Name: Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprende a expresar hemaglutinina y neuraminidasa funcionales del virus H7N9 utilizando el sistema de baculovirus en células de insecto. Este método permite obtener proteínas correctamente plegadas para ensayos inmunológicos y estudios de vacunación.

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Nos gustaría dar las gracias a Patrick C. Wilson para CR9114 anticuerpo monoclonal. También agradecemos a Jennifer Debeauchamp y Richard Webby para los plásmidos originales A/Anhui/1/13. Soporte parcial para este trabajo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas-financiado Proyecto Programa de Subvención AI097092-01A1 y CEIRS (Centros de Excelencia para la Investigación de la Influenza y Vigilancia, HHSN26620070010C). FK fue apoyado por una beca de Erwin Schrödinger (3232 J) del Fondo de Ciencias de Austria (FMF).

1. Generación de baculovirus recombinante <ol><li> Clonación en transferencia de plásmidos de baculovirus <ol><li> Clon H7 HA y NA N9 ectodominio (o cualquier otro gen HA o NA) en plásmidos de transferencia pFastBac modificados (véase la introducción). Vectores para HA que contiene un dominio de trimerización C-terminal y una etiqueta de hexahistidina, así como para NA que contiene un dominio de tetramerización N-terminal y la etiqueta de hexahistidina, se han descrito 1,10,11,22 (Figura 1) y pueden ser solicitada desde los autores. Nota explicativa: ectodominios HA expresadas sin un dominio de trimerización se pliegan de forma incorrecta, lo que lleva a la pérdida de epítopos neutralizantes conformacionales, especialmente en el dominio de tallo. Del mismo modo, la función enzimática de NA se basa en tetramerización adecuada. </li><li> Generación de bácmidos Transformar de transferencia de baculovirus-plásmidos que contienen los genes HA y NA en bacterias DH10Bac de acuerdo con una de expresión de baculovirussistema según las instrucciones del fabricante. Aislar y purificar bácmidos utilizando un kit Midiprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 2). </li></ol></li><li> Rescate de baculovirus recombinante y la verificación de la expresión de proteínas Nota explicativa: Los siguientes pasos se deben realizar de forma aséptica en una campana de flujo laminar. Realice este procedimiento independiente para HA y NA (o cualquier otro gen de interés). Las células de insecto son generalmente cultivadas a 28 ° C sin CO 2. Células Sf9 para este protocolo se cultivan en medios completos de células de insecto TNM-FH suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen-Strep * y solución Pluronic F68 0,1%, si no se indica lo contrario, y se pasaron 1:04 dos veces a la semana. Células High Five se cultivan en suero libre de los medios de comunicación SFX y se pasaron 1:15 dos veces a la semana. * La adición de antibióticos debe ser considerada opcional en todo el protocolo y ajustarse de acuerdo con las prácticas utilizadas en cada laboratorio. <ol><li> Placa células de insecto Sf9 en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células / cm 2 y deje reposar durante 20 minutos en una incubadora de 28 ° C (sin CO 2). </li><li> Mezcle 2 g (concentración 0,5-2 mg / l) de bácmido recombinante con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, 1% Pen-Strep). Mezclar 6 l de agente de transfección con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, Pen-Strep). Combinar los dos volúmenes, mezclar suavemente y dejar reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente (mezcla de transfección). Incluya una maqueta de transfección como control (Figura 3). </li><li> Aspirar el sobrenadante de las células Sf9 chapados (células serán ahora se adhieren a la placa) y reemplazar con 2 ml de medio TNM-FH libre de suero que contenía Pen-Strep (1%). Añadir el volumen total de la mezcla de transfección (del paso 1.2.2) y el rock de la placa de 6 pocillos cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO 2 durante 6 horas (Figura 3). </li><li> Reemplace wi mediosmedios th frescas completo TNM-FH (que contienen 10% de FBS, 1% de Pen-Strep y 0,1% de Pluronic F68). Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO 2 durante 6 días. Compruebe células de vez en cuando bajo un microscopio. Las células infectadas suelen aparecer más grande, más redondo, se han ampliado los núcleos, y comienzan a desprenderse (Figura 4). </li><li> Cosecha de células y la confirmación de la expresión de la proteína <ol><li> Células Cosecha 6 días después de la transfección por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante contiene el baculovirus recombinante - esto se utiliza para generar reservas de trabajo de inmediato, o se puede almacenar a 4 ° C por año. </li><li> Para comprobar la expresión de proteínas recoger pellets y resuspender en 500 l de PBS. Mezclar 50 l de la suspensión con 50 l de tampón SDS-PAGE de carga (que contiene un agente reductor). Ejecutar SDS-PAGE y realizar un análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-hexahistidina para confirmar la expresión de genes. Incluya las células de la maquetatransfección como controles negativos (Figura 3). </li></ol></li><li> Preparación de las reservas de trabajo <ol><li> La placa 5 x 10 5 células Sf9 / cm 2 en un matraz T175 cm 2 y deje reposar por 20 min les permiten adherirse al plato. Reemplace completa medios TNM-FH con medios TNM-FH que contiene 3% de SFB (y 1% Pen-Strep, 0,1% de Pluronic F68). </li><li> Infectar las células con 100 l del sobrenadante de rescate. Incubar en una incubadora de 28 ° C y sin CO 2 durante 6 días y comprobar de vez en cuando si las células se infectan (como se describe en el paso 1.2.5.). </li><li> Giran a 2000 x g a temperatura ambiente durante 5 min y se recoge el sobrenadante. Esta es ahora tu P2 de valores. Esta acción se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C. Repita el procedimiento de infección usando 100 l de la población P2 para infectar células. La acción resultante se denomina P3 o de stock de trabajo, que se puede almacenar a 4 º C o se usa directamente para la expresión de la proteína. El P3 valores por lo general contiene 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 unidades formadoras de placa / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Expresión y Purificación de Proteínas Nota explicativa: células Sf9 apoyar el crecimiento de baculovirus muy bien. Sin embargo, su capacidad para secretar grandes cantidades de proteína recombinante es limitada. Por ello utilizamos otra línea de células de insecto, células High Five, para la expresión de proteínas recombinantes secretadas. Estas células no apoyar la replicación de baculovirus a títulos muy altos 13 pero tienen alta capacidad secretora. <ol><li> Al crecer las células High Five Se cultivan las células High Five en SFX medio de cultivo de células de insecto en T175 cm 2 frascos. Pasaje cada otro día 01:03. Por una cultura 200 ml expresión tendrá que crecer matraces confluentes 5. </li><li> La cosecha y la infección de células High Five <ol><li> Separe las células High Five de 5 T175 cm 2 frascos tocando los frascos con la mano. Recoger el suspe celularnsion y transferir a tubos de 50 ml de centrifugación. </li><li> Gira a 1.200 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante por decantación y unir los gránulos mediante resuspensión en 15 ml de stock P3. </li><li> Deje reposar durante 15 minutos en la campana de flujo (Figura 5). </li><li> Transferir 200 ml de medio de cultivo Hyclone SFX en un estéril 1,000 ml frasco agitador limpio (sin buffles, sellado con papel de aluminio antes de esterilizar, no debería haber sido utilizado para cultivos de bacterias antes). </li><li> Transferir la suspensión P3/cell en el matraz agitador. Selle con papel de aluminio estéril y frasco de transferencia en una coctelera. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas. </li></ol></li><li> La cosecha de la proteína recombinante de High Five sobrenadantes de expresión de células <ol><li> 72-96 h después de la infección de transferencia de los sobrenadantes del cultivo en 500 ml cubos de centrifugación. Gira a 5.500 xg durante 20 min a 4 ° C. Mientras tanto enjuague los matraces de agitación 3 veces con agua bidestilada(DdH2O). </li><li> Transferencia de 3 ml de suspensión de Ni-resina en un tubo de 50 ml con 45 ml de PBS (uno necesita por 200 ml de cultivo). Agitar bien y centrifugar a 3000 xg a temperatura ambiente durante 10 min. Decantar el PBS y mantener el pellet. Mezclar el sobrenadante de células de insecto con el sedimento de Ni-resina y transferir en los matraces de agitación ya enjuagados. Se incuba a 4 º C durante 2-4 horas, mientras se agita (Figura 6). </li><li> Columna de polipropileno ml Monte 