La evaluación de Liquidación fagocítica de muerte celular en el accidente cerebrovascular experimental por ligables Fluorescent Probes
27 de mayo de 2014
Se presenta una nueva técnica de fluorescencia para selectivo etiquetado in situ de las células fagocitarias activas, que claro off cadáveres de células en el accidente cerebrovascular. El enfoque es importante para evaluar la reacción del cerebro a la isquemia debido a que sólo una pequeña proporción de los fagocitos presentes en el cerebro isquémico participar en el aclaramiento de la muerte celular.
El objetivo general de este procedimiento es etiquetar selectivamente las células fagocíticas activas, que eliminan los restos celulares en el accidente cerebrovascular. Esto se logra primero preparando los componentes para la reacción de amplificación de señal basada en Tite. El segundo paso consiste en preparar las secciones.
A continuación, se realiza la reacción de marcado utilizando la enzima vaccinia, topoisomerasa y sondas fluorescentes lábiles. El paso final es la amplificación de la señal fluorescente basada en IDE. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para evaluar la eliminación fagocítica de células muertas en secciones de tejido de isquemia cerebral focal.
La eliminación de células muertas por los fagocitos desempeña un papel importante en la recuperación cerebral después de la isquemia. El método presentado determina la eficiencia de este proceso mediante la marcación de solo aquellos fagocitos que eliminan activamente las células muertas. Aunque este método proporciona información sobre el cerebro isquémico, también puede utilizarse para estudiar la lesión isquémica en otros órganos y tejidos.
Donde la eliminación ácida de células muertas por la FA es importante. Aunque la amplificación de señal por IDE o el paso de TSA ocurre en la etapa final de etiquetado, la preparación para esta reacción puede llevar más de una hora. Por lo tanto, es más conveniente preparar primero los reactivos de TSA.
El primer paso consiste en preparar la solución stock de fluoro cuatro TYROM, añadiendo 300 microlitros de DMSO a los reactivos TYROM incluidos en el kit de etiquetado TSA. A continuación, prepare el tampón de lavado TNT para disolver completamente el reactivo bloqueante. Al preparar el tampón bloqueante TNB, añádalo lentamente en pequeños incrementos mientras agita, y caliente gradualmente la solución hasta 55 grados Celsius.
Con agitación continua, la solución presentará un aspecto lechoso y debe llevarse a temperatura ambiente antes de usarla. Alícuotas deben almacenarse a menos veinte grados Celsius para uso prolongado. Para este procedimiento, se preparan previamente portaobjetos montando secciones de cinco micrómetros de grosor, cortadas de tejido fijado en formalina. Primero, trate las secciones con xileno durante 15 minutos, luego rehidrate las secciones mediante una serie de lavados con etanol, seguidos de dos lavados con agua.
A continuación, prepare la solución de trabajo de proteinasa K diluyendo una solución stock hasta 50 microgramos por mililitro en PBS. La parte más difícil de este experimento consiste en determinar el tiempo ideal de digestión con proteinasa K, ya que podrían necesitarse controles con tiempos de digestión tanto más cortos como más largos para asegurar el éxito, dependiendo del tamaño y tipo de tejido. Añada el volumen adecuado de la solución de trabajo de proteinasa K a las secciones e incube durante 15 minutos a 23 grados Celsius.
Después de la incubación, lave los cortes con agua destilada dos veces durante cinco minutos cada vez. Mientras los cortes permanecen en remojo, prepare la mezcla de marcado que contiene la sonda activa. Para preparar la solución de sonda activa, combine los oligonucleótidos con agua, tris un molar, HCl y la topoisomerasa vaccinia suministrada en el kit, mezclando suavemente mediante pipeteo e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la activación de la sonda.
Después del segundo período de lavado, retire los cortes del frasco y aspire el agua restante. Cuando esté listo, aplique la solución de sonda activa preparada anteriormente. Coloque los cortes y sométalos a incubación durante 15 minutos a 23 grados Celsius.
Después de la incubación, sumerja los portaobjetos en agua para retirar suavemente las cubreobjetos. Lave los portaobjetos en agua tres veces durante cinco minutos cada vez. Después del último lavado, cubra las secciones de tejido con tampón bloqueante TNB e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 30 minutos a temperatura ambiente.
En este período, prepare una dilución de uno a 100 de los conjugados desprovistos de estreptavidina y de peroxidasa de rábano picante. S-A-H-R-P en tampón de bloqueo TNB, retire los portaobjetos y aspire el tampón de bloqueo TNB. Antes de aplicar la solución de S-A-H-R-P, utilice suficiente reactivo para cubrir completamente la sección de tejido.
Una vez cubierto, incubar las laminillas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, lavar las laminillas tres veces durante cinco minutos cada vez. En tampón de lavado TNT a temperatura ambiente, preparar una dilución de uno a 50 del stock de fluoro four TY IDE en diluyente de amplificación 1 x inmediatamente antes de su uso. Aplicar la solución sobre las laminillas cubriendo completamente la sección de tejido.
Dado que la solución no se puede reutilizar, deseche cualquier porción no utilizada restante. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante tres a diez minutos. Observe la fluorescencia.
Aumente bajo el microscopio hasta que en este momento sean visibles los primeros indicios de estructuras. Pase rápidamente al paso de lavado. Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada vez.
