Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar y purificar subpoblaciones de células precursoras multipotentes derivadas de vasos sanguíneos humanos a partir de una única biopsia de músculo esquelético; primero, disociar la biopsia muscular y digerirla con una combinación de colagenasa tipo uno, dos y cuatro. Luego, marcar la suspensión de células individuales con anticuerpos conjugados con fluorescencia que reconozcan una combinación de marcadores específicos de superficie celular. A continuación, realizar la clasificación de células activada por fluorescencia mediante citometría de flujo.

Vea y amplíe los subtipos de células ordenadas en condiciones de cultivo específicas y densidades óptimas. En última instancia, el análisis posterior a la clasificación de células purificadas, así como el análisis subsiguiente mediante citometría de flujo y R-T-P-C-R de subconjuntos celulares cultivados, se utiliza para demostrar la pureza de estos subconjuntos homogéneos de BVSE. Sí, este método, ya sabe, puede responder realmente, ya sabe, ¿cuál es el origen de esas células madre meso camélidas?

Usted sabe, porque muchas personas han encontrado diferentes tipos de células madre en diversos tejidos. Por lo tanto, creo que esto puede responder al origen de esas células madre, así como al papel que desempeñan las células perivasculares y cualquier otra célula derivada de los vasos sanguíneos en la regeneración y reparación de los tejidos. La demostración visual de este método es fundamental, al igual que la biopsia muscular.

Los pasos de disociación pueden ser difíciles de aprender. Los detalles técnicos y la optimización de la digestión con colagenasa son muy críticos para el rendimiento y la purificación de las células diana. Transporte la biopsia de músculo esquelético humano sobre hielo.

En DM M suplementado con 5 %FBS y 1 %penicilina-estreptomicina en condiciones estériles. Lave la muestra dos veces con PBS que contenga 2 %antibiótico-antifúngico y luego en dms, suplementado con 2 %aa. Retire el tejido adiposo y conectivo adherido.

También elimine los vasos sanguíneos grandes bajo un microscopio de disección. Ahora corte la muestra muscular en trozos pequeños. Transfiera las muestras a 20 mililitros de medio de preservación para su almacenamiento a cuatro grados Celsius durante hasta cinco días.

El día del aislamiento celular, retire los fragmentos de músculo y lávelos dos veces en PBS que contenga 2% de penicilina-estreptomicina. Para preparar la solución de digestión, agregue 100 miligramos por mililitro de colagenasa tipo uno, tipo dos y tipo cuatro en pm.

Finalmente, corte y pique mecánicamente los trozos de músculo con una pequeña cantidad de pm. Pase la solución a través de una pipeta serológica de 10 mililitros, monitoreando la ausencia de coagulación. Retire el tejido adiposo y conectivo residual durante este proceso.

Luego, transfiera la mitad de la muestra de adulto a 20 mililitros o toda la muestra fetal a 10 mililitros de la solución de digestión. Incube la muestra durante 50 a 60 minutos a 37 grados Celsius en un agitador orbital a 70-80 RPM. Observe el estado de la digestión cada 15 a 20 minutos.

Optimice el rendimiento celular y la preservación de los antígenos de superficie ajustando el tiempo de digestión y/o la velocidad de agitación según corresponda, en función de la cantidad de tejido; cuando la turbidez casi desaparezca, pipetee vigorosamente el tejido digerido de tres a cinco veces. Añada una cantidad igual de PM para detener la reacción y luego centrifugue a 400 G durante cuatro minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante para lavar el precipitado y resuspenda en 10 mililitros de PM. Filtre a través de un filtro celular de 100 micrones y centrifugue a 400 G durante cuatro minutos, y retire cuidadosamente el sobrenadante.

A continuación, re suspenda los pellet en tampón de lisis de eritrocitos y filtre a través de un filtro celular de 70 micrones para obtener una suspensión de células individuales. Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, filtre la suspensión a través de un filtro celular de 70 micrómetros. Si se observa algún precipitado, pelete las células mediante centrifugación y re suspenda.

Suspenda en 0,5 mililitros de PBS y cuente el número de células para la tinción. Diluya la suspensión de células individuales a menos de 5 millones de células por mililitro con una alícuota de PBS, de 50 a cien microlitros de la suspensión celular, y reparta en 11 tubos para el control sin tinción, los controles negativos y los controles positivos de un solo color. Si es necesario, bloquee la suspensión de células individuales durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en suero de ratón.