10 en una pinza en un soporte de apoyo. Retire las dos tapas y coloque un vaso debajo de la columna para recoger el flujo a través (de residuos). Tome el matraz de agitador de la coctelera y empezar a transferir la mezcla de sobrenadante / suspensión sobre la columna; retendrá la resina Ni-y sólo el sobrenadante fluirá a través. Pasar todo el volumen sobre la columna (Figura 7). </li><li> Lavar los 4x de resina con 15 ml de tampón de lavado (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Deje que todo el drenaje de tampón de lavadode la columna y cerrarlo con la tapa (lado inferior). </li><li> Añadir 2 ml de tampón de elución (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8) y dejar reposar durante 5 minutos. Abra la columna y recoger el eluido. Repita esto 3 veces más (un total de 8 ml de tampón de elución). El eluato que contiene altas concentraciones de proteína típicamente muestra de espuma cuando se agitan (Figura 7). Mantenga eluido en hielo húmedo siempre que sea posible. </li></ol></li><li> El cambio de tampón y la concentración <ol><li> Prespin 15 ml unidades de centrifugación de ultrafiltración (30 kDa de corte para HA / NA, pero puede variar dependiendo del tamaño de la proteína purificada) con PBS (pH 7.4 a 7.6) a 3.000 xga 4 º C durante 20 min. Deseche el flujo a través y eluido carga sobre la columna de centrifugación. Llenar con 5 ml de, helada PBS estéril y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C. </li><li> Flujo de descarga a través de nuevo, vuelva a llenar con 15 ml de PBS helado y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C. Repita este procedimientoDuré una vez más. </li><li> Tome la columna de centrifugación de la centrífuga y se recoge el tampón intercambiado concentrado (típicamente 200 l). Esto está muy concentrado de proteína recombinante. Enjuague la columna de centrifugación con 400 l de hielo frío PBS estéril y añadir este al concentrado. Mantener el concentrado en hielo en todo momento. </li></ol></li></ol> 3. Caracterización y Control de Calidad <ol><li> Medición de la concentración de proteínas Tomar una alícuota del concentrado y medirlo usando su método de cuantificación de proteínas de elección. Establecer la concentración de proteínas a 1 mg / ml mediante la adición de PBS y congelar pequeñas alícuotas a -80 ° C. Ciclos de congelación y descongelación dañan la estructura de la proteína y pueden conducir a la agregación. </li><li> SDS-PAGE y tinción de Coomassie Correr 500 ng de su proteína en una SDS-PAGE y realizar una tinción de Coomassie. Para la tinción rápida y conveniente utilizar el reactivo de Coomassie en combinación con un protocolo de microondas. Proteínas HA suelen aparecer a los 64 añoskDa mientras que las proteínas NA deben ejecutar en un tamaño de alrededor de 56 kDa (Figuras 8A y B). Utilizando el protocolo descrito no debería ver cualquiera de los productos de degradación. Si se produce la degradación por lo general es una señal de contaminación de levadura / hongos durante la expresión. En este caso, repita el procedimiento y asegúrese de mantener todo estéril. </li><li> Western blot / ELISA Con el fin de verificar la identidad de proteínas se recomienda hacer para una transferencia de Western o ensayo ELISA con un anticuerpo específico. Idealmente, los ensayos de ELISA se realizan con un anticuerpo que se une a epítopos conformacionales (por ejemplo, anticuerpos anti-HA tallo 1). Uso de un anticuerpo tal el correcto plegamiento de la proteína se puede confirmar (Figura 8C). </li><li> Medición de la actividad de NA Plegamiento correcto de la NA viral también se puede determinar midiendo la actividad de NA. Se recomienda realizar esta prueba utilizando el ensayo NA * STAR disponible comercialmente (sólo tienes que seguir las directrices para el usuario). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la expresión de virus de la gripe HA y NA proteínas en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus es generalmente sencillo, hay varios puntos importantes a considerar. Es importante, como se ha señalado en la introducción, que los ectodominios de HA y NA se expresan en fusión con dominios de trimerización o tetramerización, respectivamente. Estos dominios garantizar el correcto plegado de las moléculas normalmente ayudado por el dominio de transmembrana, que no está presente si sólo el e...

