Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

El objetivo general del siguiente procedimiento es obtener imágenes de fluorescencia de superresolución que permitan esclarecer aspectos importantes de la organización de vesículas con una resolución que de otro modo sería inalcanzable mediante microscopía de fluorescencia. Esto se logra primero mediante la transección de neuronas del hipocampo con ADN que codifica quimeras fotoconvertibles de carga vesicular. En el segundo paso, se adquieren imágenes en bruto muestreadas escasamente mediante el sistema de microscopía de superresolución.

A continuación, las imágenes en bruto se procesan para producir una imagen de superresolución. En el último paso, los datos se cuantifican para elucidar la organización de las vesículas. Finalmente, los perfiles lineales de la intensidad de los puntos pueden utilizarse para comparar la separación de las vesículas con su ancho, determinando así si las vesículas están lo suficientemente cercanas como para formar un cúmulo mediante este procedimiento.

La microscopía de localización activada por luz con un solo color, o PALM, puede utilizarse para estudiar la organización de orgánulos en la mayoría de los tipos de células cultivadas. Para encender el sistema de imagen de superresolución y comenzar la adquisición de imágenes, primero encienda la alimentación de la lámpara de arco. A continuación, active los interruptores del PC del sistema y de los componentes en el control remoto de alimentación.

Cambie a encendido después de que se encienda la tableta de control del microscopio, encienda la computadora y lance el software. Amplíe la ventana de estado de arranque para verificar que el sistema se esté cargando normalmente, y seleccione la opción de iniciar sistema en el cuadro de diálogo de inicio de sesión. Para colocar la muestra para su visualización, abra los paneles frontal y superior del gabinete de seguridad láser e incline el brazo de luz transmitida para acceder a la platina y a los objetivos.

A continuación, coloque aceite en el objetivo alpha plan APO Chromat de 100 x para reflexión interna total, fluorescencia o turf. Luego, seleccione un objetivo de baja magnificación para el paso inicial de enfoque. Ahora monte la muestra sobre la platina y eleve el objetivo hacia la muestra.

Monitorear la posición del lente utilizando la función X, Y, Z de la tableta de control. Deténgase cuando el lente esté aproximadamente enfocado. Para visualizar la muestra y ajustar finamente el enfoque.

Baje el brazo de luz y cierre completamente los paneles de acceso. Luego, en la pestaña de localización, haga clic en el símbolo de expansión del ocular para mostrar un esquema del trayecto de la luz. Seleccione trans encendido y verifique que el esquema muestre la luz transmitida desde la bombilla incidiendo sobre la muestra. Mire a través de los oculares y enfoque las células utilizando la tableta de control como guía.

Luego, para identificar las células que expresan el DRA dos, seleccione la luz reflejada y el filtro adecuado para observar la emisión verde del den dos. Examine la laminilla utilizando luz reflejada de baja intensidad hasta encontrar una célula sana y brillante, y luego configure el software para adquirir los datos palm. Cambie a la pestaña de adquisición y utilice el administrador de experimentos para cargar la configuración de adquisición palm experimental adecuada.

Cuando aparezca el menú emergente con una consulta sobre la activación de los láseres, haga clic en sí. Luego, enfoque la imagen de la célula en el plano de la cámara. Seleccione únicamente la pista de 488. Ajuste los parámetros de adquisición, como la ganancia E-M-C-C-D, y luego elija la adquisición continua.

A continuación, ajuste la pantalla al nivel de brillo deseado y mueva el objetivo hasta que la imagen en la pantalla esté enfocada. Luego, para obtener una imagen convencional de campo amplio, haga clic en el botón de captura y guarde la imagen. Para configurar la iluminación basada en césped en la vía de 488, seleccione césped en el botón epi césped.

Para optimizar la iluminación basada en barrido, seleccione la adquisición continua y ajuste el ángulo de barrido hacia una posición más clara hasta que el fondo se oscurezca repentinamente y el espécimen pueda enfocarse en un solo plano. Cambie a la vía de 561 con el láser de 405 nanómetros apagado. Establezca la ganancia del E-M-C-C-D en aproximadamente 200 y el tiempo de exposición en unos 50 milisegundos.

Seleccione el filtro de emisión que transmite en el rojo y ajuste la intensidad del láser a aproximadamente el 40 %. Verifique nuevamente el ángulo del prisma para la pista de 561. Para reducir el fondo, ilumine la muestra hasta que el fondo disminuya. Utilice la pista de 561 con solo el láser de 561 activado.

