Name: Un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprenda a inducir menopausia química con VCD en ratones para evaluar capacidad de ejercicio y adaptación cardíaca. Este método permite estudiar los efectos del fallo ovárico en la fisiología cardiovascular.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención (HL 098 256), por un Premio Nacional y Mentored Investigaciones para el Desarrollo de Ciencia (K01 AR052840) y el Premio Científico Independiente (K02 HL105799) de los NIH concedido a JP Konhilas y la Beca de Formación Interdisciplinaria en Ciencias Cardiovasculares (HL007249 ). Se recibió apoyo del Centro de Corazón Sarver de la Universidad de Arizona y de la Fundación Steven M. Gootter.

Todos los experimentos, la vivienda y el cuidado de los animales se realizó mediante los protocolos que se adhirieron a las guías y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Arizona, y en 2011 las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. El tratamiento con 4-vinilciclohexeno diepóxido <ol><li> VCD protocolo de dosificación: En una campana para vapores químicos, añadir 0,587 ml de VCD a un frasco limpio y llevar el volumen final a 10 ml con aceite de sésamo, y luego mezclar por inversión suave, tapar y sellar con parafilm. Transfiera la solución a un vial de dosis, sellarlo con Parafilm y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 7 días. Asegúrese de que todos los reactivos son estériles. <ol><li> Utilice aceite de sésamo como el control del vehículo como se disuelve VCD en aceite de sésamo. VCD tienda (PM = 140,2 g / mol, densidad = 1,09 g / ml) a -20 ° C. </li><li> Protocolo de inyección VCD: A los 2 meses de edad, pesar y administrar inyecciones intraperitoneales diarias de temperamento habitaciónVCD peratura a una dosis de 160 mg / kg durante 20 días consecutivos. Inyectar ratones de control en una manera similar con la solución de vehículo, aceite de sésamo, a un volumen de 2,5 ml / kg. Nota: Durante el período de inyección, trate de alternar los lugares de inyección para reducir las posibilidades de infección local. Utilice la siguiente ecuación para calcular el volumen necesario para la inyección: Peso corporal (g) x kg / 1000 GX 2,5 ml / kg = volumen (ml) de solución para inyectar resultante en aproximadamente 50 ml / inyección usando una aguja de calibre 27. Debido al tamaño de la aguja no son necesarios los anestésicos locales. </li><li> Vigilancia del ciclo estral: Después del período de inyección se ha completado, monitorear los ciclos de celo al día mediante la obtención de frotis vaginales. Restringir los ratones utilizando el método pescuezo dorso. Insertar un gotero con 0,2 ml de solución salina estéril en el orificio vaginal hasta una profundidad de 0,5 cm. Se tritura solución salina (3x) y colocar 1 gota en una diapositiva en blanco. Inmediatamente evaluar muestras al microscopio utilizando una microsc luz estándarope una magnitud de 100X. Nota:. Citología vaginal está decidido a asegurar la pérdida de la bicicleta y, por tanto, validar insuficiencia ovárica Figura 2A ilustra la citología vaginal típico en las distintas fases del ciclo estral en ratones, a saber proestro, estro, metaestro, diestro 17-19. Durante el proestro, células incluyen células epiteliales nucleadas (Figura 2A, las flechas indican las células nucleadas); durante el estro, las células se Cornified predominantemente células epiteliales escamosas; Metaestro se caracteriza por una mezcla de tipos de células, con un predominio de leucocitos; Diestro está dominado por los leucocitos. Ajuste del plano focal puede ser necesaria para visualizar las células y los núcleos a lo largo de la muestra. Como se ilustra en la Figura 2B, un ciclo típico de estro murino es de 4-5 días. Los ratones son considerados acíclico después de 15 días consecutivos en el diestro persistente. Un seguimiento continuo de los ciclos de estro durante toda la duración del estudio porIOD para confirmar la falta de ciclos de estro en ratones tratados VCD. </li></ol></li></ol> 2. Voluntario de Ejercicio Jaula ruedas Endogámicas C57BL / 6 y B6C3F1 ratones hembras, con edades entre 7 meses, están expuestos a la voluntaria rueda de jaula en ejecución. Animales Casa individual en una jaula (47 cm x 26 cm x 14,5 cm) con un acceso sin trabas a una rueda de la jaula durante 28 días. <ol><li> Colocación del equipamiento: El aparato de rueda de jaula consta de una rueda de diámetro de 11,5 cm, con una 5,0 cm de ancho que se ejecutan superficie equipada con un contador magnético digital que se activa por la rotación de la rueda. Antes de cada ensayo de la rueda en marcha, calibrar la rueda de la jaula de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medir el diámetro interior de la rueda de rodadura, calcular la circunferencia y entrar en este valor en el contador digital como tamaño de la rueda. <ol><li> Fije la parte informática del contador magnético digital al soporte de la rueda utilizando cinta. </li><li> Conecte el puerto del ordenadorion del contador magnético digital al soporte de la rueda utilizando cinta. </li><li> Ponga el imán libre del contador magnético digital a la barra central en el mismo lado que el imán envió un cable a la computadora, de nuevo la grabación lo suficiente como para proteger el imán de la masticación daños. Los imanes deben colocarse de manera que cada giro de la rueda es registrada por la computadora sin ninguna interferencia o resistencia para completar la rotación de la rueda. Nota: La cinta adhesiva se ha utilizado con éxito para unir los componentes de la barra magnética digital a la rueda de funcionamiento. Grabado debe ser suficiente para cubrir completamente el imán y prevenir el daño de mascar por el animal. El imán debe estar colocado lo más cerca posible a la rueda sin impedir su movimiento. Sin embargo, la configuración debe ser revisado diariamente para masticar daño y reparar si es necesario. </li><li> Monte la rueda a la jaula deslizando la rueda de pie a través del cableado de la parte superior de la jaula de los animales. Fije el soporte de la rueda en tque el cableado jaula con clips de la carpeta. Nota: El clip debe estar en la parte superior del cableado, lejos del animal. Alimente la parte informática y cualquier cable adicional a través del cableado de la jaula. Sitúe el sistema y el exceso de cable fuera del alcance de los animales. Esto se puede lograr mediante la colocación de un plástico de tamaño mediano pesar la cápsula en la parte superior del cableado de la jaula para mantener el ordenador y el exceso de cable. </li></ol></li><li> Ejercicio: Para una camada dado, asignar al azar a los ratones, ya sea el control sedentarios o régimen de ejercicios. Dar a todos los animales del agua y el estándar de roedores chow duro ad libitum. <ol><li> Grabar manualmente los valores diarios para el ran distancia (km / día) y el tiempo total empleado en funcionamiento (h / día), propuesta por el contador magnético. Distancia y tiempo récord valores dentro del mismo marco de tiempo de 1 hora cada día para los valores exactos y consistentes a lo largo de la duración 28 días del período de ejercicio. Clear (cero) el contador magnético después de la grabación de cada día para asegurar lecturas precisas del seguimientoing días. </li><li> Cálculo de los valores medios de la distancia y la velocidad para cada grupo. Cálculo de velocidad en base a los valores dados de distancia y el tiempo cada día para cada ratón. Los datos se pueden