Name: Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a perfilar microARN en líquido cefalorraquídeo mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Este método permite analizar 742 secuencias únicas y se adapta a otros fluidos biológicos, células cultivadas o tejidos.

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El proyecto que se describe fue apoyado por el premio número R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del Instituto Nacional de Salud Mental. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o el Instituto Nacional de Salud.

El siguiente protocolo describe el procedimiento estándar para aislar el ARN de CSF y de perfil microRNAs utilizando placas PCR listos. Tenga en cuenta que la extracción en fase orgánica es opcional, y que un ARN transportador se añade a la muestra durante la extracción asegurar la recuperación máxima de ARN. En consecuencia, no hay necesidad de cuantificar el ARN. En general, un promedio de 6-8 placas se puede ejecutar en un día si el ADNc se sintetiza el día antes (aproximadamente 2 horas). Análisis de los datos se realiza cuando todas las muestras se han perfilado y se cargan en el software. Dependiendo del número de muestras / grupos o su combinación para la comparación, el análisis de datos puede requerir de una a varias horas. 1. La extracción de RNA La extracción de ARN se realizó a partir de muestras de LCR, se almacenaron congeladas a -80 ° C en alícuotas hasta su análisis. Para este procedimiento se utilizó el kit de aislamiento mirVana París, siguiendo instrumento del fabricantecciones para el aislamiento de ARN total. Tenga en cuenta que, a pesar de enriquecimiento para las pequeñas especies de ARN es posible con este equipo, este paso no se hace y el procedimiento de extracción de ARN se terminó después de la etapa de aislamiento total de ARN. Además, aunque el kit de aislamiento de mirVana París (al igual que otros kits de aislamiento de ARN disponible comercialmente) no requiere la extracción de orgánicos, un protocolo para este procedimiento se puede encontrar a continuación. El protocolo para la extracción de ARN consta de dos pasos: 1.1. Extracción Orgánica (no es necesario si se utiliza el kit de extracción de RNA mirVana Paris) 1.2.2. Aislamiento de ARN total 1.1. Extracción orgánica 1.1.1. Preparar reactivos <ol><li> Añadir 375 l de 2-mercaptoetanol a 2x solución desnaturalizante, y almacenarlo a 4 ° C. </li></ol> 1.1.2. Prepare el CSF <ol><li> Descongele cada alícuota de CSF en hielo antes de la extracción de RNA. Añadir 1 g de ARN portador MS2 a 0,5 ml de LCR descongelado y suavementemezclar. Tenga en cuenta que si la extracción orgánica se omite, se añadirá el portador MS2 a la muestra de aislamiento de ARN antes descrito en 1.2.2.1 a continuación. </li><li> Mezclar 0,5 ml de 2x solución desnaturalizante a temperatura ambiente a la LCR. </li><li> Añadir 1 ml de ácido-fenol: cloroformo a la CSF más la solución desnaturalizante 2x: asegúrese de retirado la fase inferior que contiene ácido-fenol: cloroformo, no el tampón acuoso que se encuentra en la parte superior de la mezcla. Además, tenga en cuenta que el ácido fenol: cloroformo contiene fenol, que es un veneno y un irritante, use guantes y otros equipos de protección personal cuando se trabaja con este reactivo. </li><li> Vortex durante 30-60 segundos para mezclar. Por conveniencia, los 2 ml de muestra / solución desnaturalizante / ácido-fenol: cloroformo mezcla se dividen en dos tubos Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 min a velocidad máxima (10.000 x g) a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la fase acuosa (superior) sin perturbar la fase inferior o la interfase y transferirlo a untubo fresco. Tenga en cuenta el volumen recuperado. </li></ol> 1.2. Aislamiento de ARN Se recomienda contar con un banco dedicado, juego de pipetas y bastidores para el manejo de muestras de ARN. La zona de trabajo y herramientas se descontaminan utilizando aerosol RNasa Zap y toallitas antes de cada experimento. 