Un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones

El objetivo general de este procedimiento es acelerar el proceso natural de atresia folicular en los ovarios, lo que provoca insuficiencia ovárica, agotamiento del estrógeno y una hembra no cíclica, una condición que imita de cerca la menopausia. Esto se logra primero administrando durante 15 a 20 días consecutivos la sustancia química industrial dióxido de vinilciclohexeno o VCD, que se ha demostrado que ataca y destruye específicamente los folículos ováricos primarios y primordiales pequeños al acelerar su proceso natural de atresia. El segundo paso consiste en determinar el ciclo estral y la ciclicidad ovárica mediante citología vaginal, comenzando aproximadamente seis semanas después del inicio de las inyecciones de VCD.

Deben observarse de 15 a 20 días de diestro persistente o de ausencia de ciclos mediante citología vaginal para confirmar la pérdida del ciclo y la falla ovárica. El paso final consiste en implementar una intervención que pueda verse afectada por la menopausia o la transición hacia la menopausia, como el ejercicio voluntario en rueda de jaula o la adaptación cardíaca. En última instancia, la actividad voluntaria en la rueda de la jaula y la adaptación cardíaca se utilizan para determinar si la menopausia disminuye la actividad en la rueda de la jaula.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la ooforectomía, es que la ooforectomía es un procedimiento quirúrgico que provoca una depleción repentina de estrógeno, a diferencia de la pérdida progresiva natural del estrógeno que ocurre durante la transición del estado premenopáusico al postmenopáusico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades metabólicas y cardiovasculares en mujeres posmenopáusicas, ya que estas son particularmente más susceptibles al síndrome metabólico y sus comorbilidades asociadas, incluyendo enfermedades cardiovasculares, en comparación con mujeres premenopáusicas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la citología vaginal son difíciles de aprender porque es necesario tener cuidado al ejecutar la técnica adecuada de extensión y al identificar el ciclo EST.

Cuatro, el dióxido de vinilciclina o VCD se almacena a menos 20 grados Celsius. Para preparar el VCD para el protocolo de inyección, agregue 0,587 mililitros de VCD a un vial de dosificación limpio y complete hasta un volumen final de 10 mililitros con aceite de sésamo, tápelo y séllelo con parafilm, luego mezcle invirtiendo suavemente. Almacene a cuatro grados Celsius durante hasta siete días.

Para iniciar el protocolo de inyección de VCD, pese dos ratones de dos meses de edad durante 20 días consecutivos, administre inyecciones intraperitoneales diarias de VCD a temperatura ambiente en una dosis de 160 miligramos por kilogramo, utilizando una aguja de calibre 27 durante el período de inyección. Intente alternar los sitios de inyección para reducir las posibilidades de infección local de manera similar. Inyecte a los ratones control la solución vehicular de aceite de sésamo en un volumen de 2,5 mililitros por kilogramo una vez finalizado el período de inyección.

Monitoree el ciclo estral diariamente obteniendo frotis vaginales. Uno de los factores críticos para el éxito de este estudio es obtener frotis vaginales de alta calidad para la determinación citológica. Restrinja los ratones utilizando el método de sujeción por la nuca.

Introduzca un gotero con 0,2 mililitros de solución salina estéril en el orificio vaginal hasta una profundidad de 0,5 centímetros. Mezcle tres veces la solución salina inyectada con el gotero y luego coloque una gota en un portaobjetos en blanco. Evalúe inmediatamente cada muestra microscópicamente utilizando un microscopio óptico estándar a 100 x para validar la insuficiencia ovárica.

Posteriormente, se utilizan ratones menopáusicos inducidos por VCD para los experimentos de ejercicio. El aparato de rueda de jaula consiste en una rueda de 11,5 centímetros de diámetro con una superficie de carrera de cinco centímetros de ancho, equipada con un contador magnético digital que se activa mediante la rotación de la rueda. Antes de cada prueba de carrera en la rueda, calibre la rueda de jaula según las indicaciones del fabricante.