Como primera respuesta a la reciente aparición de la nueva cepa del virus de la influenza H7N9 en China, adquirimos plásmidos portadores de las secuencias genómicas de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) genes de los dos primeros aislamientos. El uso de estos plásmidos que pudimos construir rápidamente los vectores de expresión de baculovirus para la producción de HA y NA recombinante en células de insecto. Este sistema de expresión está bien establecida en nuestro laboratorio y ha demostrado ser fundamental para muchos de nuestros proyectos de investigación en curso 1-8. Las células de insectos son capaces de doblar correctamente y después de la traducción modificar proteínas complejas. Estas modificaciones incluyen la glicosilación ligada a N, lo cual es importante para muchas glicoproteínas virales. Como tal, no es sorprendente que el sistema de baculovirus es bastante establecido para la expresión de antígenos de superficie del virus de la gripe. De hecho, muchas de las estructuras cristalinas de HA y NA han sido resueltos utilizando proteínas de las células de insectos expresado 9-11. Otra ventaja de lasistema se encuentra en sus rendimientos fiables de alto valor proteico de hasta 30 mg de cultivo celular HA / L (en base a nuestra experiencia con más de 50 diferentes proteínas HA) - Una consecuencia de la expresión dirigida por virus la infección por el fuerte promotor de la polihedrina. La eliminación de la transmembrana y endodominio de las proteínas HA y NA permite la expresión de versiones secretables, solubles de las proteínas y por lo tanto facilita en gran medida el proceso de purificación. Además, estos ectodominios se hexahistidina etiquetados y por lo tanto se pueden purificar utilizando cromatografía de afinidad utilizando Ni 2 +-resina. Los dominios transmembrana de las proteínas HA y NA contribuyen a la formación de homotrímero y homotetrámero, respectivamente. Con el fin de preservar estas oligomerizaciones, se añade un dominio de trimerización C-terminal para el HA-, y un tetramerización dominio N-terminal a la AN construcciones (Figura 1). Hemos demostrado de manera concluyente que tal dominio de trimerización estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionales en el tallo en el dominio de HA 1. El tetramerización correcta de la NA también podría contribuir a corregir el plegado y la función NA 10. Secuencias y vectores de baculovirus de transferencia de albergar dominios de trimerización o tetramerización pueden solicitarse a los autores o de otros laboratorios en el campo, 9,10,12. Otra cuestión importante para la expresión de proteínas secretadas en células de insecto es la elección de la línea celular de la derecha. Mientras Spodoptera frugiperda deriva células Sf9 soportan la replicación de baculovirus muy bien y se utilizan generalmente para el rescate y la propagación del virus, que tienen una capacidad de secretar grandes cantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni deriva BTI-TN-5B1-4 células (comúnmente conocidos como High Five) tener una capacidad mayor secreción y son la línea celular de elección para la expresión en este protocolo 13,14. Además, es útil para reducir o incluso eliminar el suero bovino fetal (FBS) a partir de cultivos de expresión. Por lo tanto, utilizamos los medios de comunicación con reducida (3%) Contenido de FBS para el crecimiento de las reservas de trabajo de virus, y llevamos a cabo la expresión de proteínas en medio libre de suero. Proteínas HA y NA recombinantes se utilizan para muchas técnicas inmunológicas. Tal vez la más común se encuentra en ensayos de ELISA para medir la seroconversión tras la vacunación en humanos o animales 4,6,7,15. HAs y NAS también se utilizan en ensayos de ELISPOT como ambas moléculas estimuladoras y reactivos de detección de células secretoras de anticuerpos 16. Su uso como cebos moleculares permite ordenar específicamente para plasmablasts u otros tipos de células B, que luego se pueden utilizar para aislar anticuerpos monoclonales (terapéuticos) (mAbs). Recombinantes HA y NA moléculas son más utilizados en la caracterización de estos mAb 8. Otros ejemplos incluyen el estudio de la estabilidad del pH o de la especificidad del receptor de ha expresado por diferentes cepas de virus, o cuantitativamente evaluar enzimática específica NAla actividad o la resistencia a los inhibidores. Además, recombinante, purificada de HA se puede utilizar para normalizar el contenido de HA de las vacunas de virus de la gripe inactivados. Es importante destacar que rHA (y hasta cierto punto NA) vacunas candidatas están actualmente en evaluación en modelos animales y ensayos clínicos en humanos con una vacuna candidata está autorizada por la FDA en 2013 2,17-19. La ventaja de estas nuevas vacunas es que, debido a la naturaleza recombinante de estas proteínas, el proceso de trabajo intensivo de generación de virus de genomas reordenados de alto crecimiento podría ser evitado. Quizás aún más importante es el hecho de que su rendimiento HA es alta y reproducible de cepa a cepa. También, ya que estas vacunas se producen en un sistema libre de huevo, que no contienen contaminantes proteicos que son problemáticos para individuos con alergia al huevo. Aquí hemos elegido para expresar las proteínas HA y NA de dos aislamientos del nuevo virus de influenza H7N9 Chino, A / Anhui/1/13 y A/Shanghai/1/13 20,21. Estos son ejemplos oportunos, pero el protocolo descrito se pueden utilizar para la expresión de cualquier gripe A y B proteínas HA o NA y se pueden adaptar para expresar cualquier otras proteínas virales o celulares secretadas. Proteínas transmembrana trimérica o tetraméricas pueden ser clonados en los casetes de expresión utilizados para la HA y NA, respectivamente. Sin embargo, las proteínas celulares secretadas más solubles, como los interferones, por ejemplo, no es necesario un dominio adicional para la estabilización y se pueden expresar únicamente con una etiqueta de hexahistidina C-terminal.