1.2.1. Preparar reactivos: <ol><li> Añadir 21 ml de etanol al 100% a los genes miARN Solución de lavado 1 y 40 ml de etanol 100% a la solución de lavado 2/3. Tenga en cuenta que miRNA Wash Solution 1 contiene tiocianato de guanidina que es una sustancia potencialmente peligrosa. </li></ol> 1.2.2. Aislamiento de ARN total <ol><li> Añadir 1,25 volúmenes de temperatura ambiente 100% de etanol a la fase acuosa de la extracción orgánica y mezclar bien. </li><li> Coloque un cartucho de filtro en uno de los tubos de recogida. </li><li> Pipeta no más de 700 l de la mezcla de lisado / etanol en el cartucho del filtro. </li><li> Centrifugar durante 30 segundos a máximavelocidad. Aplique la mezcla superior a 700 l en aplicaciones sucesivas con el mismo filtro. Deseche el flujo continuo después de cada centrifugación y guardar el tubo de recogida para los pasos de lavado. </li><li> Aplicar 700 l miRNA Wash Solution 1 para el cartucho del filtro y centrifugar durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. </li><li> Aplicar 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Aplique una segunda 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Girar el conjunto durante 1 min a velocidad máxima para eliminar el líquido residual desde el filtro. </li><li> Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. Aplicar 100 y mu; L de precalentado (a 95 ° C) de nucleasa libre de agua para el centro del filtro, y cerrar la tapa. Centrifugar durante 30 segundos a la velocidad máxima para recuperar el ARN. </li><li> Recoger el eluido que contiene ARN y almacenarlo a -80 ° C para aplicaciones posteriores. </li><li> Cuantificar 1 l de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000c. Tenga en cuenta que la cuantificación del ARN se puede omitir si un portador de ARN se añade a la muestra durante la extracción de RNA. En ese caso 8 l de ARN se sometió a síntesis de ADNc como se detalla a continuación. </li></ol> 2. miRNA Perfil: Protocolo QRT-PCR El protocolo para miARN perfiles consta de dos pasos: <ol><li> Síntesis de ADNc de primera cadena </li><li> La amplificación por PCR en tiempo real </li></ol> 2.1. Síntesis de ADNc de primera cadena 2.1.1. Diluir ARN molde <ol><li> Ajustar cada una de las muestras de ARN plantilla a una concentración de 5 ng / l utilizando nucleasa libre de agua. Si elARN no ha sido cuantificada (véase el paso 1.2.2.9), a continuación, 8 l de ARN se utilizan para la síntesis de ADNc </li></ol> 2.1.2. Preparar reactivos <ol><li> Descongelar suavemente el tampón de reacción 5x y nucleasa libre de agua, y colocar inmediatamente en hielo. </li><li> Mezclar por agitación. Resuspender la espiga-en añadiendo 40 l de nucleasa libre de agua al tubo y mezclar mediante agitación ARN; dejarlo en hielo durante 15 a 20 min. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador, se mezcla con un movimiento rápido de los tubos y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos. </li></ol> 2.1.3. Configuración reacción de transcripción inversa <ol><li> Preparar la cantidad requerida de solución de trabajo de RT en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, o equivalente (en las proporciones indicadas en la Tabla 1, a excepción de la plantilla de ARN), mezclar mediante agitación (1-2 segundos a velocidad máxima), girar brevemente abajo ( utilizamos un mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg) y colocarlo en hielo. Tenga en cuenta que la espiga ARN UniSp6-En se añade a la muestra antes de la reacción de RT (ver Tabla 1). </li><li> Vierta la solución de trabajo RT en tubos para PCR libre de nucleasa. </li><li> Dispensar plantilla de ARN en cada tubo. Nota: recuerde que debe calcular 10% de exceso de volumen / cada reactivo para pipetear y / o volumen muerto robótica. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Panel I Volumen (l) </td><td> Panel I + II Volumen (l) </td></tr><tr><td> Tampón de reacción 5x </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Libre de nucleasa agua </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Mezcla de enzimas </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 ARN Punto-en la plantilla </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> ARN total plantilla (5 ng / l) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Volumen Total </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Invierta configuración reacción de transcripción. </li></ol> 2.1.4. Mezclar y centrifugar reactivos <ol><li> Mezclar la reacción por suave (1-2 segundos) vórtex para asegurar que todos los reactivos se mezclan a fondo. Después de mezclar, centrifugar (mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg). </li></ol> 2.1.5. Incubar e inactivar el calor <ol><li> Programar una máquina de PCR de la siguiente manera: </li><li> Incubar durante 60 min a 42 ° C </li><li> Calor-inactivar la transcriptasa inversa durante 5 min a 95 ° C </li><li> Enfríe inmediatamente a 4 ° C </li><li> Almacenar a 4 ° C o congelación Nota: el protocolo se puede interrumpir en esta etapa. El cDNA diluido se conserva a -20 ° C durante un máximo de 5 semanas (tiendas opcional a 4 ° C durante un máximo de 4 días). </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. La amplificación por PCR en tiempo real 2.2.1. Preparar los reactivos para la PCR en tiempo real <ol><li> Coloque cDNA (del paso 2.1.5) en hielo. </li><li> Agua libre y Master PCR mix nucleasa Descongelar en hielo. Proteja los viales mezcla maestra de PCR de la luz cubriéndolos con papel de aluminio. Inmediatamente antes de su uso, mezclar la mezcla maestra de PCR por agitación 1-2 seg en una mini centrífuga y centrifugar a 1500 xg durante 1 min. </li></ol> 2.2.2. Combine la mezcla SYBR verde master, agua y cDNA y agregar a las placas PCR Se recomienda el siguiente procedimiento para evitar bajas concentraciones de cDNA se adhiera a la superficie del tubo: <ol><li> Antes de retirar la junta de la placa, girar brevemente abajo de la placa (s) en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min. </li><li> En un tubo cónico de 15 ml, combinar 2x PCR Master Mix y agua. Panel I: 2.000 l 2x mezcla maestra y 1.980 l de agua; Panel I + II: 4.000 l 2x mezcla maestra y 3960 μ; L de agua. </li><li> Añadir 20 l cDNA (panel I) o 40 l cDNA (panel I + II) y mezclar. </li><li> Mezclar suavemente por agitación 1-2 segundos y girar en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min. </li><li> Coloque la PCR Master Mix / cDNA mezcla en un depósito pipeta multicanal. Puede que tenga que identificar a un depósito que tiene la longitud de la pipeta multicanal. Esto mantiene el nivel de volumen lo suficientemente alto como para permitir alícuotas iguales de volumen en todo el multicanal. Esto es crítico hacia los últimos alícuotas. </li><li> Dispensar 10 l Master mezcla PCR / cDNA mezcla a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta de 16 canales. </li><li> Sellar la placa con sellado óptico. </li><li> Girar la placa brevemente en una centrífuga refrigerada (1500 xg durante 1 min), para mezclar las soluciones y eliminar las burbujas de aire. Nota: el experimento se puede detener en este punto. Guarde las reacciones protegidos de la luz a 4 ° C durante un máximo de 24 horas. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Realizar la amplificación por PCR en tiempo real y análisis de curva de fusión después de los parámetros que se detallan en la Tabla 2. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Paso del proceso </td><td> Configuración, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polimerasa de activación / Desnaturalización </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Amplificación </td><td> 45 ciclos de amplificación en 95 ° C, 10 seg 60 ° C, 1 min -Tasa de rampa 1,6 ° C / seg Lectura óptica </td></tr><tr><td> Análisis de la curva de fusión </td><td> Sí </td></tr></tbody></table> Tabla 2. En tiempo real las condiciones del ciclo de PCR utilizando el Roche LightCycler 480. 2.3. Análisis en tiempo real de datos de PCR En tiempo real el análisis de datos de PCR se realiza con la Exiqon de GenEx profesional 5.0, siguiente trecomendó instrucciones. El manual de GenEx paso a paso se puede descargar en <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> El análisis de datos se compone de tres pasos: <ol><li> Importación de datos </li><li> Preprocesamiento de los datos </li><li> El análisis estadístico </li></ol> 2.3.1. Importación de datos <ol><li> En la Roche LightCycler 480 seleccionar el método de análisis nd derivado 2 y calcular los valores Cq. Los datos se exportan en forma de tabla y se guardan como archivos de texto. </li><li> Para importar los datos, abierta de GenEx y haga clic en el botón Asistente de importación Exiqon y haga clic en &quot;Inicio&quot;. Siga las instrucciones para seleccionar el formato, el instrumento y archivo de diseño de placa (s). Tenga en cuenta que los archivos de diseño de placa (excel) son descargados desde el sitio web Exiqon ( <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Paneles I y II, y haga clic en &quot;Siguiente&quot;. </li><li> La tabla generada después de archivo de importación contiene columnas predefinidas. Nombres de muestras se pueden editar y columnas de clasificación se pueden agregar o quitar en este paso. Haga clic en &quot;Siguiente&quot; cuando haya terminado. </li><li> Guarde los datos y cargar a Editor de datos. </li></ol> 2.3.2. Preprocesamiento de los datos <ol><li> Según lo recomendado por Exiqon y de GenEx, al comparar múltiples placas lo primero que debe hacer es calibrar los datos entre las placas por la elección de