Mida el diámetro interno de la rueda giratoria. Calcule la circunferencia e introduzca este valor en el contador digital como el tamaño de la rueda para montarla en la jaula, deslice la rueda. Pase por la rejilla superior de la jaula del animal.

Sujete el soporte de la rueda al alambre de la jaula con clips sujetapapeles. Los clips deben colocarse en la parte superior del alambre, alejados del animal. Pase la parte del ordenador y cualquier cable adicional a través del alambre de la jaula.

Coloque la computadora y el exceso de cable fuera del alcance del animal. Esto puede lograrse colocando un recipiente plástico de peso de tamaño mediano encima del cableado de la jaula para sostener la computadora y el exceso de cable. A continuación, fije la parte de la computadora del contador magnético digital al soporte de la rueda.

Utilice cinta adhesiva para fijar el imán libre del contador magnético digital a la barra central del mismo lado que el cable del imán hacia la computadora. Vuelva a colocar suficiente cinta para proteger el imán de posibles daños por mordeduras. El imán debe colocarse de manera que cada rotación de la rueda sea registrada por la computadora sin ninguna interferencia ni resistencia que impida la rotación completa de la rueda.

Coloque la rueda giratoria en la rueda. Sujétela insertando los postes del soporte en los orificios de montaje ubicados en las barras centrales de la rueda. Asegúrese de que la rueda pueda girar libremente.

El montaje debe vigilarse diariamente en busca de daños por mordedura y repararse según sea necesario durante el experimento. Ratones hembra consanguíneos de siete meses de edad, C 57, black six y B six C3 F1 de una misma camada, se asignan aleatoriamente a un régimen de ejercicio o al control sedentario. ¿Cómo se mantienen los animales experimentales individualmente? En una jaula de 47 por 26 por 14,5 centímetros con acceso libre a una rueda para jaula durante 28 días, los animales control se mantienen juntos en una jaula sin rueda.

Proporcione a todos los animales agua y alimento estándar para roedores. Agregue lido y registre manualmente los valores diarios de la distancia recorrida y el tiempo total dedicado a correr, proporcionados por el contador magnético. Registre los valores de distancia y tiempo dentro del mismo período de una hora cada día, para obtener valores precisos y consistentes durante los 28 días del período de ejercicio. Después de cada registro diario, limpie el contador magnético para asegurar lecturas precisas al día siguiente.

Al finalizar el período específico de ejercicio, se registra el peso corporal de los animales sacrificados antes de la recolección de tejidos. Para exponer el corazón, realice una incisión medial en el lado ventral, abra el diafragma y visualice rápidamente el corazón. Extraiga el corazón en su base y colóquelo en solución salina tamponada con fosfato fría para lavar adecuadamente la sangre ventricular residual. Elimine el tejido excesivo del corazón, pese el corazón completo y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido si se desea.

Recolecte tejidos adicionales, lávelos con una solución modificada de salina tamponada con fosfato fría con hielo y congele rápidamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. En este estudio, se indujo la falla ovárica mediante tratamiento con VCD y se confirmó mediante examen microscópico de frotis vaginales. La etapa del ciclo esra se determina por la proporción de células epiteliales, células epiteliales cuantificadas y leucocitos en células epiteliales nucleadas PROEs, que predominan.

Aquí las flechas indican células nucleadas durante el estro, mientras que las células escamosas epiteliales predominantemente no nucleadas son cuantificadas. El estro se caracteriza por una mezcla de tipos celulares con predominancia de leucocitos. El diestro está dominado por leucocitos.

El ciclo estro en ratones normalmente dura cuatro días antes de la inyección de VCD. Se consideró que los animales eran acíclicos tras 15 días de diestro persistente. Esta figura muestra la duración promedio en días del ciclo estro extra de los grupos inyectados con vehículo y con VCD.