mostrar como diario o promedios semanales para cada parámetro medido. </li></ol></li><li> La cosecha de tejidos: al final del período de ejercicio específico, la eutanasia a los animales de control ejerce y sedentarias en los 30 minutos de la eliminación de las jaulas por dislocación cervical bajo anestesia inhalada. Pesar de masa corporal y los corazones rápidamente especiales, músculo esquelético, y los ovarios. <ol><li> En el momento de la recolección de tejido, montar y manchar los ovarios recogidos con hematoxilina y eosina (H &amp; E, Figura 2C). Bajo aumento, contar y clasificar los folículos como primordial, primaria, secundaria o antral para cada VCD tratados y de control de animales 20. Un folículo primordial contiene una pequeña ovocito primario, una sola capa de células de la granulosa aplanadas o escamosas estrechamente opuestas a la de los ovocitos, y una basaleslámina. Un folículo primario se define por la presencia de una o más células de la granulosa cúbicas que están dispuestas en una sola capa que rodea el oocito. Un folículo secundario contiene células de la granulosa que forman múltiples capas que rodean el ovocito, y una teca. Un folículo antral se caracteriza por una cavidad o &quot;antro&quot; que contiene fluido. </li><li> Para extirpar el corazón, hacer una incisión medial en la parte ventral y visualizar el corazón después de la apertura del diafragma. Rápidamente extirpar el corazón en la base y el lugar en buffer fosfato salina fría para lavar Salida suficiente sangre ventricular residual. Recorte el corazón de exceso de tejido, sopesar todo el corazón y snap-congelado en nitrógeno líquido. </li><li> Lave todos los demás tejidos extirpados con una solución modificada helado de buffer fosfato salino (PBS), y complemento de congelación en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. </li></ol></li></ol> 3. Ejercicio Caminadora Forzada <ol><li> Cuando se emplea un ejercicio forzado paradigma to medir la capacidad de ejercicio, use una cinta de correr y configurar de la siguiente manera: <ol><li> Coloque una rejilla de descarga eléctrica en la base de la rampa de laboratorio. Este choque generada sirve como un estímulo para el ejercicio. La intensidad y frecuencia de los estímulos eléctricos son controlados manualmente por los usuarios. Grids pueden activarse o desactivarse individualmente para cada carril. Toda la recogida de datos se realiza de forma manual. </li><li> Periódicamente, calibrar la cinta de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Asegúrese de que la palanca del panel frontal del controlador rueda de ardilla se establece en &quot;STOP&quot;. </li><li> Coloque el sensor de velocidad en lane1 cinta caminadora y asegure firmemente con la tuerca de tornillo en la posición indicada a continuación. </li><li> Utilización del dial en el panel frontal del controlador para correr, ajuste la velocidad de 88,7 m / min A continuación, establezca la frecuencia del estímulo eléctrico a 2 Hz en el panel frontal del controlador caminadora. </li><li> Pulse el botón de &quot;reinicio del odómetro&quot; para iniciar el procedimiento de calibración. <strong&gt; Nota: Los grupos de control sedentarios o no ejercicio se deben incluir en el diseño experimental. El grupo sedentario es emparejados por edad para el grupo de ejercicio. Hemos demostrado anteriormente que la vivienda los ratones sedentarios individualmente en jaulas de igual tamaño a los ratones ejercitados no afectaron los parámetros de interés en comparación con ratones sedentarios alojados con sus hermanos. Por lo tanto, los ratones sedentarios se mantuvieron con los hermanos en la misma habitación que los ratones ejercitados. </li></ol></li></ol></li><li> Aclimatación: Aclimatar ratones para la cinta de correr 3-7 días antes del experimento todos los días. Para ello, coloque los ratones en la cinta de correr con los cinturones de rejillas inmóviles y choque fuera, pero con el motor de la banda sobre (ruido). Deja los ratones no alterados por lo menos durante 15 min. </li><li> Calentamiento: Calentar los pasos tal como se utiliza en este protocolo son las siguientes: <ol><li> Coloque cada ratón en la caminadora. Desactivar la cuadrícula de choque y aumentar la velocidad de la correa de 4 m / min durante 15 min. </li><li> Habilitar la cuadrícula de choque y mantener la velocidad de la correa en4 velocidad de la banda m / min durante 10 minutos adicionales. </li></ol></li><li> Regímenes de entrenamiento Ejercicio <ol><li> Después del calentamiento, mantener las redes de choque en y aumentar la velocidad de la correa a 5 m / min durante 15 min. </li><li> Aumentar la velocidad de la correa de 15 m / min durante 15 min. </li><li> Después de la capacitación, la transferencia de los ratones de vuelta a sus jaulas. Nota: En este estudio, la práctica de ejercicio se realizó diariamente durante 1 semana. </li><li> Régimen de ejercicios aguda: Un régimen de ejercicio agudo está diseñado para determinar los efectos a corto y largo plazo del estrés ejercicio extremo. <ol><li> Después de calentamiento, aumentar la velocidad de la cinta de 5 m / min a 10, 15, 20, 25, y 30 m / min en intervalos de 10 min. Nota: Terminar el ejercicio si los ratones no pueden continuar en ejecución o mostrar signos de cansancio o angustia. En nuestro estudio, la mayoría de los animales se detuvieron a 25 m / min, y ningún animal pasaron el 30 m / min etapa. </li><li> Pruebe cada ratón tres veces, dejando 2-3 días entre cada prueba. Calcular los valores promedio de todos los ejerciciossesiones precisas para cada ratón. </li></ol></li><li> Régimen de ejercicios para la resistencia: Un protocolo de ejercicio de resistencia está diseñado para capacitar a los ratones de una exposición prolongada al ejercicio estímulo caminadora. Este tipo de protocolo a prueba la capacidad de tolerar los efectos a largo plazo del estrés de ejercicio moderado. <ol><li> Comience con la velocidad de la cinta se indica durante el período de calentamiento, 4 m / min. </li><li> Poco a poco aumentar la velocidad de la cinta por 1m/min hasta una velocidad final de 20 m / min se alcanza. La duración total de un protocolo de estudio típico es 50 min. </li><li> Después de un régimen de ejercicio, transferir los ratones de vuelta a sus jaulas. Nota: La ejecución de ratones hasta el agotamiento se evita. Si en algún momento durante el experimento un ratón muestra signos de agotamiento, desactive la cuadrícula de choque y permitir que el ratón para descansar y recuperarse. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Los datos y análisis estadístico <ol><li> Presentar los resultados como media ± SEM y el uso de 2-way ANOVA (grupo de tratamiento y exercise como factores principales) seguida de una prueba de Student-Newman Keuls post hoc o la prueba t de Student para comparar las diferencias entre los valores medios. </li><li> Determinar el porcentaje de cambio en la masa cardíaca con el ejercicio mediante la comparación de la masa de cada animal ejercido a la masa media cardiaco del grupo sedentario. La diferencia en la masa cardíaca se expresa como un porcentaje de cambio de los animales sedentarios para cada animal en cuestión. valores de p de &lt;0,05 se consideraron estadísticamente significativos. