La evaluación de Liquidación fagocítica de muerte celular en el accidente cerebrovascular experimental por ligables Fluorescent Probes
27 de mayo de 2014
Se presenta una nueva técnica de fluorescencia para selectivo etiquetado in situ de las células fagocitarias activas, que claro off cadáveres de células en el accidente cerebrovascular. El enfoque es importante para evaluar la reacción del cerebro a la isquemia debido a que sólo una pequeña proporción de los fagocitos presentes en el cerebro isquémico participar en el aclaramiento de la muerte celular.
El objetivo general de este procedimiento es etiquetar selectivamente las células fagocíticas activas, que eliminan los cadáveres celulares en caso de accidente cerebrovascular. Esto se logra preparando primero los componentes para la reacción de amplificación de señal basada en Tite. El segundo paso es preparar las secciones.
A continuación, se realiza la reacción de marcaje utilizando la enzima vaccinia, topoisomerasa y sondas fluorescentes responsables. El paso final es la mejora de la señal fluorescente basada en IDE. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para evaluar el aclaramiento fagocítico de las células muertas en secciones de tejido de la isquemia cerebral focal.
La eliminación de las células muertas por parte de los fagocitos juega un papel importante en la recuperación del cerebro después de la isquemia. El método presentado determina la eficiencia de este proceso etiquetando solo aquellos tamaños de pego que eliminan activamente las células muertas. Aunque este método proporciona información sobre el cerebro isquémico, también se puede utilizar para estudiar la lesión isquémica en otros órganos y tejidos.
Donde la FA es importante la eliminación ácida de las células muertas. Aunque el paso de amplificación de señal IDE o TSA se produce en la etapa final del etiquetado, la preparación para esta reacción puede llevar más de una hora. Por lo tanto, es más conveniente hacer primero los reactivos TSA.
El primer paso es hacer la solución madre de TYROM fluorado cuatro a 300 microlitros de DMSO en los archivos de reactivos de tyrom incluidos en el kit de etiquetado TSA. A continuación, prepare el tampón de lavado TNT para disolver completamente el reactivo de bloqueo. Al hacer el tampón de bloqueo de TNB, agréguelo lentamente en pequeños incrementos mientras revuelve, caliente la solución gradualmente a 55 grados centígrados.
Con agitación continua, la solución se verá lechosa y debe llevarse a temperatura ambiente antes de usar alícuota y almacenarse a menos 20 grados Celsius para uso a largo plazo para este procedimiento, los portaobjetos se preparan con anticipación montando secciones de cinco micrómetros de grosor. Cortado de tejido fijado en formol. Primero, trate las secciones con xileno durante 15 minutos, rehidrate las secciones a través de una serie de lavados con etanol, seguidos de dos lavados en agua.
A continuación, prepare la solución de trabajo de la proteinasa K diluyendo una solución madre a 50 microgramos por mililitro en PBS. La parte más difícil de este experimento es determinar el período de tiempo ideal para los controles de digestión de la proteinasa K, con tiempos de digestión más cortos y más largos para garantizar el éxito, dependiendo del tamaño y el tipo de tejido. Añadir el volumen adecuado de solución de trabajo de proteína ACE K a las secciones e incubar durante 15 minutos a 23 grados centígrados.
Después de la incubación, lave las secciones en agua destilada dos veces durante cinco minutos cada una. Mientras las secciones se remojan, prepare la mezcla de etiquetado que contiene la sonda activa. Para preparar la solución de sonda activa, combine los oligonucleótidos con agua un molar triss, HCL y la vaccinia topoisomerasa suministrada en el kit mezclado suavemente por pipeteo e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la activación de la sonda.
Después del segundo período de lavado, tome las secciones del frasco y aspire el agua restante. Cuando esté listo, aplique la solución de sonda activa preparada anteriormente para cubrir. Desliza las secciones e incuba durante 15 minutos a 23 grados centígrados.
Después de la incubación, sumerja los portaobjetos en agua para quitar suavemente los cubreobjetos. Lave los portaobjetos en agua tres veces durante cinco minutos cada uno. Después del último lavado, cubra las secciones de tejido con tampón de bloqueo de TNB e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Durante este tiempo, prepare una dilución de uno a 100 de conjugados de peroxidasa de rábano picante y granulados. S-A-H-R-P en el tampón de bloqueo TNB, recupere los portaobjetos y aspire el tampón de bloqueo TNB. Antes de aplicar la solución S-A-H-R-P, use suficiente reactivo para cubrir toda la sección de tejido.
Una vez cubiertos, incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente Después de la incubación, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno. En el tampón de lavado TNT a temperatura ambiente, prepare una dilución de uno a 50 de caldo de fluoro cuatro TY IDE en un diluyente de amplificación x inmediatamente antes de usar. Pipetee la solución en los portaobjetos cubriendo completamente la sección de tejido.
Dado que la solución no se puede reutilizar, deseche cualquier porción no utilizada que quede. Incuba los portaobjetos a temperatura ambiente durante tres a 10 minutos. Controla la fluorescencia.
Aumente bajo el microscopio hasta que los primeros indicios de estructuras sean visibles en este momento. Proceda rápidamente al paso de lavado. Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno.