<table><tbody><tr><td>Nombre del material/equipo</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Sistema de expresión de baculovirus</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>Siga las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td>TNM-FH medio para insectos Gemini</td><td>Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarosa</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtros Centrigual Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Pluma</td><td>Strep Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de polipropileno (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Máxima eficiencia DH10Bac bacterias</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Filtro de plásmidos Midipure Kit</td><td>Invitrogen K210015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>para tampones de elución y lavado</td></tr><tr><td>Celdas Sf9</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five cells</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa proteínas del virus novel h7n9 influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

El sistema de expresión de baculovirus es una herramienta poderosa para la expresión de proteínas recombinantes. Aquí lo utilizamos para producir versiones correctamente plegadas y glicosilados de la influenza A virus glicoproteínas de superficie - la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). A modo de ejemplo, hemos elegido las proteínas HA y NA expresadas por el nuevo virus H7N9 que emergió recientemente en China. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para las proteínas HA y NA expresadas por cualquier otro de la gripe A y B cepas de virus. Proteínas recombinantes HA (rHA) y NA (ARN) son reactivos importantes para ensayos inmunológicos tales como ELISPOT y ELISA, y también son de uso generalizado para la normalización de la vacuna, el descubrimiento de anticuerpos, el aislamiento y la caracterización. Además, las moléculas de NA recombinantes pueden usarse para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas y son útiles para la caracterización de la función enzimática de la AN, así como su sensibilidad a los antivirales. Proteínas HA recombinantes también son being probado como vacunas experimentales en modelos animales, y una vacuna basada en HA recombinante fue autorizado recientemente por la FDA para su uso en seres humanos. El método como se describe aquí para producir estas moléculas es sencillo y puede facilitar la investigación en laboratorios de la gripe, ya que permite la producción de grandes cantidades de proteínas rápidas y a un bajo costo. Aunque aquí nos centramos en las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe, este método también puede ser usado para producir otras proteínas de superficie virales y celulares.