Para recopilar los datos de PALM, encienda el láser de 405 nanómetros para la pista de 561 y ajuste la intensidad del láser de 405 a aproximadamente 0,01 %. Para monitorear la imagen PALM calculada durante la adquisición, expanda el menú de opciones de procesamiento en línea y active el procesamiento en línea de PALM para procesar con los parámetros predeterminados. Haga clic en iniciar experimento para comenzar la adquisición; durante la recopilación de datos, supervise visualmente la fotoconversión, aumentando la intensidad del láser fotoconvertidor de 405 nanómetros. Cuando la fotoconversión comience a disminuir.

Cuando la conversión fotográfica ya no aumente tras un incremento en la intensidad del láser, haga clic en finalizar el paso actual. Para terminar el experimento, guarde el archivo. Para procesar las imágenes guardadas, haga clic en la pestaña de procesamiento, expanda el menú de método y expanda el submenú de PALM.

Seleccione nuevamente palma entre las cuatro subopciones. Elija la imagen adecuada para que aparezca en la ventana de visualización. Expanda los parámetros del método y haga clic en seleccionar para ingresar la imagen, expanda el campo de configuración y elija predeterminado para ejecutar la detección de picos y la localización con las opciones predeterminadas.

Pulse aplicar en la pestaña de procesamiento para calcular la imagen palm, que aparecerá en una pestaña separada en la ventana de visualización, con el fin de filtrar cualquier componente mal muestreado en los datos. Utilice el teorema de muestreo de Nyquist y la herramienta eliminar valores atípicos palm para eliminar picos en regiones donde la distancia media entre picos, d minúscula, es demasiado grande para resolver una vesícula de diámetro, D mayúscula. Con la imagen palm en la ventana de visualización, haga clic en seleccionar para introducir la imagen y luego haga clic en aplicar. La nueva imagen aparecerá en una pestaña separada en la ventana de visualización para filtrar cualquier flora.Fours mal localizada.

Vaya a la pestaña de filtro PAL y limite la flora aceptada. Cuatro precisiones de localización con una sigma inferior a 35 nanómetros. Para elegir un modo de visualización de la imagen PAL, vaya a la pestaña de renderizado PAL, seleccione una resolución de píxeles y el modo de visualización deseado.

En esta imagen, se muestra en rojo un producto final representativo de palma del imagenológico y procesamiento de una vesícula de núcleo denso neuronal o VND. Las coordenadas laterales de las agrupaciones localizadas en blanco se muestran utilizando el modo de visualización Centro, y la imagen de superresolución de la vesícula asociada se muestra utilizando el modo de visualización Gaussiano. En esta segunda figura, se presentan imágenes análogas de campo amplio en verde e imágenes de palma en rojo del soma y procesos proximales de una neurona hipocampal de ocho días in vitro que expresa tpa, un peligro dos.

Las características importantes de las imágenes incluyen la extensa correspondencia uno a uno y el solapamiento en amarillo entre los puntos y las imágenes convencionales y palm. El tamaño significativamente más pequeño de los puntos palm y la resolución ocasional de un único punto de campo amplio en múltiples puntos palm. Aquí, una imagen palm de D cvs a lo largo de una parte de un proceso de una segunda neurona del hipocampo que expresa tpa.

Se muestra DENDRA dos. Observe el pequeño diámetro y la apariencia homogénea de los puntos, así como la observación poco frecuente de puntos estrechamente opuestos, que representan agrupaciones putativas de VDC. En esta figura final, se describe un método cuantitativo sencillo para determinar si dos o más VDC están lo suficientemente cerca como para formar un grupo.

Se generan perfiles lineales de las intensidades de los puntos, como se muestra en las gráficas, que luego pueden utilizarse para cuantificar la separación de las VDC y el ancho de las VDC. Si la separación supera significativamente al ancho, las VDC no se tocan entre sí. Por el contrario, si la separación es aproximadamente igual al ancho, las VDC podrían estar en contacto. Según estos criterios, las VDC en esta imagen se clasificaron como no en contacto, mientras que las VDC en esta imagen se clasificaron como en contacto siguiendo este procedimiento.

Se pueden utilizar otros métodos, como la palma de dos colores, para estudiar la localización relativa de estructuras distintas.