En tampón de lavado TNT a temperatura ambiente con agitación. Después del lavado, agregue la solución antifade con DPI y cubra con una laminilla. Observe los resultados bajo un microscopio de fluorescencia.
Estas imágenes muestran dos ejemplos de eliminación ácida de PHA. La tinción nuclear dappy se observa en fluorescencia azul y la sonda topo vac liable en fluorescencia verde. Los diagramas de los eventos presentados en estas imágenes muestran núcleos de fagocitos y núcleos extraños ingeridos en diversas etapas de digestión. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente tres horas si se lleva a cabo correctamente.
Después de ver este video, sabrá cómo utilizar sondas fluorescentes viables en secciones de tejido. También podrá etiquetar selectivamente las células inmunitarias activas que eliminan células muertas en el cerebro isquémico.
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Descripción general
Este artículo presenta una técnica de fluorescencia novedosa para marcar selectivamente células fagocíticas activas implicadas en la eliminación de restos celulares tras un accidente cerebrovascular. El método es fundamental para comprender la respuesta del cerebro a la isquemia, ya que solo una pequeña fracción de las células fagocíticas participa en este proceso de eliminación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Microscopía de Fluorescencia
Antecedentes
- La eliminación fagocítica de células muertas es vital para la recuperación cerebral tras la isquemia.
- Solo un subconjunto de fagocitos participa activamente en este proceso.
- Comprender este mecanismo puede orientar estrategias terapéuticas.
- El método presentado también puede aplicarse a otros órganos y tejidos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica para marcar selectivamente fagocitos activos.
- Evaluar la eficiencia de la eliminación fagocítica en tejido cerebral isquémico.
- Proporcionar información sobre la dinámica de la eliminación de células muertas.
Métodos Utilizados
- Preparación de los componentes de la reacción de amplificación de señal basada en Tite.
- Reacción de marcado utilizando vaccinia, topoisomerasa y sondas fluorescentes.
- Microscopía de fluorescencia para la visualización de células marcadas.
- Optimización de los tiempos de digestión con proteinasa K para secciones de tejido.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de fagocitos activos en tejido cerebral isquémico.
- Visualización de la actividad fagocítica mediante microscopía de fluorescencia.
- Demuestra la aplicabilidad del método a otros tejidos.
- Información sobre el momento y la eficiencia de la eliminación fagocítica.
Conclusiones
- La técnica desarrollada mejora la comprensión de los procesos fagocíticos en la isquemia.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de eliminación celular.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a diversos sistemas orgánicos afectados por la isquemia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación selectiva de la eliminación fagocítica activa en el accidente cerebrovascular experimental permite desactivar mecanismamente las vías neuroinflamatorias y orienta la validación de objetivos para estrategias de recuperación del SNC. Este método basado en sondas fluorescentes ligables proporciona confianza predictiva al evaluar la eficiencia de los fagocitos encargados de la gestión de residuos, apoyando la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la investigación preclínica. Su capacidad para distinguir entre fagocitos activos e inactivos mejora la toma de decisiones en carteras de programas terapéuticos neuroprotectores y regenerativos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos de eliminación fagocítica en tejido cerebral relevante para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de objetivos al distinguir fagocitos activos de células circundantes.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas en las vías neuroinflamatorias y regenerativas.
- Proporciona datos cuantitativos para una predicción confiable en programas del SNC en etapas iniciales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara secciones de tejido validadas para flujos de trabajo de imágenes cuantitativas posteriores.
- Normaliza la detección de eventos fagocíticos activos para obtener resultados de ensayos reproducibles.
- Permite la realización de cribados a gran escala de moduladores que afectan la eficiencia de la eliminación por fagocitosis.
- Facilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre la eliminación de células muertas en situ.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad de lesión isquémica para el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica de estrategias de recuperación del SNC.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo para candidatos neuroprotectores y regenerativos.
- Ofrece una reducción predictiva de riesgos para las complicaciones biológicas en etapas avanzadas relacionadas con el fracaso del aclaramiento celular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la evaluación cuantitativa de la eliminación fagocítica en modelos de isquemia cerebral, apoyando tanto la validación de dianas como la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la eliminación mediada por fagocitos y la aclaración de vías en tejido isquémico.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de eventos fagocíticos activos para el desarrollo de ensayos.
- Análisis: Ofrece mediciones basadas en fluorescencia para comparar la eficiencia de eliminación entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos preclínicos relevantes para lesiones del sistema nervioso central y su recuperación.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para estudiar la eliminación fagocítica en diversos contextos de tejido y enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos del SNC.
- Valor operativo: Estandariza la cuantificación del aclaramiento fagocítico para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la eficiencia del capital al aclarar tempranamente el riesgo biológico.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas neuroinflamatorios y regenerativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y preparación de secciones de tejido.
- Necesita acceso a reactivos especializados, incluyendo sondas fluorescentes ligables y kits enzimáticos.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de marcado y adquisición de imágenes para lograr reproducibilidad.
- Adaptable a diversos tipos de tejidos, aunque puede requerir optimización de los pasos de digestión y marcado.
- Depende del control preciso de las reacciones enzimáticas y de los parámetros de imagen para obtener resultados cuantitativos.