Moléculas de HA de A/Shanghai/1/13 y A/Anhui/1/13 expresaron bien con rendimientos de aproximadamente 20 cultura mg / l. Moléculas de NA de ambas cepas mostraron niveles de expresión moderados que van desde 0,2 mg / l de cultivo para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Los cuatro preparaciones de proteína tenían muy poco o nada de las impurezas (Figuras 8A y B) con El ser de mayor pureza que AN que puede explicarse por el nivel de expresión. A/Shanghai/1/13 HA se analizaron ...

Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

El objetivo general de este procedimiento es generar glicoproteína de superficie purificada correctamente plegada para ensayos inmunológicos y experimentos de vacunación. Esto se logra clonando primero los genes recombinantes portadores de BMid de la influenza, seguido de la generación de virus baula recombinantes. El segundo paso es utilizar estos virus baula recombinantes para expresar las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa en células de insectos.A continuación, las proteínas recombinantes se purifican a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad. El paso final es caracterizar estas proteínas para garantizar una buena calidad y funcionalidad biológica. En última instancia, las proteínas recombinantes se utilizan para investigar las respuestas inmunitarias a las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la expresión bacteriana de HA uno, por ejemplo, es que los antígenos purificados son plegados correctivos y también permanecen biológicamente activos, a diferencia del uso de preparaciones de virus completos para ensayos inmunológicos. Estos reactivos permiten medir las respuestas inmunitarias frente a la hemaglutinina y las proteínas no neuraminidasas. Solo Comience este protocolo con la generación del virus baula recombinante como se describe en el protocolo de texto trabajando asépticamente en una placa de campana de flujo laminar, SF nueve células de insecto en placas de seis pocillos a una densidad de 200, 000 células por centímetro cuadrado.Y sentémonos durante 20 minutos en una incubadora a 28 grados centígrados sin CO2. A continuación, mezcle dos microgramos de recombinante back mid con 100 microlitros de Trico Leia knee medium formulation HINK o TNM fh. A continuación, mezcle seis microlitros del agente de transfección con 100 microlitros de medio de insecto TNM FH.Combine los dos volúmenes, mezcle suavemente y deje reposar la mezcla de transfección durante 20 minutos. A temperatura ambiente, incluya una transfección simulada como control, que contenga el reactivo de transfección pero no ADN. Retire el SNAT de las células SF nueve placada y reemplácelo con dos mililitros de medio TNM FH libre de suero que contenga una solución de estreptomicina de penicilina al 1%.Agregue el volumen completo de la mezcla de transfección a las celdas y agite la placa de seis pocillos con cuidado durante cinco segundos. Incubar en una incubadora a 28 grados centígrados sin CO2 durante seis horas. Reemplace el medio con medio TNM FH completo nuevo antes de incubar la placa en las mismas condiciones durante seis días.Revise las células de vez en cuando con un microscopio. Las células infectadas suelen parecer más grandes. Los más redondos tienen núcleos agrandados y comienzan a desprenderse.Recolectar las células seis días después de la transfección por centrifugación a 2000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante contiene el virus baula recombinante y se utilizará para generar existencias de trabajo de inmediato, o puede almacenarse a cuatro grados centígrados durante años. Verifique la expresión de proteínas a través de la página SDS y Western blot y prepare las existencias de trabajo como se describe en el protocolo de texto.Las células SF nueve apoyan muy bien el crecimiento del virus macular. Sin embargo, su capacidad para secretar grandes cantidades de proteína recombinante es limitada. Por lo tanto, utilizamos otra línea celular de insectos.Choca los cinco con las células para la expresión de proteínas recombinantes secretadas. Estas células no favorecen el crecimiento del virus balo a títulos altos, pero tienen una capacidad secretora muy alta. Cultive cinco células en un medio de cultivo de células de insectos SFX en matraces de 175 centímetros cuadrados cada dos días.Dividiéndolos en una proporción de uno a tres. Cultive cinco matraces confluentes para un cultivo de expresión de 200 mililitros para cosechar e infectar las cinco células altas. Primero, separe las cinco celdas golpeando los frascos.Recoja la suspensión celular y transfiérala a tubos de centrifugación de 50 mililitros. Girar los tubos a 1200 G durante siete minutos a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante por decantación y unir los pellets por resus, suspendiéndolos en 15 mililitros de caldo P tres.Deje reposar las células durante 15 minutos en la campana de flujo. Transfiera 200 mililitros de medio de cultivo SFX de alto clon a un matraz agitador limpio y estéril de 1000 