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tanto el ejercicio de la rueda de la jaula y carrera en cinta rodante regímenes de ejercicio se han utilizado en nuestros estudios previos 16,21,22. Todos los animales se mantienen en salas de ejercicio específicos para reducir al mínimo las perturbaciones ambientales o humanas. Cualquier alteración de los animales ritmo biológico puede afectar significativamente a los animales el rendimiento del ejercicio. Por lo tanto, los de atención de todo animal, monitoreo del desempeño y de grabación, y regímenes de ejercicio se debe hacer dentro del mismo marco de tiempo diario. Los investigadores deberían esforzarse por evitar el estrés adicional para los animales, al mostrar precauciones tales como la limitación de la duración de la exposición al estrés y cubrir las jaulas cuando sea apropiado. Ejercicio de la rueda de la jaula Al preparar el aparato de la rueda de la jaula, la rueda debe ser fácilmente accesible para el ratón para montar y salir. No debería ropa de cama mínima en la parte inferior de la jaula para evitar que los ratones de los nidos de alrededor de la rueda e impidiendo frecuenciamovimiento de la rueda e. El sensor magnético se coloca sobre la parte fija de la rueda y el imán fijado a la rueda libre, así como para contar cada rotación de la rueda como ejerce el ratón. El dispositivo de registro conectado al sensor magnético debe colocarse encima de la tapa de alambre de la jaula, y todos los cables expuestos deben ser ya sea grabada o mantenerse fuera del alcance de los ratones, con el fin de proporcionar una barrera contra el daño de mascar. Los sensores magnéticos y magnéticos también fueron grabadas con las estructuras adecuadas para prevenir los daños y el movimiento no deseado. Durante la recogida diaria de datos, todos los cables con cinta deben estar estrechamente seleccionados para asegurar los cables permanecen intactos y deben ser retaped según sea necesario. Ya que puede requerir varios días para que los ratones se aclimatan al nuevo entorno y comenzar a hacer ejercicio con regularidad, el registro de datos se debe adaptar a cada animal individual. Aunque los animales tienden a pasar muchas horas en el volante, la mayor parte de la carrera se produce en la noche. Por lo tanto, algunos animales pueden revelar high actividad de rendimiento, incluso si parecen latentes durante el día. Además, no es infrecuente que algunos animales exhibirán limitada rueda de jaula de funcionamiento. Por lo general, la actividad de la rueda jaula que equivale a un 1 km / día promedio o menos es el resultado de la actividad de la jaula al azar y no se asocia a ningún estímulo funcionamiento significativo. Por lo tanto, los animales cuyos parámetros de funcionamiento están a 1 km / día o 1 hora / día o menos deben ser excluidos en las finales no corredores de análisis de datos. En función de los fines específicos de un estudio individual y cepas de ratones que participan, la duración de ejercicio se puede modificar. Nuestro estudio anterior mostró que para ambas cepas de ratón que participan, las velocidades medias de las ruedas de marcha y la duración del ejercicio en la rueda de la jaula se incrementaron gradualmente con el tiempo y se estabilizaron por 4 semanas. Rueda de la jaula de funcionamiento es un tipo de ejercicio voluntario en modelos animales, que se toma generalmente como que se realiza bajo condiciones menos estresantes. Unlde esfuerzo ike en el que algunos parámetros pueden estar predefinidos, todos corriendo en la jaula de prueba es voluntaria y fácilmente afectado por señales ambientales o de comportamiento. Por lo tanto, las comparaciones entre diferentes parámetros experimentales se evitan típicamente menos que se utilicen grandes números de grupos experimentales. Otras áreas potenciales de investigación que pueden beneficiarse de este tipo de paradigma de ejercicio son los estudios que incorporan respuestas de comportamiento con consecuencias fisiológicas como la neurociencia cognitiva. Para los estudios que utilizan el paradigma voluntaria rueda de jaula, los pasos más críticos son la jaula de configurar y seguimiento de las actividades de ejercicio. Ejercicios de rutina Etapas de aclimatación son necesarios para preparar los animales para el protocolo de ejercicio en cinta ergométrica. Dependiendo de la finalidad específica del estudio individual, la duración del periodo de aclimatación puede variar. En este estudio, se eligió un período de una semana para que los animales puedan acclimcomieron al aparato caminadora y el ruido del motor en la jaula, calentar períodos son un paso importante del régimen de entrenamiento de ejercicio. Al igual que sus homólogos humanos, los ratones deben calentarse antes de entrar en cualquier regimen de ejercicios intensivos para evitar lesiones y artefactos de datos posibles. En este estudio, comenzamos la cinta a la velocidad más baja posible (4 m / min) con las rejillas de choque apagados durante 15 min. Todos los ratones involucrados comenzaron a correr dentro y fuera de la correa. Las rejillas de choque fueron luego encendidos y la velocidad de la cinta mantuvieron a 4 m / min. Para evitar el exceso de hincapié en los ratones, fijamos el choque eléctrico a un nivel leve (1 Hz). A los pocos días, todos los ratones adaptados a la cinta sin fin. La duración de funcionamiento, así como la aceleración también se pueden adaptar a cada diseño experimental. Una tasa de aceleración de partida recomendada es de 1 m / min. Los carriles de la rueda de ardilla de los ratones que muestran signos de agotamiento se deben apagar inmediatamente. Típicamente signos de agotamiento exhibidos por mice en la cinta son los siguientes: <ol><li> La exposición continua a la red de choque para&gt; 5-10 segundos, </li><li> La pérdida de la capacidad de funcionamiento como resultado una exposición rejilla de choque&gt; 5x durante un solo régimen de ejercicio, y </li><li> La pérdida de la capacidad de funcionamiento como resultado una exposición rejilla de choque&gt; 2 segundos por lo menos 3 veces durante un solo régimen de ejercicios. </li></ol> Los valores indicados arriba son para ser utilizado principalmente como directrices para un experimento específico. Estos parámetros deben determinarse para cada protocolo de ejercicio ya que varía de cepa de ratón de la cepa de ratón, un experimento a otro, y el investigador a investigador. A diferencia del ejercicio de rueda de la jaula, los estudios de la rueda de ardilla se deben repetir varias veces para eliminar los efectos de los factores ambientales y biológicos sobre el rendimiento de carrera. No es raro ver a las fluctuaciones en el rendimiento de la carrera entre las pruebas, incluso para el mismo animal. Dado que cada régimen de ejercicio expone corriendo los ratones a un stress, un intervalo de descanso adecuado entre las pruebas es necesario. En nuestra experiencia, 2-3 días de descanso entre cada período de prueba fue suficiente para que los ratones se recuperan. Al igual de esfuerzo humano, la velocidad para el ejercicio de resistencia se determina mejor por el ritmo cardíaco o la saturación de oxígeno en sangre, una hazaña difícil técnicamente con los estudios del ratón. El paso más crítico de los estudios de la rueda de ardilla es la determinación del agotamiento, que suele variar entre los ratones individuales, y se fijó en un 80% la velocidad máxima. En nuestra propia experiencia de la grabación de los resultados pueden diferir considerablemente entre los investigadores individuales, ya que los criterios de agotamiento son en su mayoría subjetiva. De este modo, la aplicación coherente de los mismos criterios durante la grabación es crítica.

