Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

El objetivo general de este procedimiento es generar glicoproteína de superficie purificada correctamente plegada para ensayos inmunológicos y experimentos de vacunación. Esto se logra clonando primero los genes recombinantes portadores de BMid de la influenza, seguido de la generación de virus baula recombinantes. El segundo paso es utilizar estos virus baula recombinantes para expresar las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa en células de insectos.

A continuación, las proteínas recombinantes se purifican a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad. El paso final es caracterizar estas proteínas para garantizar una buena calidad y funcionalidad biológica. En última instancia, las proteínas recombinantes se utilizan para investigar las respuestas inmunitarias a las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la expresión bacteriana de HA uno, por ejemplo, es que los antígenos purificados son plegados correctivos y también permanecen biológicamente activos, a diferencia del uso de preparaciones de virus completos para ensayos inmunológicos. Estos reactivos permiten medir las respuestas inmunitarias frente a la hemaglutinina y las proteínas no neuraminidasas. Solo Comience este protocolo con la generación del virus baula recombinante como se describe en el protocolo de texto trabajando asépticamente en una placa de campana de flujo laminar, SF nueve células de insecto en placas de seis pocillos a una densidad de 200, 000 células por centímetro cuadrado.

Y sentémonos durante 20 minutos en una incubadora a 28 grados centígrados sin CO2. A continuación, mezcle dos microgramos de recombinante back mid con 100 microlitros de Trico Leia knee medium formulation HINK o TNM fh. A continuación, mezcle seis microlitros del agente de transfección con 100 microlitros de medio de insecto TNM FH.

Combine los dos volúmenes, mezcle suavemente y deje reposar la mezcla de transfección durante 20 minutos. A temperatura ambiente, incluya una transfección simulada como control, que contenga el reactivo de transfección pero no ADN. Retire el SNAT de las células SF nueve placada y reemplácelo con dos mililitros de medio TNM FH libre de suero que contenga una solución de estreptomicina de penicilina al 1%.

Agregue el volumen completo de la mezcla de transfección a las celdas y agite la placa de seis pocillos con cuidado durante cinco segundos. Incubar en una incubadora a 28 grados centígrados sin CO2 durante seis horas. Reemplace el medio con medio TNM FH completo nuevo antes de incubar la placa en las mismas condiciones durante seis días.

Revise las células de vez en cuando con un microscopio. Las células infectadas suelen parecer más grandes. Los más redondos tienen núcleos agrandados y comienzan a desprenderse.

Recolectar las células seis días después de la transfección por centrifugación a 2000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante contiene el virus baula recombinante y se utilizará para generar existencias de trabajo de inmediato, o puede almacenarse a cuatro grados centígrados durante años. Verifique la expresión de proteínas a través de la página SDS y Western blot y prepare las existencias de trabajo como se describe en el protocolo de texto.

Las células SF nueve apoyan muy bien el crecimiento del virus macular. Sin embargo, su capacidad para secretar grandes cantidades de proteína recombinante es limitada. Por lo tanto, utilizamos otra línea celular de insectos.

Choca los cinco con las células para la expresión de proteínas recombinantes secretadas. Estas células no favorecen el crecimiento del virus balo a títulos altos, pero tienen una capacidad secretora muy alta. Cultive cinco células en un medio de cultivo de células de insectos SFX en matraces de 175 centímetros cuadrados cada dos días.

Dividiéndolos en una proporción de uno a tres. Cultive cinco matraces confluentes para un cultivo de expresión de 200 mililitros para cosechar e infectar las cinco células altas. Primero, separe las cinco celdas golpeando los frascos.

Recoja la suspensión celular y transfiérala a tubos de centrifugación de 50 mililitros. Girar los tubos a 1200 G durante siete minutos a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante por decantación y unir los pellets por resus, suspendiéndolos en 15 mililitros de caldo P tres.

Deje reposar las células durante 15 minutos en la campana de flujo. Transfiera 200 mililitros de medio de cultivo SFX de alto clon a un matraz agitador limpio y estéril de 1000 mililitros. A continuación, transfiera la suspensión de tres celdas P al sello del matraz agitador con papel de aluminio estéril antes de agitar a 70 RPM y 28 grados Celsius durante 72 a 96 horas.