En TNT Tampón de lavado a temperatura ambiente con agitación. Después del lavado, agregue la solución antidecoloración con DPI y cubreobjetos. Observe los resultados bajo un microscopio de fluorescencia.
Estas imágenes muestran dos ejemplos de aclaramiento ácido de PHA. La tinción nuclear se muestra en fluorescencia azul y la sonda topográfica de vac responsable se muestra en los diagramas de fluorescencia verde de los eventos presentados en estas imágenes muestran núcleos de fagocitos y núcleos adicionales engullidos por tics en varias etapas de la digestión. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas tres horas si se realiza correctamente.
Después de ver este video, sabrá cómo usar sondas fluorescentes confiables en secciones de tejido. También podrá etiquetar selectivamente los ides activos que eliminan las células muertas en el cerebro isquémico.
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Descripción general
Este artículo presenta una técnica de fluorescencia novedosa para marcar selectivamente células fagocíticas activas implicadas en la eliminación de restos celulares tras un accidente cerebrovascular. El método es fundamental para comprender la respuesta del cerebro a la isquemia, ya que solo una pequeña fracción de las células fagocíticas participa en este proceso de eliminación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Microscopía de Fluorescencia
Antecedentes
- La eliminación fagocítica de células muertas es vital para la recuperación cerebral tras la isquemia.
- Solo un subconjunto de fagocitos participa activamente en este proceso.
- Comprender este mecanismo puede orientar estrategias terapéuticas.
- El método presentado también puede aplicarse a otros órganos y tejidos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica para marcar selectivamente fagocitos activos.
- Evaluar la eficiencia de la eliminación fagocítica en tejido cerebral isquémico.
- Proporcionar información sobre la dinámica de la eliminación de células muertas.
Métodos Utilizados
- Preparación de los componentes de la reacción de amplificación de señal basada en Tite.
- Reacción de marcado utilizando vaccinia, topoisomerasa y sondas fluorescentes.
- Microscopía de fluorescencia para la visualización de células marcadas.
- Optimización de los tiempos de digestión con proteinasa K para secciones de tejido.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de fagocitos activos en tejido cerebral isquémico.
- Visualización de la actividad fagocítica mediante microscopía de fluorescencia.
- Demuestra la aplicabilidad del método a otros tejidos.
- Información sobre el momento y la eficiencia de la eliminación fagocítica.
Conclusiones
- La técnica desarrollada mejora la comprensión de los procesos fagocíticos en la isquemia.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de eliminación celular.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a diversos sistemas orgánicos afectados por la isquemia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación selectiva de la eliminación fagocítica activa en el accidente cerebrovascular experimental permite desactivar mecanismamente las vías neuroinflamatorias y orienta la validación de objetivos para estrategias de recuperación del SNC. Este método basado en sondas fluorescentes ligables proporciona confianza predictiva al evaluar la eficiencia de los fagocitos encargados de la gestión de residuos, apoyando la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la investigación preclínica. Su capacidad para distinguir entre fagocitos activos e inactivos mejora la toma de decisiones en carteras de programas terapéuticos neuroprotectores y regenerativos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos de eliminación fagocítica en tejido cerebral relevante para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de objetivos al distinguir fagocitos activos de células circundantes.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas en las vías neuroinflamatorias y regenerativas.
- Proporciona datos cuantitativos para una predicción confiable en programas del SNC en etapas iniciales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara secciones de tejido validadas para flujos de trabajo de imágenes cuantitativas posteriores.
- Normaliza la detección de eventos fagocíticos activos para obtener resultados de ensayos reproducibles.
- Permite la realización de cribados a gran escala de moduladores que afectan la eficiencia de la eliminación por fagocitosis.
- Facilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre la eliminación de células muertas en situ.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad de lesión isquémica para el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica de estrategias de recuperación del SNC.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo para candidatos neuroprotectores y regenerativos.
- Ofrece una reducción predictiva de riesgos para las complicaciones biológicas en etapas avanzadas relacionadas con el fracaso del aclaramiento celular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la evaluación cuantitativa de la eliminación fagocítica en modelos de isquemia cerebral, apoyando tanto la validación de dianas como la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la eliminación mediada por fagocitos y la aclaración de vías en tejido isquémico.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de eventos fagocíticos activos para el desarrollo de ensayos.
- Análisis: Ofrece mediciones basadas en fluorescencia para comparar la eficiencia de eliminación entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos preclínicos relevantes para lesiones del sistema nervioso central y su recuperación.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para estudiar la eliminación fagocítica en diversos contextos de tejido y enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos del SNC.
- Valor operativo: Estandariza la cuantificación del aclaramiento fagocítico para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la eficiencia del capital al aclarar tempranamente el riesgo biológico.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas neuroinflamatorios y regenerativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y preparación de secciones de tejido.
- Necesita acceso a reactivos especializados, incluyendo sondas fluorescentes ligables y kits enzimáticos.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de marcado y adquisición de imágenes para lograr reproducibilidad.
- Adaptable a diversos tipos de tejidos, aunque puede requerir optimización de los pasos de digestión y marcado.
- Depende del control preciso de las reacciones enzimáticas y de los parámetros de imagen para obtener resultados cuantitativos.