La aparición natural de la menopausia se caracteriza por el agotamiento de los folículos primordiales de ovario a través de la atresia, resultando eventualmente en la senescencia de ovario. En los Estados Unidos, más del 30% de toda la vida de la mujer se gastará después de la menopausia. En respuesta a una disminución de la función ovárica, pueden ocurrir varias consecuencias fisiológicas y psicológicas, incluyendo el aumento de la adiposidad, la inestabilidad vascular, y el estado de ánimo o trastornos del sueño. Debido al aumento de la obesidad / adiposidad en comparación con sus homólogos premenopáusicas 1,2, las mujeres posmenopáusicas son particularmente más susceptibles al síndrome metabólico y las comorbilidades asociadas, incluyendo la enfermedad cardiovascular (ECV) 3. Por otra parte, cada vez es más evidente que la rehabilitación cardiaca exitosa para los pacientes con ECV incluye el ejercicio aeróbico regular, y que el ejercicio reduce la morbilidad y mortalidad cardiovascular en estos temas 4,5. Sin embargo, ¿cómo cha capacidad de ejercicionges durante la transición de pre-a post-menopáusicas no ha sido bien estudiada. Más importante aún, el papel del ejercicio como medida preventiva por riesgo de las enfermedades cardiovasculares en las mujeres post-menopáusicas sigue siendo muy poco estudiada. El modelo inducible más comúnmente utilizado para imitar la menopausia en las mujeres es el ovariectomizadas (OVX) de roedores. Recientemente, el químico diepóxido 4-vinilciclohexeno ocupacional (VCD) se ha demostrado que dirigirse específicamente a pequeños folículos ováricos primarios y primordiales mediante la aceleración del proceso natural de la atresia, en última instancia, resulta en insuficiencia ovárica sin toxicidad evidente que se encuentra en otros tejidos 6. El ciclo estral de los ratones tratados con VCD, que es análoga a un ciclo menstrual humano, deja a los 2-3 meses después de la finalización de las inyecciones de VCD, que a su vez se traduce en una retirada gradual de los estrógenos, la imitación de la peri y post-menopáusicas transición. Así, un folículo agotan, animal ovario intacto se aproxime a la humana naturalprogresión a través del pre-peri-a la transición post-menopáusica 7-9. Además, proporciona una alternativa no quirúrgica a la modelo OVX reducir las complicaciones de la cirugía, como la infección. En este estudio, se emplearon ratones de la menopausia inducida VCD-para estudiar el impacto del ejercicio sobre la adaptación cardiaca en ratones de la menopausia. Hay varios casos que sugieren que la asociación entre el estrógeno y el ejercicio de la rueda de jaula en roedores de ambos sexos 10-13. Agotamiento de estrógeno por quirúrgica OVX reduce la actividad ejercicio voluntario en ratones y ratas 14,15. Dos métodos de ejercicio se utilizaron en este estudio para probar la capacidad de ejercicio de los ratones de la menopausia inducida por VCD. Rueda de la jaula de funcionamiento es generalmente considerado como un tipo de ejercicio voluntario en modelos animales y se realizó, presumiblemente, en condiciones menos estresantes. Sin embargo, la rueda de la jaula correr no es indicativo de la capacidad de ejercicio relativo de los animales, lo que requiere que los animales exerciSE a niveles mucho más altos. De esfuerzo forzado se utilizó para determinar la capacidad de ejercicio, medida como una tolerancia a la intensidad del ejercicio y la resistencia. Además, hemos demostrado que el ejercicio de la rueda jaula proporciona un estímulo para la hipertrofia cardíaca y este crecimiento hipertrófico es dependiente del sexo 16. Por lo tanto, también medimos la adaptación cardiaca al ejercicio rueda de jaula en ratones de la menopausia inducida-VCD.

