOTA: si se requieren múltiples rondas de exposición UV, vamos a la fuente de alimentación se enfríe (~ 20 min) antes de repetir el protocolo de exposición. Asegúrese de sustituir tque 100 ml de agua con sistema de agua dulce para cada exposición. El agua en el vaso de precipitados de 4 L no necesita ser reemplazado. </li></ol> 3. Halógena luz de la lámpara de exposición <ol><li> Transferir el pescado de 250 ml vaso en un claro L pecera 1.8 acrílico. Llenar el depósito hasta la marca de desbordamiento. </li><li> Configure la lámpara de luz halógena área de tratamiento. Obtener cuatro 250 W Lámparas halógenas de servicios públicos en una ferretería local. Frente a dos lámparas en la misma dirección, organizar 29 cm de distancia en el centro. Colocar los otros dos lámparas en una manera similar. <ol><li> Coloque el segundo conjunto de lámparas de modo que se enfrentan a la primera serie de lámparas, dejando ~ 73 cm entre los dos conjuntos de lámparas. Esto crea un área de tratamiento de la luz en forma de rectángulo de 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Obtener un pequeño ventilador en una ferretería local. Coloque el ventilador equidistante entre los dos conjuntos de lámparas, a las afueras de la zona de tratamiento de la luz. </li><li> Coloque dos 1.8 L tanques llenos de agua en el centro de laárea de tratamiento de la luz, a medio camino entre los dos conjuntos de lámparas. La distancia entre las lámparas y la pared exterior del tanque debe ser ~ 29 cm. Nota: aunque sólo el tratamiento de 10 peces en un tanque de 1.8 L, utilice este arreglo. Se necesitan tanto los tanques para mantener la temperatura del agua de cada tanque dentro del rango apropiado. </li><li> Coloque un aireador de oxígeno en cada tanque. </li><li> Cubra cada tanque con tapas de acrílico transparente, dejando una brecha de ~ 2 cm en el extremo más cercano al ventilador. Organizar el ventilador para que sople aire dentro de este vacío. Coloque un termómetro en uno o ambos de los tanques. </li><li> Encienda la energía a las luces, ventiladores, y aireadores. Mantener el tratamiento de la luz para un máximo de 4 días. El pescado no debe ser alimentado durante el tratamiento de la luz, ya que esto afectará la calidad del agua y dar lugar a más estrés a los animales. </li><li> Controle la temperatura y del nivel del agua sobre una base diaria. Mantener la temperatura a 30-33 ° C. Si es necesario, ajustar la velocidad del ventilador y / o la distancia entre los tanques y la lilos dere. <ol><li> Remate de cada tanque de agua de la instalación, según sea necesario, por lo general todos los días. </li><li> Siempre use pez cebra adulto sano (típicamente 6-9 meses de edad) para mantener una tasa de supervivencia de cerca de 100%. Sin embargo, si un pez es encontrado muerto en el tanque, retire inmediatamente y reemplazar el agua en todo el tanque. </li></ol></li></ol> 4. Colección de tejidos <ol><li> 48 horas después de la aparición del tratamiento con luz halógeno eliminar el pescado de la zona de tratamiento. <ol><li> Preparar fijador formaldehído etanólico fresca (1 parte de 37% de formaldehído, 9 partes de etanol 100%). </li><li> La eutanasia de pez cebra con una sobredosis anestésica de 2-fenoxietanol (0,4 mg / L). </li><li> Transferir el pez cebra eutanasia a una toalla de papel. Enucleación del ojo utilizando pinzas curvas. </li><li> Coloque ojos enucleados en fijador y almacenar O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect los ojos. <ol><li> Lavar los ojos en 5% de sacarosa 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente, a continuación, reemplazar confresca 5% de sacarosa 1x PBS durante 2 hr. A continuación, lavar los ojos en el 30% de sacarosa 1x PBS O / N a 4 ° C. Lavar los ojos en una mezcla 1:1 (partes iguales) de medio de congelación tisular y 30% de sacarosa 1x PBS O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Insertar los ojos en el 100% de medio de congelación de tejido y se almacenan a -80 ° C. Oriente los ojos de manera que cryosectioning del tejido se realiza en el eje dorsal / ventral. </li><li> Cryosection el tejido y el lugar en portaobjetos de vidrio. Diapositivas caliente durante 2 horas a 55 ° C. Diapositivas Almacenar a -80 ° C o realizar inmediatamente inmunohistoquímica estándar. </li><li> Realizar inmunohistoquímica estándar sobre el tejido seccionado y la imagen con microscopía de fluorescencia 40,51. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí nos muestran que la combinación de una exposición a UV corta con una luz brillante continua exposición resulta en la pérdida de fotorreceptores extendida y una respuesta robusta regeneración. En comparación con los métodos LIRD individuales, este método combinado es también el protocolo más eficaz para dañar los dos conos y bastones en ambas mitades de la retina. Es importante destacar que este tratamiento es eficaz en animales pigmentadas, así como animales albinos. A pesar de...

La degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD) se utiliza comúnmente en roedores y en pez cebra y daños a la varilla fotorreceptores de los conos. En el pez cebra adulto, degeneración de los fotorreceptores activa las células gliales de Müller para volver a entrar en el ciclo celular y la producción de progenitores transitoria-amplificación. Estos progenitores continúan proliferando a medida que migran a la zona dañada, donde se dan lugar en última instancia a nuevos fotorreceptores. Actualmente, hay dos paradigmas LIRD ampliamente utilizados, cada uno de los cuales da como resultado diversos grados de pérdida de fotorreceptores y las correspondientes diferencias en la respuesta de la regeneración. Como herramientas más genéticos y farmacológicos están disponibles para probar el papel de los genes individuales de interés durante la regeneración, hay una necesidad de desarrollar un paradigma LIRD robusta. Aquí se describe un protocolo LIRD que resulta en la pérdida generalizada y coherente de ambos fotorreceptores de los bastones y conos en el que hemos combinado el uso de dos técnicas LIRD previamente establecidos. Además, Este protocolo se puede extender para su uso en animales pigmentados, que elimina la necesidad de mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios LIRD.

<table><tbody><tr><td>Fuente de luz ultravioleta</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio (150 x 20 mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Vaso de precipitados de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4 L</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td></td> CLS10004L <td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250 W halógeno lámparas</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>Tanques de acrílico transparente de 1,8 L</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L tapas de tanque de acrílico transparente</td><td>Aquaneering</td> Ventilador <td>de ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aireador Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>Bent pinza (5/45)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

una novela ligera paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

La degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD) se utiliza comúnmente en roedores y en pez cebra y daños a la varilla fotorreceptores de los conos. En el pez cebra adulto, degeneración de los fotorreceptores activa las células gliales de Müller para volver a entrar en el ciclo celular y la producción de progenitores transitoria-amplificación. Estos progenitores continúan proliferando a medida que migran a la zona dañada, donde se dan lugar en última instancia a nuevos fotorreceptores. Actualmente, hay dos paradigmas LIRD ampliamente utilizados, cada uno de los cuales da como resultado diversos grados de pérdida de fotorreceptores y las correspondientes diferencias en la respuesta de la regeneración. Como herramientas más genéticos y farmacológicos están disponibles para probar el papel de los genes individuales de interés durante la regeneración, hay una necesidad de desarrollar un paradigma LIRD robusta. Aquí se describe un protocolo LIRD que resulta en la pérdida generalizada y coherente de ambos fotorreceptores de los bastones y conos en el que hemos combinado el uso de dos técnicas LIRD previamente establecidos. Además, Este protocolo se puede extender para su uso en animales pigmentados, que elimina la necesidad de mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios LIRD.

El protocolo de tratamiento de la luz hasta ahora descrito se comparó con cada método de LIRD. En los animales albinos adultos tratados con oscuro (Figuras 3-5), los tratamientos de luz individuales dieron como resultado una pérdida significativa de la varilla (figura 3) y el cono (Figura 4) fotorreceptores. Sin embargo, ambos tratamientos individuales dañados principalmente fotorreceptores en la mitad dorsal de la retina, dejando la retina ventral relativament...

Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

El objetivo general de este procedimiento es combinar dos protocolos previamente descritos de degeneración retiniana inducida por luz, con el fin de dañar tanto los fotorreceptores de bastones como los de conos en toda la retina. Esto se logra primero exponiendo peces cebra adultos adaptados a la oscuridad a luz ultravioleta durante 30 minutos. El segundo paso consiste en transferir inmediatamente los peces tratados con luz UV a tanques rodeados por cuatro lámparas halógenas de 250 vatios y exponerlos a luz continua durante hasta cuatro días.El paso final consiste en sacrificar el pez y enucleizar los ojos para su posterior análisis. Finalmente, se utiliza la microscopía de inmunofluorescencia para mostrar la pérdida constante de los fotorreceptores de bastones y conos en toda la retina. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el tratamiento con luz UV o el tratamiento con lámpara de halógeno, es que la combinación de ambos métodos provoca la ablación de los fotorreceptores de bastones y conos en toda la retina.El daño a los fotorreceptores induce una respuesta de proliferación generalizada que finalmente resulta en la regeneración de los fotorrec

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Este video muestra un procedimiento para inducir la degeneración de la retina en peces cebra adultos utilizando lesiones por láser. El láser se dirige a las células fotorreceptoras de la retina, lo que provoca la muerte celular y un proceso degenerativo. Este daño activa las células de la glía de Müller (MG), lo que lleva a su desdiferenciación en progenitores de células madre que ayudan en la regeneración de la retina.

Modelado de la degeneración y regeneración de la retina en el pez cebra mediante una lesión focal con láser

Presentamos un método eficiente para marcar retrógradamente las células ganglionares de la retina (RGCs) en peces cebra adultos.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

Aquí demostramos cuantificación de de retina y la regeneración y su impacto en la función visual usando N-metil-N-nitrosourea en el pez cebra adulto. Pérdida de la agudeza visual y la disminución de los números de fotorreceptores fueron seguidos por la proliferación en la capa nuclear interna. Regeneración morfológica y funcional completa ocurrió 30 días después del tratamiento inicial.

Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

Se describe un modelo mecánico de lesión cerebral en el pez cebra adulto para investigar los mecanismos moleculares que regulan su alta capacidad regenerativa. El método explica crear una lesión por arma blanca en el tectum óptico de múltiples especies de peces pequeños para evaluar las respuestas regenerativas utilizando inmunotinción fluorescente.

Modelo de lesión por puñalada del Tectum óptico adulto utilizando pez cebra y medaka para el análisis comparativo de la capacidad regenerativa

El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.

Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

Aprende un método mejorado para inducir degeneración retiniana en peces cebra adultos mediante exposición combinada a luz UV y halógena. Esta técnica daña tanto los bastones como los conos fotoreceptores para facilitar estudios de regeneración ocular.

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

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