Name: FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a calibrar biosensores FIBS para perfil metabólico no invasivo en tiempo real. Este método computacional permite monitorizar glucosa y glutamina intracelular, optimizando bioprocesos mediante datos metabólicos fiables.

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Agradecemos al profesor Lobo Frommer (Institución Carnegie para la Ciencia, la Universidad de Stanford) para la amabilidad de darnos la glucosa FRET plásmido y el Dr. Uwe Ludewig (Universidad de Hohenheim) por la amabilidad de suministro de la glutamina FRET construir en el vector de expresión vegetal pUTKan. AB está financiado por el programa de becas de Prioridad BBSRC apuntado. Tanto CK y KP son apoyados por RCUK Becas en Procesamiento biofarmacéuticos. CK También desea agradecer a Lonza biológicos por su apoyo financiero. El Centro para la Biología Sintética e Innovación es generosamente apoyada por el EPSRC.

1. Línea Celular Revival y mantenimiento <ol><li> Revive células CHO en 9 ml de medio de CD-CHO suplementado con 8 mM de L-glutamina y ml / L de suplemento de hipoxantina 100x / timidina 10 (medio de crecimiento completo). </li><li> Se centrifuga a 100 × g durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de medio de crecimiento completo fresco. </li><li> Extraiga una muestra de 1 ml y determinar la concentración de células viables mediante microscopía óptica utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano en un hemocitómetro. </li><li> Iniciar un cultivo a una densidad de siembra de 3 x 10 5 células / ml en 125 ml agitar frascos. </li><li> Mantener el cultivo en una incubadora a 37 ° C, una atmósfera humidificada de 5% de CO 2, en una plataforma de agitación orbital que gira a 120 rpm. </li><li> Subcultura cada 3-4 días en el medio de crecimiento completo a una densidad de siembra de 2 x 10 5 células / ml. </li></ol> 2. La transfección de la línea celular con el plásmido Containing el biosensor Gene <ol><li> Preparar ADN plásmido usando un kit de purificación de plásmido a gran escala. </li><li> Mantener las células en las condiciones apropiadas (37 ° C, 5% de CO 2) 12-24 h antes de la transfección para asegurar las células se están dividiendo activamente en el momento de la transfección. </li><li> Contar las células usando el método de exclusión del colorante azul de tripano, y luego preparar un volumen de trabajo de 20 ml de cultivo de células en un matraz de agitación de 125 ml a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Utilice un kit de transfección adecuado para la línea celular en uso. El ADN plásmido relación de reactivos de transfección a será dependiente de la línea celular y el vector. Se recomienda que este se optimiza mediante pruebas de un intervalo de relaciones dentro del rango especificado por el fabricante antes de realizar las transfecciones finales. También mantener al menos un cultivo de control negativo que contiene las células, pero sin ADN. </li><li> Incubar durante 4 días en modo estático y luego transferir a una Shaking plataforma que gira a 125 rpm. </li><li> Añadir el antibiótico apropiado para la selección del plásmido a una concentración adecuada como se determina por una curva de muerte. En este estudio, se añadió zeocina a una concentración final de 400 g / ml para la selección de las células transfectadas. </li><li> Cambie los medios en un intervalo de tiempo apropiado para la línea celular, añadiendo antibióticos cada vez, hasta que las células en el control así han muerto. </li><li> Utilice los pozos más confluentes de progresar a temblar culturas. </li><li> Establecer un banco de células mediante la congelación de las células en viales criogénicos que contienen 10 7 células viables en 1 ml de mezcla de congelación. En este trabajo, esta consiste en medio de crecimiento 92,5% y 7,5% de sulfóxido de dimetilo. </li></ol> 3. Lote y Fed-batch Curva de Crecimiento Celular <ol><li> Siga las instrucciones para el mantenimiento de células arriba para establecer cultivos de células por triplicado de las células CHO transfectadas en 250 ml de matraces de agitación con un volumen de trabajo de 50 ml. </li><li> Mantener la cultures en un incubador humidificado de células a 37 ° C, con 5% de CO 2, en una plataforma de agitación orbital que gira a 125 rpm, y retirar 4,1 ml muestras de cada cultivo en crecimiento a intervalos de 24 hr. </li><li> Utilice 100 l de la muestra para determinar la concentración celular y la viabilidad celular viable con el método de exclusión del colorante azul de tripano. </li><li> Repetir hasta que la concentración de células viables se reduce a cero. </li><li> Repetir para los cultivos de células de alimentación por