<table><tbody><tr><td>4-Vinilociclohexeno diepóxido (VCD)</td><td>Sigma</td><td>V-3630</td><td></td></tr><tr><td>Rueda de 11,5 cm de diámetro con una superficie de carrera de 5,0 cm de ancho</td><td>Petsmart</td><td>modelo 6208</td><td></td></tr><tr><td>Contador magnético digital</td><td>Sigma Sport</td><td>modelo BC 600</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de correr</td><td>de ejercicio Columbus Instruments</td><td>modelo 1055SDRM</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones

A Method to Study the Impact of Chemically-induced Ovarian Failure on Exercise Capacity and Cardiac Adaptation in Mice

El riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV) se incrementa en mujeres post-menopáusicas, sin embargo, el papel del ejercicio, como una medida preventiva para el riesgo de ECV en mujeres post-menopáusicas que no se ha estudiado adecuadamente. En consecuencia, se investigó el impacto del ejercicio jaula ruedas voluntaria y de esfuerzo forzado en la adaptación cardiaca en ratones de la menopausia. El modelo inducible más comúnmente utilizado para imitar la menopausia en las mujeres es el ovariectomizadas (OVX) de roedores. Sin embargo, el modelo OVX tiene algunas diferencias de la menopausia en los seres humanos. En este estudio, se administró diepóxido 4-vinilciclohexeno (VCD) a ratones hembra, lo que acelera la insuficiencia ovárica como un modelo alternativo de la menopausia para estudiar el impacto del ejercicio en ratones de la menopausia. VCD acelera selectivamente la pérdida de folículos primarios y primordiales que resulta en un estado endocrino que imita la progresión natural desde la pre-peri y post-menopausia en los seres humanos. Para determinar el impacto del ejercicio sobre el ejerciciode la capacidad y la adaptación cardiaca en ratones hembra VCD tratados, se utilizaron dos métodos. En primer lugar, nos exponemos a un grupo de ratones VCD-tratadas y sin tratar a una rueda jaula voluntaria. En segundo lugar, hemos utilizado ejercicios de rutina obligada a determinar la capacidad de ejercicio en un grupo de ratones VCD tratados y no tratados separados medidos como la tolerancia a la intensidad del ejercicio y la resistencia.