Recolectar proteína recombinante de sobrenadantes de alta expresión celular a las 72 a 96 horas después de la infección. Transfiera los sobrenadantes de cultivo a cubos de centrifugación de 500 mililitros. Centrifugar a 5.500 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Mientras tanto, enjuague el matraz agitador tres veces con agua destilada doble. Siguiente pipeta. Tres mililitros de lechada de resina de níquel en un tubo de 50 mililitros con 45 mililitros de PBS por cada 200 mililitros de cultivo.

Agitar bien antes de centrifugar durante 10 minutos a 3000 g y a temperatura ambiente después de la centrifugación. Decantar el PBS y conservar el pellet. Mezcle el sobrenadante de células de insectos con la pelletza de resina de níquel y transfiéralo a los matraces agitadores ya enjuagados.

Incubar a cuatro grados centígrados durante dos a cuatro horas mientras se agita. A continuación, monte una columna de polipropileno de 10 mililitros en una abrazadera en un soporte de soporte. Retire ambas tapas y coloque un vaso de precipitados debajo de la columna para recoger el flujo.

Después de la incubación del matraz agitador, comience a transferir la mezcla de lodo sobrenadante a la columna. Retendrá la resina de níquel y solo fluirá el sobrenadante. Pase todo el volumen sobre la columna.

Lavar la resina cuatro veces con 15 mililitros de tampón de lavado. Deje que el tampón de lavado se drene de la columna y cierre el lado inferior con la tapa. Añadimos dos mililitros de tampón elucian y nos sentamos cinco minutos.

Abra la columna y recoja el eit, manteniéndolo sobre hielo húmedo siempre que sea posible. Repite esto tres veces más. Un EIT que contiene altas concentraciones de proteína generalmente muestra espuma cuando se agita para intercambiar el tampón y concentrar la proteína primero, unidades de centrifugación de ultrafiltración de 15 mililitros de giro libre con PBS a 3000 G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Deseche el flujo y cargue el EIT en la columna de centrifugado. Llene la columna con cinco mililitros de PBS estéril y helado antes de centrifugar en las mismas condiciones durante 60 minutos. Vuelva a descargar el flujo, vuelva a llenar con 15 mililitros de PBS helado y centrifugue durante 60 minutos adicionales.

Repita este procedimiento una vez más, luego recoja el concentrado de tampón intercambiado que representa la proteína recombinante altamente concentrada. Mantenga el concentrado en hielo en todo momento. Enjuague la columna de centrifugado con 400 microlitros de PBS estéril y frío y agréguelo al concentrado.

A continuación, la proteína puede caracterizarse como se describe en el protocolo de texto. Las proteínas HA y NA expresadas por las cepas ENUE y Shanghai mostraron niveles de expresión moderados, que oscilaron entre 0,2 miligramos por litro de cultivo para la influenza A recolectada en Shanghai y 0,7 miligramos por litro para la influenza. El A recogido en las moléculas de enue, neuraminidasa o NA de ambas cepas mostró niveles de expresión moderados que oscilaron entre los 0,2 miligramos por litro de cultivo para la gripe A recogidos en Shanghái y los 0,7 miligramos por litro para la gripe A recogida en enue.

Las cuatro preparaciones proteicas tenían muy pocas o ninguna impureza, siendo el ha de mayor pureza que el nas, lo que puede explicarse por el nivel de expresión. La influenza A recolectada en Shanghái, HA, se analizó más a fondo utilizando ELI SA con el anticuerpo monoclonal humano reactivo del tallo ampliamente neutralizante CR 9 1 1 4. Como se muestra aquí en azul, este anticuerpo monoclonal se une a un epítopo de confirmación sensible en el dominio stock y se utiliza aquí como sonda para el plegamiento correcto de este dominio.

El anticuerpo muestra una buena unión, como lo demuestra el aumento de la absorbancia a 490 nanómetros, lo que da confianza en que el AH está plegado correctamente. Se realizó un segundo estudio Eliza con suero policlonal de ratón anti hemaglutinina del subtipo siete para confirmar la identidad de la proteína obtenida como hemaglutinina de origen del subtipo siete. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo expresar las proteínas recombinantes del virus de la influenza, la hemaglutinina y la neuraminidasa en su laboratorio.

Este proceso también podría ser útil para la expresión de otras proteínas virales o de membrana celular. Te deseo buena suerte con tus experimentos.