lotes se completa con la cantidad apropiada de glucosa o glutamina en el día 6 para restaurar sus concentraciones a sus valores iniciales de 36 mM y 4 mM, respectivamente. Se recomienda que también se mantienen los cultivos de control adicional, que han de ser alimentados con el mismo volumen (12 ml en este caso) de agua pura. </li></ol> 4. FRET mediciones de la relación <ol><li> Tomar 2 ml de las muestras diarias retirados en el paso 3.2 anterior y se centrifuga a 100 × g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspfinalizado el pellet de células en 2 ml de hielo frío tampón fosfato salino (PBS). Transfiera esta en una placa de 6 pocillos y añadir una muestra en blanco que no contiene células a un pocillo. </li><li> Medir los niveles de fluorescencia azul y amarillo de inmediato a una longitud de onda de excitación de 430/435 nm y de emisión de longitudes de onda de 465/435 nm (azul) y 520/510 nm (amarillo). </li><li> Calcular los ratios de FRET (relación de fluorescencia amarilla detectado más de fluorescencia azul detectada). </li></ol> 5. Metabolito Ensayos <ol><li> Tomar 2 ml de las muestras diarias retirados en el paso 3.2 anterior y se centrifuga a 100 × g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 3 ml de PBS enfriado en hielo y se centrifuga de nuevo a 100 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 3 ml PBS helado que el anterior. Sonicar el 5x muestra durante 3 minutos cada uno en un pulso de 15 segundos encendido y 15 segundos apagado. En este punto, la celda adicionalcts pueden congelarse si se desea. </li><li> Utilice un kit de ensayo de glucosa adecuado, según las instrucciones del fabricante, con muestras de extractos de células para determinar la concentración intracelular de glucosa (ver tabla de materiales). Nota: Utilice las normas apropiadas para construir una curva estándar. En este trabajo, la concentración de las normas osciló entre 0-100 mM. </li><li> El uso de las lecturas de las normas, construir la curva patrón y encontrar la ecuación lineal de mejor ajuste (en este caso: y = 1310.51x - 723,43 donde y es la lectura de la absorbancia y x es la concentración de glucosa). </li><li> Cálculo de las concentraciones de glucosa utilizando la curva estándar y teniendo en cuenta la dilución. La concentración intracelular de la glucosa puede entonces ser calculado utilizando la siguiente ecuación: <img alt="" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" /> Para las células CHO, el volumen de una sola célula se calculó utilizando un diámetro de célula de 12 M 12 </sup&gt;. </li><li> Utilice un kit de ensayo de glutamina adecuada según las instrucciones del fabricante, con muestras de extractos de células para determinar la concentración de glutamina intracelular (ver tabla de materiales). Nota: Utilice las normas apropiadas para construir una curva estándar. En este trabajo, la concentración de las normas osciló entre 0-2 mM. </li><li> Como en 5.5 anteriormente, construir la curva de calibración (en este caso y = 203.1x + 17,1 donde y es la lectura de la absorbancia y x es la concentración de glucosa) </li><li> Utilizando la curva estándar, calcular la concentración de glutamina de las muestras, teniendo en cuenta la dilución. La concentración de glutamina intracelular se puede calcular utilizando la Ecuación 1 anterior. </li></ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
<li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li>
<li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li>
<li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+J.+Sel.+Top.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels%E2%80%94the+Holy+Grail+in+muTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li>
<li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li>
<li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li>
<li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li>
<li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li>
<li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li>
<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li>
<li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+binding+proteins%3A+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los FIBS permiten in vivo y en la cuantificación in situ de moléculas clave, en este caso nutrientes limitantes del crecimiento, la eliminación de incertidumbres derivadas de temple y métodos de extracción. Los hallazgos sugieren que existe una buena correlación entre la señal FIBS y las concentraciones intracelulares en el rango de 1-5 mm para la glucosa y 0,3-2 mM de glutamina. En el lote de cultivo de células CHO, estas concentraciones se encuentran en las fases de declive exponencial, esta...