Un ciclo se mide desde el primer día del estro hasta el primer día del siguiente periodo. En el estro, la citología vaginal comenzó aproximadamente seis semanas después del inicio de las inyecciones. Se observó que los ciclos estros de los animales inyectados con VCD se volvieron irregulares en comparación con los animales inyectados con vehículo, y tras 12 ciclos estros, la citología de todos los animales inyectados con VCD ya no indicaba ciclado al finalizar el protocolo de inyección de VCD. La tinción con hematoxilina y eosina (H y e) de secciones transversales del tejido ovárico reveló una atrofia significativa en el tejido ovárico tratado con VCD en comparación con los controles.

Al observarse con un aumento de 20x a 200 aumentos, se observó una depleción completa de folículos primarios y primordiales en el tejido tratado con VCD. A diferencia del tejido tratado con vehículo, se evaluó el efecto del fracaso ovárico inducido por VCD sobre el rendimiento en el ejercicio en ratones de siete meses de edad, tratados con VCD o con vehículo, de dos cepas; los valores diarios de ejercicio en rueda de jaula se registraron durante un período de cuatro semanas para tiempo y distancia de cada animal ejercitado. Esta figura muestra los promedios semanales de los valores diarios de corrida para distancia, tiempo y velocidad.

Para ratones C57, negros seis, tratados con vehículo o con VCD, no se observaron diferencias significativas en el rendimiento físico medido por la distancia media diaria recorrida ni en el tiempo dedicado a la rueda entre los grupos tratados con VCD y los tratados con vehículo, ni en la cepa C57, negros seis ni en la cepa B6C3F1. Esto indica que el impacto de la insuficiencia ovárica inducida por VCD sobre el ejercicio voluntario en la rueda trasciende al menos dos cepas murinas tras la duración del protocolo de ejercicio voluntario en jaula. Se registraron las morfometrías corporales y los corazones fueron rápidamente extraídos y pesados, en concordancia con observaciones previas.

Se observó hipertrofia cardíaca en respuesta al ejercicio en rueda de jaula, medida por el peso absoluto del corazón y el peso cardíaco normalizado respecto a la longitud tibial. Aunque la masa cardíaca absoluta y la relación entre peso cardíaco y longitud tibial fueron significativamente mayores en los ratones tratados con vehículo y VCD en comparación con sus contrapartes sedentarias, no hubo diferencias medibles en la hipertrofia cardíaca entre el control y la insuficiencia ovárica inducida por VCD. Finalmente, tras el ejercicio voluntario en rueda de jaula, los ratones tratados con VCD y con vehículo fueron sometidos a carrera forzada en cinta rodante para determinar sus capacidades de ejercicio tanto a alta como a baja intensidad.

En el protocolo de alta intensidad, la velocidad promedio de la cinta se incrementó progresivamente cada 10 minutos hasta que los ratones mostraron signos de agotamiento. En promedio, la velocidad máxima de los ratones tratados con vehículo fue de 26,7 ± 0,95 metros por minuto, y la velocidad máxima de los ratones tratados con VCD fue de 28 ± 1,4 metros por minuto antes del agotamiento. Se utilizó una corrida de baja intensidad a 20 metros por minuto para evaluar la capacidad de resistencia.

En promedio, el tiempo máximo de los ratones tratados con vehículo fue de 28,3 ± 1,3 minutos, y el tiempo máximo de los ratones tratados con VCD fue de 29,7 ± 1,4 minutos antes del agotamiento. No se encontraron diferencias significativas en la capacidad de ejercicio de alta o baja intensidad entre los grupos tratados con vehículo y con VCD, lo que indica que la insuficiencia ovárica inducida por VCD no tuvo efecto sobre la capacidad de ejercicio de los ratones. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en los campos de las ciencias celulares, moleculares y fisiológicas exploraran el papel de la menopausia en roedores.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar las inyecciones VCD adecuadas, ejecutar la citología vaginal e implementar una intervención fisiológica.