Añada las soluciones de anticuerpos según el diseño experimental e incube durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Pelote las células por centrifugación y lave cada pelotón de muestra una vez en PM diluido a una concentración final de 5 millones de células por mililitro para la exclusión de células muertas, usando una dilución de uno a 100 de siete a a d, e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente para el control negativo y los controles positivos de un solo color. Reuspenda los pelotones celulares en 0,5 mililitros de PM diluido.

Transfiera todas las suspensiones celulares a tubos de citometría de flujo de fondo redondo de poliestireno. Ahora prepare tubos de recolección celular con 500 microlitros del medio coer apropiado. Transporte las suspensiones celulares sobre hielo hacia la célula.

Realice la clasificación de las suspensiones celulares en el citómetro de flujo en el orden de control no teñido, controles negativos, controles positivos monocromáticos y la suspensión celular principal, ajustando rigurosamente la intensidad del láser, la compensación de canales y la delimitación de poblaciones celulares para maximizar la pureza celular. Recolecte las poblaciones celulares deseadas en los tubos de recolección apropiados. Almacene las células recolectadas a cuatro grados Celsius.

Si no se siembran inmediatamente, sembrar las células endoteliales miogénicas frescas en MPM sobre placas previamente recubiertas con colágeno tipo I para el posterior envasado de la siembra de ECS.

3.500 a 4.000 células por centímetro cuadrado en MPM sobre placas o frascos previamente recubiertos con semilla de colágeno tipo I. Parásitos recién clasificados en e gm dos sobre placas recién recubiertas con gelatina al 0,2% para el primer y segundo pase. Divida las células en una proporción de uno a tres en medio PC sobre cultivo de poliestireno regular.

Placas a partir de P tres en adelante. Sembrar las células a una densidad de 6 500 a 7 000 células por centímetro cuadrado en medio PC sobre placas de cultivo de poliestireno convencionales. Para los frascos, sembrar las células de tejido adventicio recién clasificadas en medio AC sobre placas de cultivo de poliestireno convencionales para el posterior acondicionamiento de células semilla ACS a una densidad de 6 000 a 7 000 células por centímetro cuadrado en medio AC sobre placas de cultivo de poliestireno convencionales.

Los parámetros de los datos de los fluoróforos se corrigen primero según la información obtenida del control sin tinción, los controles negativos y los controles positivos de un solo color, tras la exclusión de células muertas. La suspensión de células marcadas con fluorocromos se somete a una serie de selecciones negativas y positivas de marcadores de superficie celular. Primero se seleccionan las células positivas para CD45. Luego, se separan las células positivas y negativas para CD56 a partir de la fracción negativa para CD45.

La fracción positiva para CD56 se somete posteriormente a la selección de CD34 y CD144, donde únicamente las células doble positivas se marcan como células endoteliales miogénicas y se recolectan posteriormente. De manera similar, la fracción negativa para CD56 se somete a la selección de CD34 y CD146, donde únicamente las células negativas para CD34 y positivas para CD146 se marcan como parásitos y se recolectan; la fracción positiva para CD34 y negativa para CD146 se somete a una selección negativa adicional con CD31 para excluir las células endoteliales, y únicamente el subconjunto positivo para CD34 y negativo para CD31 se marca como células adv para su recolección. En este caso, CD144 puede utilizarse como sustituto de CD31 para la exclusión de células endoteliales (EC).

Estos subconjuntos de C-E-P-V-H se purificaron a partir de biopsias musculares de un único donante. A diferencia de las células madre musculares típicas heterogéneas, los cultivos de subconjuntos de células madre derivadas de vasos sanguíneos humanos permanecen homogéneos incluso tras la expansión a largo plazo. Como usted sabe, creo que es muy importante que los investigadores de autoinmunidad utilicen la misma técnica para aislar, ya sabe, esas células madre derivadas de vasos sanguíneos que hemos descrito en nuestros laboratorios.

Por lo tanto, creemos que esta técnica de comparación directa permitirá a las personas reproducir nuestros resultados y comparar realmente los resultados de un equipo con los de otro. No olvide que trabajar con tejido humano fresco puede ser extremadamente peligroso. Se deben tomar precauciones, como el uso de guantes de nitrilo y protección ocular, durante la realización de este procedimiento.