Un protocolo experimental típico, tal como el utilizado en este estudio, se ilustra en la Figura 1. Después de 20 días consecutivos de tratamiento de VCD, se utilizó la citología vaginal para determinar la presencia o ausencia de ciclicidad en los ratones inyectados con VCD; También se monitorizaron los ratones inyectados con vehículo. La etapa en el ciclo de estro se determinó mediante la proporción de células epiteliales, células epiteliales queratinizadas, y leucocitos en el frotis vaginal (Figura 2A). La presencia de células epiteliales sólo cornificadas indicó el ratón estaba en celo, y por lo tanto todavía iba en bicicleta. El ciclo estral en ratones típicamente dura 4 días, por lo tanto, VCD inyecta animales se consideraron acíclico después de 15 días de diestro persistente, en el que la citología vaginal reveló una mayoría de los leucocitos (Figura 2A). El ciclo estral de los ratones tratados con VCD se convirtió en irregular, y luego cesó el plazo de 2-3 meses después del inicio de las inyecciones de VCD (Figura 2B) </strong&gt;. Tejido ovárico VCD mostró atrofia significativa, en comparación con los controles. A mayor aumento, vemos un agotamiento completo de los folículos primarios y primordiales (Figura 2C). Para probar el efecto de la insuficiencia ovárica inducida VCD-sobre el rendimiento del ejercicio, nos aleatorios de 7 meses VCD-y los ratones tratados con vehículo (dos cepas, C57BL / 6 y B6C3F1) a cualquiera de las ruedas grupos de ejercicios sedentarios o jaula de 4-6 semanas después de la cese de ciclismo (Figura 1). Se registraron los valores de ejercicio diario para el tiempo y la distancia para cada animal ejercido durante todo el período de ejercicio de 4 semanas. Promedios semanales de los valores diarios de funcionamiento de la distancia, tiempo y velocidad se muestran en la Figura 3 para C57BL / 6 ratones tratados con vehículo o VCD. No vimos diferencias significativas en el rendimiento del ejercicio medido por el tiempo medio diario, la distancia y la velocidad en la rueda de la jaula entre-y VCD grupos tratados con vehículo, ya sea en C57BL / 6 o B6C3F1 ratóndeformación (Figura 4 A). Las velocidades de las ruedas de marcha calculadas aumentaron gradualmente durante el período de funcionamiento de 4 semanas como se muestra anteriormente 16, pero no fueron significativamente diferentes entre los grupos experimentales. Estos estudios indican que el impacto de la insuficiencia ovárica inducida VCD en el ejercicio de la rueda jaula voluntaria trasciende al menos 2 cepas de ratón. Después de la duración del protocolo de ejercicio voluntario rueda de jaula, se registraron morfometría del cuerpo y los corazones se extirparon y se pesaron rápidamente. Anteriormente hemos demostrado que el ejercicio de la rueda jaula voluntaria induce un aumento en la masa cardíaca 16. Aquí, también mostramos la hipertrofia cardíaca en respuesta a ejercicio rueda jaula mide por el peso absoluto del corazón (HW) y HW normalizó a la longitud de la tibia (TL) (Tabla 1). La masa cardíaca absoluta y relación de HW / TL fueron significativamente mayores en los ratones-y vehículos VCD tratados en comparación con los sedentarios. Sin embargo, no hubo measurables diferencias en la hipertrofia cardiaca entre el control y los ratones insuficiencia ovárica inducida VCD-siguiente ejercicio rueda jaula voluntaria. A continuación, hemos utilizado involuntaria (forzada) carrera en cinta rodante para determinar la capacidad de ejercicio. En primer lugar, los ratones sometidos a un protocolo de alta intensidad que el aumento gradual de la velocidad media de cada 10 minutos hasta el agotamiento. En promedio, la velocidad máxima de los ratones tratados con vehículo fue 26,7 ± 0,95 m / min y la velocidad máxima de VCD ratones tratados fue de 28 ± 1,4 m / min antes del agotamiento. Utilizamos de menor intensidad funcionando a 20 m / min (alrededor del 80% de máxima) para ensayar la capacidad de resistencia. Como se muestra en la Figura 4B, no se encontraron diferencias significativas en la capacidad de alta o baja intensidad de ejercicio entre el vehículo y el grupo VCD tratada, lo que indica que la insuficiencia ovárica inducida VCD-no tuvo ningún efecto sobre la capacidad de ejercicio de ratón. En conclusión, inducida por el tratamiento de la menopausia VCD no tiene efecto en R ya sea voluntaria o forzada<html> capacidad Unning, así como la respuesta de adaptación cardiaca para hacer ejercicio. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1.jpg" /> Figura 1. VCD-administración y protocolo experimental. Ratones se les administró VCD (160 mg / kg) o aceite de sésamo (control de vehículo) a partir de 2 meses de edad durante 20 días consecutivos. Después de VCD o vehículos inyecciones, ciclos de estro fueron controlados y ciclicidades se determinaron como se describe en la sección Métodos. La pérdida de función ovárica se produjo dentro de 60-90 días y se confirmó por citología vaginal. A los 7 meses de edad, los ratones fueron expuestos a ejercicio rueda jaula voluntaria durante 4 semanas o sometidos al protocolo de ejercicio en cinta ergométrica. oad/51083/51083fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg &quot;/&gt; . Figura 2 insuficiencia ovárica inducida VCD en ratones A:. Citología de una citología vaginal sin mancha desde un vehículo de ratón inyectado demostrar las cuatro etapas del ciclo estral: 1) proestro, predominantemente formado por células epiteliales nucleadas 2) Estro, que se caracteriza por la ONU -nucleado células cornificadas; 3) metaestro, que consiste en células epiteliales nucleadas (flechas), un-nucleadas cornificadas células epiteliales (flechas) y leucocitos; 4) el diestro, que consiste principalmente de los leucocitos; y B:. Duración media (días) del ciclo estral de vehículos y grupos VCD-inyectado. Un ciclo se mide desde el primer día en estro para el primer día del siguiente período en estro. La citología vaginal comenzó aproximadamente 6 semanas después del inicio de las inyecciones. Los ciclos de celo de los animales inyectados con VCD se vuelven irregulares, en comparación con los animales inyectados con vehículos, y después de 12 ciclos de estro, la citología de todos VCD inyecta animales ya no se indica el ciclismo C:. tinción H &amp; E de tejido de ovario a los 8 meses de edad. Las secciones transversales hechas en espesor 5μm para vehículos tratados (panel izquierdo) y (panel derecho) ratones VCD tratados en 20X (panel superior) y 200X (panel inferior) de aumento. Tejido ovárico con una ampliación de 200X muestra un número de folículos en vehículo-en comparación con los ratones tratados con VCD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3.jpg" /> Figura 3. Rendimiento de la rueda jaula Voluntaria en vehículo o C57Bl/6J ratones hembras tratadas con VCD. Panel izquierdo: La distancia media marcha (km /día) por cada período de 1 semana durante el período de estudio 4 semanas el panel medio:. tiempo medio de funcionamiento (h / día) por cada período de 1 semana durante el período de estudio de 4 semanas Panel derecho:. Velocidad media marcha (km / h) para cada 1 período de la semana durante el período de estudio de 4 semanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4.jpg" /> Figura 4. Rueda jaula Voluntaria y rendimiento de la caminadora en el vehículo-y los ratones tratados con VCD. A: (panel superior) C57BL / 6 carreras de distancia media (km / día) y el tiempo empleado en la rueda (horas / día) por cada 24 horas durante el período de estudio de 4 semanas. (Panel inferior) y #160; distancia B6C3F1 marcha medio (km / día) y el tiempo empleado en la rueda (h / día) por cada 24 horas durante el período de estudio de 4 semanas B: C57BL / 6 parámetros carrera en cinta rodante.. Tiempo máximo (panel superior) y velocidad máxima (Panel Botoom) utilizando protocolos detallados en la sección de métodos.

Dos paradigmas de ejercicio se pusieron a prueba en un modelo inducido químicamente menopáusica ratón de nuevo desarrollo para examinar el impacto de la menopausia en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca al ejercicio.

Un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones

The risk of cardiovascular disease (CVD) increases in post-menopausal women, yet, the role of exercise, as a preventative measure for CVD risk in ...