Monitoreo metabolito tiene diversas aplicaciones en el procesamiento biológico, incluyendo el desarrollo del proceso, los medios de comunicación y el diseño de alimentación, y la ingeniería metabólica. Varios métodos están disponibles para las mediciones de concentración a través de la utilización de 1 enzimática, química 2, o ensayos de unión 3. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de la concentración intracelular de metabolitos clave a base de proteínas. En los ensayos de volumen ultra bajo, la fluorescencia es una herramienta conveniente como la miniaturización realmente mejora la relación de 4,5-señal-ruido y sensores basados ​​en proteínas puede ser codificado genéticamente el sentido de que no hay reactivos exógenos son necesarios para el análisis de metabolitos. Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) biosensores consisten en dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET es una transferencia de energía no radiante de un donante fotoexcitado a un aceptor fluorescente molécula locat<html> ed en estrecha proximidad (&lt;100). La escisión ligando o unión provoca un cambio conformacional en el sensor, que, a su vez, induce un cambio en la proximidad de los fluoróforos, lo que lleva a un cambio en la eficiencia de FRET medido por el cambio en el espectro de emisión. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular y sus características espectrales cambian en función de la concentración del metabolito dentro de la célula. FIBS tienen tiempos de respuesta rápidos lo que es ideal para la toma de mediciones para los modelos dinámicos 6. Aplicaciones anteriores incluyen el monitoreo individuales 7-9 y múltiples 10 metabolitos y proporcionar datos sobre la distribución espacio-temporal 11. FIBS se pueden crear en dos configuraciones: Apo-Max, donde la unión del ligando altera la proximidad de los fluoróforos bajada de transferencia de energía y Apo-Min, donde la unión del ligando trae los dos fluoróforos en contacto más estrecho (Figura 1). _content &quot;&gt; En este trabajo, se presenta un protocolo para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS de un metabolito, glucosa o glutamina. Se establece una metodología para la calibración del sensor in vivo para permitir el futuro cuantitativa mediciones de la concentración de metabolito intracelular, tal como se presenta en la Figura 2. Sobre la base de esto, la concentración intracelular de glucosa o glutamina pueden determinarse en discontinuos alimentados cultivos de células CHO, al que se añadieron los dos nutrientes en altas concentraciones en-proceso. Los resultados demuestran que el uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la predicción precisa de la concentración intracelular es posible, como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre tecnologías analíticas actuales, ya que no es invasiva y de bajo costo y rápido, dando una señal en tiempo real de los FIBS que pueden ser lunmonitoriza todo el cultivo.

<table><tbody><tr>La línea celular <td>CHO-S Cells</td><td>Life Tecnologies</td><td>11619-012</td><td>variará en función de los objetivos del estudio:</td></tr><tr><td>vector pCDNA4/TO&nbsp;</td><td>Life Tecnologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-PRO Reactivo de transfección</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>Las transfecciones se pueden realizar utilizando cualquier método adecuado para la línea celular en estudio</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO medium</td><td>Life Technologies</td><td>10743-011</td><td>El medio de crecimiento celular depende de las células en estudio</td></tr><tr><td>100x HT Supplement</td><td>Life Tecnologías</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas InfinitePRO 200</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>Cualquier lector de placas de fluorescencia de 96 pocillos que pueda acceder a las longitudes de onda requeridas puede ser sustituido</td></tr><tr><td>Filtros para lector de placas</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit de purificación de plásmidos</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Cualquier kit adecuado puede ser sustituido por</td></tr><tr><td>Amplex Red kit de ensayo de glucosa/glucosa oxidasa</td><td>Invitrogen</td><td>A22189</td><td>Cualquier kit adecuado puede ser sustituido</td></tr><tr><td>por EnzyChrom&nbsp; Kit de ensayo de glutamina Sistemas</td><td>de ensayo BioAssay</td><td>EOAC-100</td><td>Cualquier kit adecuado puede ser sustituido</td></tr><tr><td>por Hemocitómetro Neubauer mejorado</td><td>Fisher Scientific</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

