Tres Culturas dimensionales: una herramienta para estudiar normal Acinar Arquitectura vs transformación maligna de las células de la mama

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el sistema de cultivo tridimensional como un medio para distinguir el fenotipo benigno de la mama del fenotipo maligno de la mama. Esto se logra primero colocando las células de control y experimentales por triplicado en una capa de matrigel reducido en factor de crecimiento en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos. El segundo paso es dar cambios de medio completos y frescos con 2% de GFR Matrigel cada cuatro días, permitiendo que las colonias similares a los asininas crezcan durante 10 a 15 días.

A continuación, se adquieren las imágenes de contraste de fase de las colonias aser cultivadas en 3D con una resolución de cinco veces. El paso final es procesar los cultivos similares a aser para el análisis inmunocitoquímico con marcadores moleculares relevantes, seguido de la adquisición de imágenes confocales de dos colonias similares a aser de tinción inmunológica en C en la sección media. En última instancia, el contraste de fase y las imágenes confocales de las células cultivadas en cultivo 3D se utilizan para identificar los cambios fenotípicos y moleculares celulares y, por lo tanto, diferenciar las células mamarias benignas de las células malignas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como los cultivos bidimensionales, los ensayos de invasión o migración, es que puede recapitular la arquitectura tisular de la mama benigna y su pérdida de organización durante la transformación maligna. Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar eficazmente para diferenciar las células mamarias benignas de las células mamarias malignas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de mama, como el defecto de las vías de señalización en el fenotipo celular, y en la identificación de nuevas vías oncogénicas o supresoras de tumores.

Para comenzar el experimento, descongele el factor de crecimiento reducido o GFR matrigel a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, caliente el medio HME completo a 37 grados centígrados y coloque un portaobjetos de cámara de ocho pocillos sobre hielo para que se enfríe. Agregue 40 microlitros de GFR Matrigel en el centro de cada pocillo del portaobjetos preenfriado.

Extienda el gel lo más uniformemente posible con una punta de pipeta P 200, evitando la formación de burbujas y el esparcimiento excesivo, que puede provocar la formación de meniscos. Luego solidifique el gel de matri incubando el portaobjetos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 mientras el gel de matri solidifica los ojos de tripsina, las células HME, luego recójalas en un tubo de 15 mililitros y haga girar las células a 150 veces la gravedad durante cuatro minutos, cuente las células y diluya a 12, 500 células por mililitro. En medio completo, agregue matrigel GFR a la suspensión celular a una concentración final del 2% y agregue 400 microlitros de la solución a cada pocillo del portaobjetos de la cámara precodificada.

A continuación, coloque el portaobjetos en una incubadora tamponada con CO2. Reemplace el medio por un medio completo nuevo cada cuatro días durante 15 días. Para los estudios de inhibidores, agregue inhibidores de moléculas pequeñas al medio completo en el momento de la siembra, seguido de cambios de medios nuevos complementados con los inhibidores cada tres días para comenzar el crecimiento de las células y triplicados para cada conjunto de tratamiento.

Tome imágenes de contraste de fase de las estructuras aser de cada pozo con una resolución de cinco veces utilizando un microscopio de contraste de fase conectado a un cambiador de diapositivas y una computadora. Tome las imágenes moviendo la diapositiva de un marco a otro, cubriendo todo el hueco de la diapositiva con cámara. Cuente el número total de estructuras aser, el número de estructuras planas redondas simples y el número de estructuras multi aser o estructuras de crecimiento desordenado que carecen de organización.

Y con los procesos de ramificación emanantes, calcule el porcentaje de estructuras aser planas redondas individuales frente a estructuras malignas y trace la información. Como un gráfico de columnas. Calcule la significación mediante la prueba T de Student no apareado de dos colas.

Prepare los reactivos para la tinción de inmunofluorescencia como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, utilice una pipeta P 200 para aspirar cuidadosamente los medios acondicionados. A continuación, fije el ASIN o las estructuras con formaldehído al 2% recién preparado a temperatura ambiente durante 20 minutos después de la fijación, impregne las células con 0,5%tritton X 100 durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Luego lave los cultivos tres veces con glicina de 100 milímetros durante 10 a 15 minutos para cada lavado. A continuación, bloquee las celdas en el búfer de bloque primario durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, incubar los cultivos en 20 microgramos por mililitro de cabra anti ratón fab dos fragmentos en tampón de bloque primario, también llamado segunda solución de bloqueo durante 30 minutos para bloquear las especies de IgG de ratón de reacción amino en el matrigel.

Después del bloqueo, incube las células con el anticuerpo primario en una segunda solución de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las células tres veces con tampón de inmunofluorescencia o tampón I con balanceo suave durante 10 a 15 minutos para cada lavado. A continuación, incubar las células con anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes en tampón if F durante 45 minutos.

A continuación, lave las células tres veces durante 10 minutos cada una con un tampón if F y un balanceo suave. Monte los portaobjetos con DPI que contengan reactivo antidecoloración para visualizar los núcleos. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente.

A continuación, adquiera imágenes confocales en la sección media de la colonia de células que crecen en la parte superior de la matrigel y una serie de secciones ópticas a lo largo de toda la longitud de la estructura del asner mediante el apilamiento z de imágenes confocales de células DHE teñidas con HME controladas y C CN seis células knockdown en el quinto día muestran que las células knockdown carecen de organización. En el día 15, las células de control se detienen en crecimiento con ASIN o estructuras diferenciadas y un lumen bien definido que diverge de las células knockdown, que presentan una ramificación invasiva y un fenotipo tubular. La tinción inmunofluorescente muestra la pérdida de expresión de laminina v alfa seis integrina y ECA herrina, lo que indica la ruptura de la membrana basal, pérdida de polaridad basal y contacto con las células celulares, respectivamente.

En las células malignas, las células control muestran una capa intacta alrededor de la expresión basal estúpida de alfa seis, integrina, expresión apical de GM one 30 y eca. Aquí, en la unión de las células celulares, el fenotipo maligno de las células HME CCN seis knockdown se revirtió con el tratamiento exógeno de líneas celulares de mama altamente metastásicas de la proteína CCN seis humana recombinante purificada, algunas 1 49 y M-D-A-M-B 2 31. Se trataron con inhibidores de la mapcinasa P 38, SB 2 0 3 8 50 y SB 2 0 2 1 90, que redujeron el comportamiento maligno.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar células mamarias en cultivo 3D y usar de manera efectiva el crecimiento en matrigel como lectura para diferenciar los fenotipos de células mamarias benignas de las malignas.