El objetivo general de este procedimiento es acelerar el proceso natural de atresia folicular en los ovarios, lo que provoca insuficiencia ovárica, agotamiento del estrógeno y una hembra no cíclica, una condición que imita de cerca la menopausia. Esto se logra primero administrando durante 15 a 20 días consecutivos la sustancia química industrial dióxido de vinilciclohexeno o VCD, que se ha demostrado que ataca y destruye específicamente los folículos ováricos primarios y primordiales pequeños al acelerar su proceso natural de atresia. El segundo paso consiste en determinar el ciclo estral y la ciclicidad ovárica mediante citología vaginal, comenzando aproximadamente seis semanas después del inicio de las inyecciones de VCD.Deben observarse de 15 a 20 días de diestro persistente o de ausencia de ciclos mediante citología vaginal para confirmar la pérdida del ciclo y la falla ovárica. El paso final consiste en implementar una intervención que pueda verse afectada por la menopausia o la transición hacia la menopausia, como el ejercicio voluntario en rueda de jaula o la adaptación cardíaca. En última instancia, la actividad voluntaria en la rueda de la jaula y la adaptación cardíaca se utilizan para determinar si la menopausia disminuye la actividad en la rueda de la jaula.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la ooforectomía, es que la ooforectomía es un procedimiento quirúrgico que provoca una depleción repentina de estrógeno, a diferencia de la pérdida progresiva natural del estrógeno que ocurre durante la transición del estado premenopáusico al postmenopáusico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades metabólicas y cardiovasculares en mujeres posmenopáusicas, ya que estas son particularmente más susceptibles al síndrome metabólico y sus comorbilidades asociadas, incluyendo enfermedades cardiovasculares, en comparación con mujeres premenopáusicas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la citología vaginal son difíciles de aprender porque es necesario tener cuidado al ejecutar la técnica adecuada de extensión y al identificar el ciclo EST.Cuatro, el dióxido de vinilciclina o VCD se almacena a menos 20 grados Celsius. Para preparar el VCD para el protocolo de inyección, agregue 0,587 mililitros de VCD a un vial de dosificación limpio y complete hasta un volumen final de 10 mililitros con aceite de sésamo, tápelo y séllelo con parafilm, luego mezcle invirtiendo suavemente. Almacene a cuatro grados Celsius durante hasta siete días.Para iniciar el protocolo de inyección de VCD, pese dos ratones de dos meses de edad durante 20 días consecutivos, administre inyecciones intraperitoneales diarias de VCD a temperatura ambiente en una dosis de 160 miligramos por kilogramo, utilizando una aguja de calibre 27 durante el período de inyección. Intente alternar los sitios de inyección para reducir las posibilidades de infección local de manera similar. Inyecte a los ratones control la solución vehicular de aceite de sésamo en un volumen de 2,5 mililitros por kilogramo una vez finalizado el período de inyección.Monitoree el ciclo estral diariamente obteniendo frotis vaginales. Uno de los factores críticos para el éxito de este estudio es obtener frotis vaginales de alta calidad para la determinación citológica. Restrinja los ratones utilizando el método de sujeción por la nuca.Introduzca un gotero con 0,2 mililitros de solución salina estéril en el orificio vaginal hasta una profundidad de 0,5 centímetros. Mezcle tres veces la solución salina inyectada con el gotero y luego coloque una gota en un portaobjetos en blanco. Evalúe inmediatamente cada muestra microscópicamente utilizando un microscopio óptico estándar a 100 x para validar la insuficiencia ovárica.Posteriormente, se utilizan ratones menopáusicos inducidos por VCD para los experimentos de ejercicio. El aparato de rueda de jaula consiste en una rueda de 11,5 centímetros de diámetro con una superficie de carrera de cinco centímetros de ancho, equipada con un contador magnético digital que se activa mediante la rotación de la rueda. Antes de cada prueba de carrera en la rueda, calibre la rueda de jaula según las indicaciones del fabricante.Mida el diámetro interno de la rueda giratoria. Calcule la circunferencia e introduzca este valor en el contador digital como el tamaño de la rueda para montarla en la jaula, deslice la rueda. Pase por la rejilla superior de la jaula del animal.Sujete el soporte de la rueda al alambre de la jaula con clips sujetapapeles. Los clips deben colocarse en la parte superior del alambre, alejados del animal. Pase la parte del ordenador y cualquier cable adicional a través del alambre de la jaula.Coloque la computadora y el exceso de cable fuera del alcance del animal. Esto puede lograrse colocando un recipiente plástico de peso de tamaño mediano encima del cableado de la jaula para sostener la computadora y el exceso de cable. A continuación, fije la parte de la computadora del contador magnético digital al soporte de la rueda.Utilice cinta adhesiva para fijar el imán libre del contador magnético digital a la barra central del mismo lado que el cable del imán hacia la computadora. Vuelva a colocar suficiente cinta para proteger el imán de posibles daños por mordeduras. El imán debe colocarse de manera que cada rotación de la rueda sea registrada por la computadora sin ninguna interferencia ni resistencia que impida la rotación completa de la rueda.Coloque la rueda giratoria en la rueda. Sujétela insertando los postes del soporte en los orificios de montaje ubicados en las barras centrales de la rueda. Asegúrese de que la rueda pueda girar libremente.El montaje debe vigilarse diariamente en busca de daños por mordedura y repararse según sea necesario durante el experimento. Ratones hembra consanguíneos de siete meses de edad, C 57, black six y B six C3 F1 de una misma camada, se asignan aleatoriamente a un régimen de ejercicio o al control sedentario. ¿Cómo se mantienen los animales experimentales individualmente? En una jaula de 47 por 26 por 14,5 centímetros con acceso libre a una rueda para jaula durante 28 días, los animales control se mantienen juntos en una jaula sin rueda.Proporcione a todos los animales agua y alimento estándar para roedores. Agregue lido y registre manualmente los valores diarios de la distancia recorrida y el tiempo total dedicado a correr, proporcionados por el contador magnético. Registre los valores de distancia y tiempo dentro del mismo período de una hora cada día, para obtener valores precisos y consistentes durante los 28 días del período de ejercicio. Después de cada registro diario, limpie el contador magnético para asegurar lecturas precisas al día siguiente.Al