calibración entre plato en el menú pre-procesamiento. </li><li> Se recomienda ejecutar arrays miARN en carreras por triplicado. Si un miARN no está presente en al menos dos de cada tres réplicas que se establecerá como nonexpressed. </li><li> En el siguiente paso en el procesamiento previo, establecer un punto de corte. Definición de un valor de corte indica que los datos con un ciclo umbral (C t) superior a este valor se descartan. En los presentes experimentos utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo, el valor de corte se fijó en 39. Therntes, se descartarán todas las muestras con una C t por encima de 39 en las tres réplicas. Si un miARN tiene una T C&gt; 39 para una sonda (una réplica de tres), que la lectura será reemplazado con el promedio de la C t para los otros dos sondas, siempre que sean tanto por debajo de 39. </li><li> Definir los genes de referencia. De GenEx Professional tiene la opción de utilizar geNorm y / o NormFinder para identificar genes de referencia. Seleccione una lista de miRNAs que tienen valores similares en todos Cq muestra y se ejecutan geNorm y / o NormFinder. De acuerdo con este análisis, en el ejemplo dado aquí, miR-622 y miR-1266 tuvieron los valores más uniformes a través de las muestras y fueron elegidos como los genes de referencia (Figura 1). </li><li> A continuación, los datos se normalizaron utilizando los genes de referencia y los valores obtenidos se corresponden con el t? C </li><li> Si se realizaron reacciones de síntesis de ADNc por triplicado, en este momento los valores deben promediarse. </li><li> Validar la hoja para volvermover las columnas vacías y casi vacías. En la ventana de procesamiento previo, seleccione &quot;Validar hoja&quot; y que se aplican en la línea de las columnas vacías Remove. En la línea de abajo, elegir el porcentaje deseado de datos válidos y haga clic en Aplicar. Por ejemplo, seleccione 100% si desea comparar sólo miRNAs comunes a todas las muestras. </li><li> Manipular los datos que faltan. Seleccione &quot;Datos que faltan&quot; en el menú de preprocesamiento y eligió una de las opciones para manejar los datos faltantes. Este paso es necesario. Tenga en cuenta que de GenEx te dará error si intenta cargar archivos que contengan datos que faltan no controladas. </li><li> Determinar la cuantificación relativa entre los grupos de muestras (es decir. Experimento frente al control). Cuantificación relativa entre los grupos se calcula utilizando el método ΔΔ C t. En de GenEx, haga clic en la pestaña de procesamiento previo y seleccione la cuantificación relativa. En la ventana de seleccionar el grupo de referencia y pulse Aplicar. Tenga en cuenta que para representaciones gráficas y / o para otros análisis estadísticos, exprEssion datos deben ser convertidos a una escala logarítmica. En el menú de procesamiento previo, seleccione Log2. </li></ol> 2.3.3. Análisis estadístico Software de GenEx permite una amplia gama de análisis estadísticos, entre ellos T-test y ANOVA. <ol><li> Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Es fundamental para seleccionar las muestras correctas o grupos de muestras para las que se realiza el análisis estadístico. </li><li> Seleccione &quot;Estadísticas&quot; y elegimos el icono correspondiente a la prueba deseada. </li><li> Haga clic en &quot;Ejecutar&quot; en la ventana del panel de control. Guardar los resultados como Excel o archivos mdf. </li></ol> 2.3.4. De perfiles de expresión Los microARNs y muestras se pueden clasificar, agrupar, y visualizados a fuego mapas y dendrogramas, de la siguiente <ol><li> Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Utilice esta ventana para seleccionar y crear grupos de muestras o miRNAs. Haga clic en &quot;Aplicar&quot; cuando haya terminado. </li> &lt;li&gt; En la esquina izquierda selecto grupo superior y haga clic en el icono de mapa de calor </li><li> En la ventana Panel de control, haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. El mapa de calor se puede guardar en varios formatos como tiff o bmp, sino que también puede copiar y modificar, según sea necesario. </li></ol>

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de la traducción y / o la promoción de la degradación del mRNA 2. Debido a su alta estabilidad en condiciones libres de células, los microRNAs se han detectado en muchos fluidos corporales. Además, el perfil de expresión distinta de microRNAs se ha correlacionado con la etapa y / o la progresión en una variedad de cánceres humanos 3-9. Hay varias herramientas disponibl...