mililitros. A continuación, transfiera la suspensión de tres celdas P al sello del matraz agitador con papel de aluminio estéril antes de agitar a 70 RPM y 28 grados Celsius durante 72 a 96 horas.Recolectar proteína recombinante de sobrenadantes de alta expresión celular a las 72 a 96 horas después de la infección. Transfiera los sobrenadantes de cultivo a cubos de centrifugación de 500 mililitros. Centrifugar a 5.500 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Mientras tanto, enjuague el matraz agitador tres veces con agua destilada doble. Siguiente pipeta. Tres mililitros de lechada de resina de níquel en un tubo de 50 mililitros con 45 mililitros de PBS por cada 200 mililitros de cultivo.Agitar bien antes de centrifugar durante 10 minutos a 3000 g y a temperatura ambiente después de la centrifugación. Decantar el PBS y conservar el pellet. Mezcle el sobrenadante de células de insectos con la pelletza de resina de níquel y transfiéralo a los matraces agitadores ya enjuagados.Incubar a cuatro grados centígrados durante dos a cuatro horas mientras se agita. A continuación, monte una columna de polipropileno de 10 mililitros en una abrazadera en un soporte de soporte. Retire ambas tapas y coloque un vaso de precipitados debajo de la columna para recoger el flujo.Después de la incubación del matraz agitador, comience a transferir la mezcla de lodo sobrenadante a la columna. Retendrá la resina de níquel y solo fluirá el sobrenadante. Pase todo el volumen sobre la columna.Lavar la resina cuatro veces con 15 mililitros de tampón de lavado. Deje que el tampón de lavado se drene de la columna y cierre el lado inferior con la tapa. Añadimos dos mililitros de tampón elucian y nos sentamos cinco minutos.Abra la columna y recoja el eit, manteniéndolo sobre hielo húmedo siempre que sea posible. Repite esto tres veces más. Un EIT que contiene altas concentraciones de proteína generalmente muestra espuma cuando se agita para intercambiar el tampón y concentrar la proteína primero, unidades de centrifugación de ultrafiltración de 15 mililitros de giro libre con PBS a 3000 G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.Deseche el flujo y cargue el EIT en la columna de centrifugado. Llene la columna con cinco mililitros de PBS estéril y helado antes de centrifugar en las mismas condiciones durante 60 minutos. Vuelva a descargar el flujo, vuelva a llenar con 15 mililitros de PBS helado y centrifugue durante 60 minutos adicionales.Repita este procedimiento una vez más, luego recoja el concentrado de tampón intercambiado que representa la proteína recombinante altamente concentrada. Mantenga el concentrado en hielo en todo momento. Enjuague la columna de centrifugado con 400 microlitros de PBS estéril y frío y agréguelo al concentrado.A continuación, la proteína puede caracterizarse como se describe en el protocolo de texto. Las proteínas HA y NA expresadas por las cepas ENUE y Shanghai mostraron niveles de expresión moderados, que oscilaron entre 0,2 miligramos por litro de cultivo para la influenza A recolectada en Shanghai y 0,7 miligramos por litro para la influenza. El A recogido en las moléculas de enue, neuraminidasa o NA de ambas cepas mostró niveles de expresión moderados que oscilaron entre los 0,2 miligramos por litro de cultivo para la gripe A recogidos en Shanghái y los 0,7 miligramos por litro para la gripe A recogida en enue.Las cuatro preparaciones proteicas tenían muy pocas o ninguna impureza, siendo el ha de mayor pureza que el nas, lo que puede explicarse por el nivel de expresión. La influenza A recolectada en Shanghái, HA, se analizó más a fondo utilizando ELI SA con el anticuerpo monoclonal humano reactivo del tallo ampliamente neutralizante CR 9 1 1 4. Como se muestra aquí en azul, este anticuerpo monoclonal se une a un epítopo de confirmación sensible en el dominio stock y se utiliza aquí como sonda para el plegamiento correcto de este dominio.El anticuerpo muestra una buena unión, como lo demuestra el aumento de la absorbancia a 490 nanómetros, lo que da confianza en que el AH está plegado correctamente. Se realizó un segundo estudio Eliza con suero policlonal de ratón anti hemaglutinina del subtipo siete para confirmar la identidad de la proteína obtenida como hemaglutinina de origen del subtipo siete. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo expresar las proteínas recombinantes del virus de la influenza, la hemaglutinina y la neuraminidasa en su laboratorio.Este proceso también podría ser útil para la expresión de otras proteínas virales o de membrana celular. Te deseo buena suerte con tus experimentos.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video describe la técnica de resonancia de plasmón de superficie, o SPR, para estudiar la interacción entre dos moléculas utilizando un chip sensor. El cambio en el ángulo de resonancia y la intensidad de la luz reflejada se detectan en función de la asociación y disociación de dos moléculas, y esto proporciona información sobre las interacciones entre las dos moléculas.