finalizar el período específico de ejercicio, se registra el peso corporal de los animales sacrificados antes de la recolección de tejidos. Para exponer el corazón, realice una incisión medial en el lado ventral, abra el diafragma y visualice rápidamente el corazón. Extraiga el corazón en su base y colóquelo en solución salina tamponada con fosfato fría para lavar adecuadamente la sangre ventricular residual. Elimine el tejido excesivo del corazón, pese el corazón completo y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido si se desea.Recolecte tejidos adicionales, lávelos con una solución modificada de salina tamponada con fosfato fría con hielo y congele rápidamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. En este estudio, se indujo la falla ovárica mediante tratamiento con VCD y se confirmó mediante examen microscópico de frotis vaginales. La etapa del ciclo esra se determina por la proporción de células epiteliales, células epiteliales cuantificadas y leucocitos en células epiteliales nucleadas PROEs, que predominan.Aquí las flechas indican células nucleadas durante el estro, mientras que las células escamosas epiteliales predominantemente no nucleadas son cuantificadas. El estro se caracteriza por una mezcla de tipos celulares con predominancia de leucocitos. El diestro está dominado por leucocitos.El ciclo estro en ratones normalmente dura cuatro días antes de la inyección de VCD. Se consideró que los animales eran acíclicos tras 15 días de diestro persistente. Esta figura muestra la duración promedio en días del ciclo estro extra de los grupos inyectados con vehículo y con VCD.Un ciclo se mide desde el primer día del estro hasta el primer día del siguiente periodo. En el estro, la citología vaginal comenzó aproximadamente seis semanas después del inicio de las inyecciones. Se observó que los ciclos estros de los animales inyectados con VCD se volvieron irregulares en comparación con los animales inyectados con vehículo, y tras 12 ciclos estros, la citología de todos los animales inyectados con VCD ya no indicaba ciclado al finalizar el protocolo de inyección de VCD. La tinción con hematoxilina y eosina (H y e) de secciones transversales del tejido ovárico reveló una atrofia significativa en el tejido ovárico tratado con VCD en comparación con los controles.Al observarse con un aumento de 20x a 200 aumentos, se observó una depleción completa de folículos primarios y primordiales en el tejido tratado con VCD. A diferencia del tejido tratado con vehículo, se evaluó el efecto del fracaso ovárico inducido por VCD sobre el rendimiento en el ejercicio en ratones de siete meses de edad, tratados con VCD o con vehículo, de dos cepas; los valores diarios de ejercicio en rueda de jaula se registraron durante un período de cuatro semanas para tiempo y distancia de cada animal ejercitado. Esta figura muestra los promedios semanales de los valores diarios de corrida para distancia, tiempo y velocidad.Para ratones C57, negros seis, tratados con vehículo o con VCD, no se observaron diferencias significativas en el rendimiento físico medido por la distancia media diaria recorrida ni en el tiempo dedicado a la rueda entre los grupos tratados con VCD y los tratados con vehículo, ni en la cepa C57, negros seis ni en la cepa B6C3F1. Esto indica que el impacto de la insuficiencia ovárica inducida por VCD sobre el ejercicio voluntario en la rueda trasciende al menos dos cepas murinas tras la duración del protocolo de ejercicio voluntario en jaula. Se registraron las morfometrías corporales y los corazones fueron rápidamente extraídos y pesados, en concordancia con observaciones previas.Se observó hipertrofia cardíaca en respuesta al ejercicio en rueda de jaula, medida por el peso absoluto del corazón y el peso cardíaco normalizado respecto a la longitud tibial. Aunque la masa cardíaca absoluta y la relación entre peso cardíaco y longitud tibial fueron significativamente mayores en los ratones tratados con vehículo y VCD en comparación con sus contrapartes sedentarias, no hubo diferencias medibles en la hipertrofia cardíaca entre el control y la insuficiencia ovárica inducida por VCD. Finalmente, tras el ejercicio voluntario en rueda de jaula, los ratones tratados con VCD y con vehículo fueron sometidos a carrera forzada en cinta rodante para determinar sus capacidades de ejercicio tanto a alta como a baja intensidad.En el protocolo de alta intensidad, la velocidad promedio de la cinta se incrementó progresivamente cada 10 minutos hasta que los ratones mostraron signos de agotamiento. En promedio, la velocidad máxima de los ratones tratados con vehículo fue de 26,7 ± 0,95 metros por minuto, y la velocidad máxima de los ratones tratados con VCD fue de 28 ± 1,4 metros por minuto antes del agotamiento. Se utilizó una corrida de baja intensidad a 20 metros por minuto para evaluar la capacidad de resistencia.En promedio, el tiempo máximo de los ratones tratados con vehículo fue de 28,3 ± 1,3 minutos, y el tiempo máximo de los ratones tratados con VCD fue de 29,7 ± 1,4 minutos antes del agotamiento. No se encontraron diferencias significativas en la capacidad de ejercicio de alta o baja intensidad entre los grupos tratados con vehículo y con VCD, lo que indica que la insuficiencia ovárica inducida por VCD no tuvo efecto sobre la capacidad de ejercicio de los ratones. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en los campos de las ciencias celulares, moleculares y fisiológicas exploraran el papel de la menopausia en roedores.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar las inyecciones VCD adecuadas, ejecutar la citología vaginal e implementar una intervención fisiológica.

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El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir En Vivo Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Aquí, presentamos un protocolo para la modulación del sistema de nervioso autónomo intracardiaca y la evaluación de su influencia en la electrofisiología básica, arritmogénesis y campo dinámica utilizando una configuración de Langendorff ex vivo .

Impacto de las neuronas intracardiacas sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en un sistema de Langendorff Ex Vivo

Aprenda a inducir menopausia química con VCD en ratones para evaluar capacidad de ejercicio y adaptación cardíaca. Este método permite estudiar los efectos del fallo ovárico en la fisiología cardiovascular.

Un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones (Video) | JoVE Journal

Un método para estudiar el impacto de la falla ovárica inducida químicamente en la capacidad de ejercicio y la adaptación cardiaca en ratones

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