Los microARNs pertenecen a la familia de pequeñas (21-23 nt de longitud) RNAs no codificantes que regulan la expresión de genes después de transcriptionally. microARNs pueden secretarse en el espacio extracelular donde parecen ser relativamente estables. Si bien la determinación de los cambios en la expresión de miRNA puede ser un paso importante hacia la identificación de biomarcadores, la realización de perfiles de miARN y el manejo de una gran cantidad de datos puede ser intimidante. Aquí se describe un protocolo para determinar los cambios en la expresión de miRNA en el líquido cefalorraquídeo (aplicable a otros fluidos corporales) por un tiempo real sensibles PCR. También describe el uso de software para análisis de datos, incluyendo el análisis estadístico y representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente fácil y sencillo y, en función del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR en tiempo real disponibles, también relativamente rápidos. La parte experimental requiere precisión en el manejoARN y el pipeteo en placas de 384 pocillos, mientras que la sección de análisis de datos utilizando de GenEx requiere algunos conocimientos básicos en informática y estadística.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabla 3. Lista de equipos.</td></tr><tr><td> Finnpipeta Novus Multichannel Pipetter </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip Puntas de pipeta </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Termociclador C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml Perfil bajo, Tubos de PCR transparentes </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> Tiras de tapas planas </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sealing Foil</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada 5804R </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rotor de cubeta oscilante, 4 posiciones </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> Mini centrífuga de sobremesa </td><td>Fisher</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> Vórtice de sobremesa </td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Tubos de microcentrífuga, esterilizados </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Depósito de reactivos de matriz, 25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga de sobremesa Sigma 1-15</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bench-Top Vortex </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mesa 4. Lista de reactivos.</fuerte></td></tr><tr><td> Kit universal de síntesis de ADNc, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Mezcla maestra verde, RT universal, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Agua destilada ultrapura Dnase, Libre de rnasa </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA Paneles humanos de PCR listos para usar (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>mirVana Kit de aislamiento de miRNA, 40 aislamientos</td><td>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 portador de ARN </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001<</td><td></td></tr><tr><td>p>2-mercaptoetanol 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> etanol 100% </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> Nucleasa libre de agua </td><td>Qiagen</td><td>1039480<</td><td></td></tr><tr><td>p>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

líquido cefalorraquídeo microrna perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real pcr

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html> Los microARNs (miRNAs) constituyen una capa potente de la regulación de genes guiando RISC en los sitios diana situados en ARNm y, por consiguiente, mediante la modulación de su represión de traducción. Cambios en la expresión de los genes miARN se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de todas las principales enfermedades complejas. Por otra parte, los recientes hallazgos mostraron que los miRNAs pueden ser secretadas al medio extracelular y entran al torrente sanguíneo y otros fluidos corporales en los que pueden circular con alta estabilidad. La función de dicho miRNAs circulantes permanece en gran medida difícil de alcanzar, pero los enfoques de alto rendimiento sistemáticas, tales como arrays miARN perfiles, han llevado a la identificación de los genes miARN firmas en varios estados patológicos, incluyendo los trastornos neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. En este contexto, la identificación de perfil de expresión de los genes miARN en el líquido cefalorraquídeo, como se informa en nuestro estudio reciente, hace miRNAs candidatos atractivos para el análisis de biomarcadores. _content &quot;&gt; Hay varias herramientas disponibles para crear perfiles de microRNAs, como microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR), y la secuencia de profundidad. A continuación, describimos un método sensible para perfilar microRNAs en líquido cefalorraquídeo por cuantitativa en tiempo real PCR. Nosotros utilizado los Exiqon microARN PCR paneles humanos-listas para usar I y II V2.R, que permite la detección de 742 microARNs humanos únicos. Realizamos los arrays en carreras por triplicado y se procesaron y analizaron los datos utilizando el software de GenEx Professional 5. El uso de este protocolo, se ha perfilado con éxito microRNAs en diversos tipos de líneas celulares y células primarias, CSF, plasma y tejidos embebidos en parafina fijado en formol.