fibs habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

En la era de la biología computacional, nuevos sistemas experimentales de alto rendimiento son necesarios con el fin de poblar y refinar los modelos para que puedan ser validados para fines predictivos. Idealmente estos sistemas serían bajo volumen, que se opone a los análisis de muestreo y destructivas cuando los datos de curso de tiempo se han de obtener. Lo que se necesita es una herramienta de supervisión in situ en la que puede reportar la información necesaria en tiempo real y de forma no invasiva. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de concentraciones intracelulares a base de proteínas. Una clase particular de in vivo biosensores que ha encontrado aplicaciones en la cuantificación metabolito se basa en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular, que tienen tiempos de respuesta rápidos y su cha espectralrísticas cambios de acuerdo a la concentración del metabolito dentro de la célula. En este documento, se describe el método para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS para la glucosa y la glutamina y la calibración de los FIBS in vivo en cultivo celular por lotes con el fin de permitir que el futuro cuantificación de la concentración de metabolito intracelular. Los datos de fed-batch cultivos de células CHO demuestra que los FIBS fue capaz en cada caso para detectar el cambio resultante en la concentración intracelular. Uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la concentración intracelular se determinó con precisión como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente.

Una visión general de la metodología se presenta en la Figura 2. En el trabajo presentado en este documento, las células CHO fueron transfectadas con el vector de FIBS y líneas celulares estables se seleccionaron a una presión de antibiótico de 400 mg / ml de zeocina. Por lo tanto, se crearon dos líneas celulares estables que expresan constitutivamente separados los sensores de glucosa y glutamina. Figura 1 representa las configuraciones de los dos biosensores utilizados en este estudio...

Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.

FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear el nivel de glucosa o glutamina intracelular de forma no invasiva utilizando biosensores basados en proteínas con codificación genética. Esto se logra primero transfectando las células de interés con un plásmido que contiene el gen del biosensor y seleccionando aquellas células que expresan el biosensor. En el segundo paso, se toman muestras de cultivo celular de cultivos por lotes o lotes alimentados y se miden sus relaciones de FRET.La concentración intracelular de glucosa o glutamina de las muestras puede determinarse entonces mediante un ensayo independiente. En última instancia, la relación FRET de las muestras puede utilizarse para calcular de forma no invasiva y en tiempo real la concentración intracelular de glucosa o glutamina. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de los bioprocesos, ya que este es un método confiable para obtener información metabólica en tiempo real que puede emplearse para la optimización y el control en línea.Aunque el método puede utilizarse para obtener información sobre el bioprocesamiento, también puede emplearse en otros sistemas, incluyendo la detección de marcadore

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La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Este trabajo demuestra la viabilidad de una técnica de espectroscopia de resonancia magnética de fósforo-31 (31PMRS) in vivo para cuantificar la capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en el músculo esquelético humano.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir En Vivo Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Este estudio describe un protocolo que utiliza 18F-FDG e imágenes de tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT), junto con modelos cinéticos, para cuantificar la absorción in vivo y en tiempo real de 18F-FDG en los tejidos.

La determinación de metabolismo de la glucosa Kinetics Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Este protocolo describe imágenes de fluorescencia y análisis de las coenzimas metabólicas endógenas, nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD). Las imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD proporcionan un método no destructivo sin etiquetas para evaluar el metabolismo celular.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar el metabolismo celular

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

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