FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

El objetivo general de este procedimiento es monitorizar el nivel de glucosa o glutamina intracelular de forma no invasiva utilizando biosensores basados en proteínas codificadas genéticamente. Esto se logra seccionando primero las células de interés con el gen biosensor que contiene el plásmido y seleccionando aquellas células que expresan el biosensor. En el segundo paso, se toman muestras de cultivos celulares de cultivos por lotes o alimentados con lotes y se miden sus proporciones de trastes.

La concentración intracelular de glucosa o glutamina de las muestras puede determinarse mediante un ensayo independiente. En última instancia, la relación de trastes de las muestras se puede utilizar para calcular la concentración intracelular de glucosa o glutamina de forma no invasiva y en tiempo real. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de los bioprocesos, ya que se trata de un método fiable para obtener información metabólica en tiempo real que puede utilizarse para la optimización y el control en línea.

Aunque el método se puede utilizar para proporcionar información sobre el bioprocesamiento, también se puede utilizar en otros sistemas, incluida la detección de marcadores de enfermedades. Comience por revivir las células CHO en nueve mililitros de medio de crecimiento completo. A continuación, centrifugar las células, resuspender el pellet en 10 mililitros de crecimiento fresco, medio, y contar las células por tripa en la exclusión del troquel azul.

A continuación, inicie un cultivo con una densidad de siembra de tres veces 10 a la quinta celda por mililitro en 125 mililitros. Matraces agitadores a 37 grados centígrados y 5% de CO2 en una plataforma de agitación orbital. Con una rotación de 125 RPM, subcultive las células cada tres o cuatro días en el medio de crecimiento completo a una densidad de asiento de dos veces 10 a la quinta celda por mililitro para la transfección celular.

Mantenga las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 12 a 24 horas antes de la transfección para asegurarse de que las células se estén dividiendo activamente. Luego, después de preparar el ADN plasmídico, cuente las células por exclusión de callos y troqueles azules y diluya las células hasta un volumen de trabajo de 20 mililitros de medios de cultivo celular. En un matraz de 125 mililitros, agite el matraz a una concentración de una vez 10 a la sexta celdas por mililitro.

Utilice un kit de transfección adecuado para la línea celular en uso, que incluya al menos un pocillo de control negativo que contenga células, pero sin ADN. Incubar las células transfectadas durante cuatro días en modo estático. Ahora agregue el antibiótico apropiado para la selección de plásmidos a una concentración adecuada según lo determinado por una curva de muerte.

Por ejemplo, en este estudio, se añadió zin a una concentración final de 400 gramos por mililitro para la selección de las células transfectadas y luego se transfirieron los cultivos a una plataforma de agitación que giraba a 125 RPM. Cambie el medio en un intervalo de tiempo apropiado para la línea celular, agregando antibiótico cada vez hasta que las células en el pocillo de control hayan muerto. Utilice los pozos más confluentes para progresar a los cultivos temblorosos.

A continuación, congele las células en viales criogénicos que contengan una vez de 10 a la séptima célula viable en un mililitro de mezcla de congelación para generar curvas de crecimiento por lotes y lotes alimentados. En primer lugar, establecer cultivos celulares por triplicado de las células CHO transfectadas en matraces Shake de 250 mililitros con un volumen de trabajo de 50 mililitros. A continuación, coloque los cultivos en una incubadora de células humidificada con agitación y extraiga muestras de 4,1 mililitros de cada cultivo en crecimiento a intervalos de 24 horas. Para los cultivos por lotes de la Fed, suplementar las células con la cantidad adecuada de glucosa o glutamina en el sexto día para restaurar sus concentraciones a sus valores iniciales.

