Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama que finalmente haga metástasis en presencia de un sistema inmunitario sano. Esto se logra primero mediante la administración de un adenovirus que expresa Cree en el canal ductal mamario de los animales de experimentación. A continuación, la glándula mamaria se palpa regularmente para controlar la progresión del tumor.

En última instancia, la metástasis tumoral y la infiltración de leucocitos al ganglio linfático axilar se pueden evaluar mediante análisis de citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica sobre los modelos de tumores de mama existentes es que permite el inicio preciso de tumores que pueden desarrollarse en presencia de un sistema inmunitario maduro, y que pueden ser rastreados por la expresión de YFP. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos introductorios de la inyección son difíciles de aprender.

La correcta colocación de la aguja requiere precisión y práctica. El día del experimento, almacene Eloqua de cuatro veces 10 de las unidades formadoras de octava placa de adenovirus Cree en hielo seco, descongele el virus a temperatura ambiente y mézclelo con suficiente sacarosa al 3% en agua estéril para llevar el volumen final a 10 microlitros. A continuación, mezcle suavemente 34 microlitros de mem y cuatro microlitros de cloruro de calcio recién preparado en el virus e incube la solución a temperatura ambiente.

Después de 15 a 20 minutos, el medio aparecerá turbio, lo que indica la formación de los precipitados de adenovirus. Agite suavemente el tubo para asegurarse de que las partículas del virus se distribuyan uniformemente por toda la suspensión y, a continuación, para inyectar las partículas del virus, extraiga tres microlitros del virus en una jeringa de 10 microlitros. A continuación, coloque un ratón anestesiado boca arriba en la platina iluminada de un microscopio de disección limpio.

Ilumine el abdomen con una fuente de luz adicional y localice la cuarta glándula mamaria inguinal izquierda o la novena derecha por las pequeñas manchas blancas de pelo que rodean cada pezón. Ahora frote el pezón suavemente con un aplicador estéril con punta de algodón empapado en etanol. A continuación, asegure el pezón con pinzas quirúrgicas finas y tire hacia arriba con una fuerza ligera.

Para retirar el tapón de queratina, estabilice el pezón entre las pinzas e inserte suavemente la aguja entre las puntas. Canulando el canal del conducto en un ángulo de 90 grados para garantizar la profundidad adecuada de la inyección, tire suavemente de la aguja hacia arriba después de insertarla en el lumen del conducto, tirando de la tetina hacia arriba a lo largo de los bordes de la aguja a medida que se tira hacia arriba. Cuando la aguja esté colocada correctamente, sumerja suavemente todo el contenido de la jeringa.

El pezón debe inflarse ligeramente a medida que se agrega el líquido. Después de la inyección, vuelva a colocar el ratón en la almohadilla térmica hasta que comience a recuperarse de la anestesia. A continuación, vuelva a colocar al animal en una jaula limpia y vigílelo hasta que se observe una recuperación completa.

Palpar la glándula de memoria inyectada en el día 30 para evaluar el agrandamiento y la hinchazón de la glándula. Controle la progresión del tumor cada cinco a siete días. Una vez que se observa una glándula mamaria inflamada y agrandada, se miden los volúmenes tumorales cada tres o cuatro días para determinar la cinética del crecimiento tumoral.

Una vez que aparecen los tumores palpables, el direccionamiento exitoso del árbol ductal mamario se puede visualizar mediante la preparación de monturas enteras de la glándula mamaria después de la inyección de trip y blue para verificar la inyección adecuada o después de la inyección de un adenovirus que expresa cereza M para verificar la preparación viral adecuada y la infección de las células epiteliales dúctiles. Cuando se inducen tumores en ratones transgénicos F Fluxed P 53 LSLK RAs, los tumores iniciales no se harán evidentes hasta alrededor del día 40, cuando las glándulas mamarias se agrandan e hinchan. A partir del día 56, los tumores comenzarán a crecer exponencialmente.

En este punto, es fundamental medir los volúmenes tumorales cada tres días. Si se desean estudios cinéticos, ya que habrá cierta variabilidad normal de ratón a ratón en la progresión del tumor, las grandes masas abdominales serán evidentes para el día 80, después de lo cual los ratones deben ser sacrificados si los tumores superan más del 10% del peso corporal del animal. El análisis de CDNA de tres líneas celulares derivadas de tumores de mama en ratones transgénicos P 53 LSL KRAS reveló que los tumores expresan citoqueratina de mesotelina ocho, HER dos nuevos y receptor de estrógeno alfa, similar al microambiente celular en el cáncer de mama humano, se observa la infiltración de células T alfa, beta y gamma delta, así como células supresoras derivadas de mieloides y macrófagos en los tumores.

La vasculatura que drena hacia el ganglio linfático axilar comenzará a congestionarse antes de que los tumores hayan crecido y, finalmente, abarcará todo el tejido de memoria donde se realizó la inyección. También habrá una congestión evidente de la vena epigástrica superficial entre los ganglios linfáticos inguinales y axilares. Después de siete a ocho semanas, el ganglio linfático axilar se agrandará debido a la invasión linfovascular de las células tumorales.

La invasión linfovascular y la metástasis de las células tumorales se pueden rastrear cruzando ratones transgénicos Flocked P 53 LSLK RAs con ratones L-S-L-E-Y-F-P. Después de la escisión premediada, se detectan células que expresan niveles altos y bajos de YFP en el tumor y su metástasis se puede rastrear hasta el ganglio linfático axilar que drena. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una cohorte experimental de 20 ratones en dos o tres horas si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden desarrollar otros modelos tumorales mediante la cría de ratones con bloqueos adicionales, transgenes p, para responder a preguntas como cómo afectan los diferentes oncogenes a la patología, el microambiente inmune y la invasión metastásica del cáncer de mama.