Resonancia de plasmones de superficie para estudiar las interacciones biomoleculares mediante un chip sensor

Kindlins son fundamentales para la adhesión celular a través de las integrinas, pero los estudios de ellos se han visto obstaculizados por la dificultad para expresarlos de forma recombinante en huéspedes bacterianos. Se describen aquí métodos para su producción eficiente en células de insecto infectadas con baculovirus.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Los virus de la gripe A son patógenos respiratorios contagiosos que causan epidemias anuales y pandemias ocasionales. Aquí, describimos un protocolo para rastrear infecciones virales in vivo usando una nueva luciferasa recombinante y bi-reportero expreso de fluorescencia IAV (BIRFLU). Este enfoque proporciona a los investigadores una excelente herramienta para estudiar IAV in vivo.

Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.

Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Aquí describimos un protocolo para el empaquetado de pseudovirus y la medición de la actividad neutralizante de anticuerpos.

Preparación de virus de la influenza aviar H5 pseudotipificados con el método de transfección de fosfato de calcio y medición de la actividad neutralizante de anticuerpos

El presente protocolo describe nuevas herramientas para ensayos de unión a SPR para examinar la unión CV-N a HA, glicoproteína S, glicanos de tipo híbrido relacionados y oligosacáridos con alto contenido de manosa. SPR se utiliza para determinar el KD para la unión de CV-N dimérico o monomérico a estos glicanos.

Ingeniería de agentes antivirales a través de la resonancia de plasmones de superficie

Aprende a expresar hemaglutinina y neuraminidasa funcionales del virus H7N9 utilizando el sistema de baculovirus en células de insecto. Este método permite obtener proteínas correctamente plegadas para ensayos inmunológicos y estudios de vacunación.

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus (Video) | JoVE Journal

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

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