Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

El objetivo general de este procedimiento es perfilar los microARN en los fluidos cefalorraquídeos mediante PCR cuantitativa y analizar los datos utilizando el software profesional Gen X. Esto se logra aislando primero el ARN total de muestras de líquido cefalorraquídeo. El segundo paso es realizar la transcripción inversa para transcribir los ARN en CDNA.

A continuación, los CDNA se mezclan con una mezcla maestra de verde cibernético cargada en placas de 384 pocillos que contienen cebadores para 742 secuencias únicas y se amplifican mediante PCR en tiempo real. El paso final es analizar los datos adquiridos de la amplificación en tiempo real. En última instancia, los resultados pueden expresarse como un cambio, aumento o disminución de pliegue a lo largo de un control, y visualizarse en varias representaciones gráficas.

Por lo tanto, la principal ventaja de nuestra técnica sobre los métodos existentes, como las matrices de chips, es que nuestro método es altamente sensible y requiere una cantidad mínima de ARN. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la gran cantidad de datos generados y al uso del software para el análisis de datos. Primero, rocíe el área de trabajo y las pipetas con RNA Zap.

Para empezar, la síntesis de CDNA diluye las muestras de ARN molde a una concentración de cinco nanogramos por microlitro con agua libre de nucleasa. A continuación, coloque suavemente el tampón de reacción cinco veces sobre hielo para descongelar. A continuación, añada 40 microlitros de agua libre de nucleasa a la espiga de ARN para resuspender el reactivo, agite el tubo y déjelo en hielo durante 15 a 20 minutos.

A continuación, retira las enzimas del congelador, agita los tubos y colócalos en hielo. Además, una vez que todos los reactivos se hayan descongelado, gírelos rápidamente. Prepare la solución de trabajo de transcriptasa inversa en un tubo eph de 1,5 mililitros añadiendo la enzima tampón de reacción cinco veces.

Mezcle el agua libre de nucleasa y la espiga de ARN en la plantilla utilizando las proporciones indicadas en la tabla uno. A continuación, mezcle la solución de trabajo agitándola en vórtice durante uno o dos segundos a la velocidad máxima. Gire brevemente la solución durante 10 segundos y luego dispense la solución de trabajo en tubos de PCR libres de nucleasa.

A continuación, añada el ARN molde directamente en los tubos de PCR. Agite suavemente la reacción durante uno o dos segundos para asegurarse de que todos los reactivos estén completamente mezclados y gire por los tubos durante 10 segundos. Coloque la muestra en la máquina de PCR e ingrese la configuración que se muestra aquí.

A continuación, inicie el programa siguiendo la transcripción retro. El CDNA está listo para la amplificación por PCR en tiempo real y puede almacenarse a 20 grados centígrados negativos durante un máximo de cinco semanas. Para comenzar la amplificación de PCR en tiempo real, primero coloque el CDNA y la mezcla maestra de PCR en hielo.

Para descongelar, proteja los viales de mezcla maestra de PCR de la luz cubriéndolos con papel de aluminio mientras se descongelan. Una vez descongelado el vórtice, la mezcla maestra de PCR durante uno o dos segundos. A continuación, combine 2000 microlitros de dos mezclas maestras XPCR y 1.980 microlitros de agua en un tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue 20 microlitros de CDNA a la mezcla y agite suavemente las soluciones durante uno o dos segundos. A continuación, centrifugar las soluciones en una centrífuga refrigerada a 1.500 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados. A continuación, coloque la mezcla de reacción PCR en un depósito de pipeta multicanal.

Gire brevemente las placas listas para usar en una centrífuga refrigerada a 1.500 veces G antes de quitar el sello de la placa. A continuación, dispense 10 microlitros de la mezcla maestra de PCR que contiene CD NA en cada pocillo de una placa de 384 pocillos. Usando una pipeta de 16 canales y selle la placa con una película de sellado óptico.

Después de agregar la mezcla maestra, gire brevemente la placa en una centrífuga refrigerada a 1.500 veces G para llevar la solución al fondo de los pocillos. Mezcle las muestras y retire las burbujas de aire para pausar el experimento. En este punto, almacene las reacciones en un área protegida de la luz a cuatro grados centígrados durante un máximo de 24 horas.

A continuación, realice un análisis de la curva de fusión y amplificación por PCR en tiempo real siguiendo los parámetros detallados en la tabla dos. Para comenzar el análisis, seleccione el segundo método de análisis derivado en el termociclador de luz de Roche. A continuación, calcule el ciclo de cuantificación o los valores de CQ.

Exporte los datos como una tabla y guárdelos como un archivo de texto. A continuación, importe los datos a Gen X haciendo clic primero en el botón del asistente de importación gon y luego haciendo clic en iniciar en la siguiente ventana, seleccione el formato del instrumento y los archivos de diseño de placas. Los archivos de Excel de diseño de placas se pueden descargar desde el sitio web de GON.

A continuación, importe el panel uno y haga clic en siguiente. La tabla generada después de la importación del archivo contiene columnas predefinidas, edite nombres de muestra y agregue o elimine columnas de clasificación en este paso. Haga clic en siguiente cuando haya terminado y guarde los datos.

A continuación, cárguelo en el editor de datos En primer lugar, calibre los datos entre las placas seleccionando Calibración INTERPLATE en el menú de preprocesamiento para asegurarse de que todas las placas se calculan utilizando los mismos parámetros. A continuación, defina un valor de corte que descartará los datos superiores al ciclo de umbral o ct. Si un micro ARN tiene una TC que es mayor para una réplica de cada tres, esa lectura se reemplazará con el promedio de la TC de las otras dos sondas.

Defina los genes de referencia seleccionando una lista de microARN que tengan valores de CQ similares en todas las muestras y ejecuten la norma génica. A continuación, normalice los datos utilizando los genes de referencia obtenidos. Los valores resultantes corresponderán al delta ct.

Para quitar las columnas vacías y casi vacías, abra la ventana de preprocesamiento y seleccione Validar hoja y, a continuación, seleccione Aplicar en la línea de eliminación de columnas vacías de la línea siguiente. Elija el porcentaje deseado de datos válidos y haga clic en aplicar. Seleccione 100%si desea comparar solo microARN comunes a todas las muestras.

Cargue el archivo MDF final en Gen X y abra el administrador de datos para clasificar, agrupar y visualizar microARN y muestras en mapas de calor y dendrogramas. A continuación, seleccione y cree grupos de muestras y haga clic en aplicar cuando haya terminado. A continuación, en la ventana del panel de control, haga clic en ejecutar.

Guarde el mapa de calor en el formato deseado, como TIFF o mapa de bits, y luego copie y modifique el mapa de calor según sea necesario. Esta barra gráfica se obtuvo a partir de la aplicación de la norma G dentro de la Generación X para analizar 10 posibles genes de referencia de micro ARN. Estos resultados indican que MIR 622 y MI 1, 266 son los microRNAs más establemente expresados.

El diagrama de caja que se muestra aquí muestra la distribución de los datos para cada uno de los 11 microARN estadísticamente significativos dentro de los grupos de HIVE y VIH plus sin encefalitis. En cada columna, el gráfico indica la mediana y el primer y tercer cuartil, junto con los valores máximo y mínimo. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un perfil mineral en cualquier fluido corporal, muestras de tejido y células cultivadas.