Los resultados de este estudio han sido publicados anteriormente 1. Figura 1 muestra los resultados del análisis de microRNAs de referencia candidatos usando la aplicación geNorm. En consecuencia, dos microARN, miR-622 y miR-1266, fueron identificados como genes de referencia y se utilizaron para normalizar los valores de miRNA. Para el estudio del LCR teníamos tres grupos de muestras: VIH (n = 10), HIVE (n = 4), y VIH + sin Encefalitis (VIH +, <...

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar el perfilado de microARNs en líquidos cefalorraquídeos mediante PCR cuantitativa y analizar los datos utilizando el software profesional Gen X. Esto se logra primero aislado el ARN total de muestras de líquido cefalorraquídeo. El segundo paso consiste en realizar la transcripción inversa para transcribir los ARNs en ADNc.A continuación, los ADNc se mezclan con una mezcla maestra de cyber green cargada en placas de 384 pocillos que contienen cebadores para 742 secuencias únicas y se amplifican mediante PCR en tiempo real. El paso final consiste en analizar los datos obtenidos de la amplificación en tiempo real. En última instancia, los resultados pueden expresarse como un cambio en la expresión (fold change), un aumento o disminución respecto a un control, y visualizarse en diversas representaciones gráficas.Por lo tanto, la principal ventaja de nuestra técnica frente a métodos existentes como las matrices de chips es que nuestro método es altamente sensible y requiere una cantidad mínima de ARN. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la gran cantidad de datos generados y al uso del software para el análisis de datos. Primero, rocíe el área de trabajo y las pipetas con RNA Zap.Para comenzar, sintetice ADNc diluyendo las muestras de ARN molde a una concentración de cinco nanogramos por microlitro con agua libre de nucleasas. A continuación, coloque suavemente el tampón de reacción 5x en hielo para descongelarlo. Luego, agregue 40 microlitros de agua libre de nucleasas al control de ARN para resuspender el reactivo, vortexee el tubo y déjelo en hielo durante 15 a 20 minutos.A continuación, retire las enzimas del congelador, agite suavemente los tubos y colóquelos sobre hielo. Asimismo, una vez que todos los reactivos hayan descongelado, centrifúgelos brevemente. Prepare la solución de trabajo de transcriptasa inversa en un tubo eppendorf de 1,5 mililitros añadiendo el tampón de reacción 5 x y la enzima.Mezcle agua libre de nucleasas y el control interno de ARN en la plantilla utilizando las proporciones indicadas en la tabla uno. A continuación, mezcle la solución de trabajo agitándola mediante vortex durante uno o dos segundos a velocidad máxima. Centrifugue brevemente la solución durante 10 segundos y luego distribuya la solución de trabajo en tubos de PCR libres de nucleasas.Luego, agregue directamente el ARN molde en los tubos de PCR. Vortexee suavemente la reacción durante uno o dos segundos para asegurar que todos los reactivos se mezclen completamente y centrifugue brevemente los tubos durante 10 segundos. Coloque la muestra en la máquina de PCR e introduzca los parámetros mostrados aquí.Luego, inicie el programa siguiendo la retrotranscripción. El ADNc está listo para la amplificación por PCR en tiempo real y se puede almacenar a menos 20 grados Celsius durante hasta cinco semanas. Para comenzar la amplificación por PCR en tiempo real, primero coloque el ADNc y la mezcla maestra de PCR en hielo.Para descongelar, proteja los viales de la mezcla maestra de PCR de la luz cubriéndolos con papel de aluminio mientras se descongelan. Una vez descongelados, vortexee la mezcla maestra de PCR durante uno o dos segundos. A continuación, combine 2000 microlitros de mezcla maestra de PCR 2X y 1980 microlitros de agua en un tubo cónico de 15 mililitros.Añada 20 microlitros del ADNc a la mezcla y vortexee suavemente las soluciones durante uno o dos segundos. Luego, centrifugue las soluciones en una centrífuga refrigerada a 1.500 × g durante un minuto a cuatro grados Celsius. A continuación, coloque la mezcla de reacción de PCR en un depósito para pipeta multicanal.Centrifugar brevemente las placas listas para usar en una centrífuga