Alimentando los cultivos de control con el mismo volumen de agua pura, use 100 microlitros de las muestras de 4.1 mililitros de 4.2 diariamente para contar las células por exclusión de trips y blue die hasta que la concentración de células viables se reduzca a cero. Para determinar la relación de trastes, centrifugar dos mililitros de las muestras diarias y resuspender el pellet en dos mililitros de PBS helado, transfiera la mitad de la suspensión de la celda a una placa de seis pocillos y agregue una muestra en blanco que no contenga celdas a una. Bueno, entonces mida inmediatamente los niveles de fluorescencia azul y amarilla a una longitud de onda de excitación de 430 con un ancho de banda de 35 nanómetros y una longitud de onda de misión de 465 con un ancho de banda de 35 nanómetros y 520 con un ancho de banda de 10 nanómetros para la fluorescencia azul y amarilla respectivamente.

Calcule las relaciones de los trastes determinando la relación entre la fluorescencia amarilla detectada y la de la fluorescencia azul. Ahora mezcle los últimos dos mililitros de las muestras diarias y luego lave el pellet dos veces en PBS helado después del segundo lavado. Sonicar la muestra cinco veces durante tres minutos, cada vez con un pulso de 15 segundos de encendido y 15 segundos de apagado.

Finalmente, realice los ensayos de metabolitos de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilice las curvas estándar resultantes para calcular los niveles intracelulares de glucosa o glutamina, según corresponda. En este experimento representativo, se mantuvieron cultivos de dos líneas celulares superpoblados por lotes, como se acaba de demostrar, con muestras diarias utilizadas para la calibración in vivo de cada fibs. En este gráfico se muestra un perfil representativo de crecimiento celular viable de las dos líneas celulares en relación con sus niveles intracelulares de glucosa o glutamina, y en esta tabla se presentan las correspondientes mediciones de traste y concentraciones de metabolitos intracelulares determinadas por los ensayos enzimáticos.

Se determinó que el bajo número de células presente en los primeros cuatro días de cultivo condujo a una señal de traste poco confiable. De manera similar, el alto nivel de lisado celular presente después del octavo día de cultivo produjo una gran cantidad de dispersión de luz. Por lo tanto, solo se utilizan los datos de los días cuatro a ocho para construir las curvas de calibración de las fibras de glucosa y glutamina.

Los resultados indican que la señal FIB produce una correlación fiable con las concentraciones intracelulares entre uno y cinco milimolares para la glucosa y entre 0,3 y dos milimolares para la glutamina. Para validar los hallazgos de fibs, se realizaron cultivos de las dos líneas celulares alimentados con bash excrementados. En el sexto día del cultivo celular se suplementó un alimento que contenía una alta concentración de sustrato para elevar las concentraciones extracelulares del sustrato.

Como los injertos representan las proporciones de los trastes en cada día, muestran una clara respuesta a la alimentación. Al revertir la tendencia, continuaron hasta el sexto día. Por ejemplo, en los cultivos alimentados con glucosa, la concentración de glucosa extracelular volvió a aumentar hasta 36 milimolares.

Mientras que en los cultivos alimentados con glutamina, la concentración de glutamina aumentó a cuatro milimolares. En el experimento de glucosa, la proporción de trastes para la línea celular de fibrocas de glucosa elegida disminuyó en el séptimo día en respuesta a la adición de glucosa. Dado que la glucosa fibs sigue el APO en la configuración.

De manera similar, en el experimento de glutamina, la proporción de trastes para la línea celular elegida por las fibonacci de glutamina aumentó en respuesta a la adición de glutamina de acuerdo con el principio de los sensores de apagado APO. Estas mediciones de trastes se utilizaron finalmente para calcular las concentraciones intracelulares de glucosa y glutamina correspondientes en función de las curvas de calibración antes mencionadas. Se comparan con las concentraciones intracelulares reales de estos sustratos según lo determinado con los ensayos enzimáticos de glucosa y glutamina, y muestran una concordancia adecuada después de su desarrollo.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la investigación exploren el efecto de diferentes formulaciones de medios en la productividad de proteínas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar biosensores codificados genéticamente para monitorear las concentraciones de metabolitos intracelulares.