refrigerada a 1,500 ×g antes de retirar el sello de la placa. Luego, dispensar 10 microlitros de la mezcla maestra de PCR que contiene ADN en cada pocillo de una placa de 384 pocillos. Utilizar una pipeta de 16 canales y sellar la placa con una película de sellado óptico.Después de agregar la mezcla maestra, centrifugar brevemente la placa en una centrífuga refrigerada a 1.500 ×g para hacer descender la solución al fondo de los pocillos. Mezclar las muestras y eliminar las burbujas de aire para pausar el experimento. En este punto, almacenar las reacciones en un área protegida de la luz a cuatro grados Celsius durante un máximo de 24 horas.A continuación, realice la amplificación por PCR en tiempo real y el análisis de la curva de desnaturalización siguiendo los parámetros detallados en la tabla dos. Para comenzar el análisis, seleccione el método de análisis de la segunda derivada en el ciclador térmico Roche. Luego, calcule los valores del ciclo de cuantificación o CQ.Exporte los datos como una tabla y guárdelos como un archivo de texto. A continuación, importe los datos a Gen X haciendo primero clic en el botón del asistente de importación de GON y luego en iniciar en la siguiente ventana; seleccione el formato del instrumento y los archivos de diseño de la placa. Los archivos de Excel con el diseño de la placa pueden descargarse desde el sitio web de GON.Luego importe el panel uno y haga clic en siguiente. La tabla generada tras la importación del archivo contiene columnas predefinidas; en este paso, edite los nombres de las muestras y agregue o elimine columnas de clasificación. Haga clic en siguiente cuando haya terminado y guarde los datos.Luego, cárguelo al editor de datos. Primero, calibre los datos entre las placas seleccionando la calibración INTERPLATE desde el menú de preprocesamiento para asegurar que todas las placas se calculen utilizando los mismos parámetros. A continuación, defina un valor de corte que descartará los datos superiores al ciclo umbral o ct. Si un microARN tiene un CT mayor en una de las tres réplicas, esa lectura será reemplazada por el promedio del CT de las otras dos sondas.Defina los genes de referencia seleccionando una lista de microARNs que tengan valores de CQ similares en todas las muestras y ejecute la normalización génica. A continuación, normalice los datos utilizando los genes de referencia obtenidos. Los valores resultantes corresponderán al delta ct.Elimine columnas vacías y casi vacías abriendo la ventana de preprocesamiento y seleccionando validar hoja, luego seleccione Aplicar en la línea de eliminar columnas vacías en la línea inferior. Elija el porcentaje deseado de datos válidos y haga clic en aplicar. Seleccione 100 % si desea comparar únicamente microARNs comunes a todas las muestras.Cargue el archivo MDF final en Gen X y abra el administrador de datos para clasificar los grupos y visualizar los microARN y las muestras en mapas de calor y dendrogramas. A continuación, seleccione y cree grupos de muestras y haga clic en aplicar cuando haya terminado. Luego, en la ventana del panel de control, haga clic en ejecutar.Guarde el mapa de calor en el formato deseado, como TIFF o mapa de bits, y luego copie y modifique el mapa de calor según sea necesario. Esta barra gráfica se obtuvo a partir de la aplicación G norm dentro de Gen X para analizar 10 posibles genes de referencia de microARN. Estos resultados indican que MIR 622 y MI 1,266 son los microARNs con expresión más estable.El gráfico de caja mostrado aquí presenta la distribución de los datos para cada uno de los 11 microARN estadísticamente significativos dentro de los grupos de EIVH y VIH positivo sin encefalitis. En cada columna, el gráfico indica la mediana y los cuartiles primero y tercero, junto con los valores máximo y mínimo. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar el perfilado mineral en cualquier fluido corporal, muestras de tejidos y células cultivadas.

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Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.

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Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

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