El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo

El objetivo general de este procedimiento es analizar la composición de ácidos grasos del hígado. Esto se logra pesando primero una muestra de hígado y homogeneizándola. El segundo paso es extraer todos los lípidos de la muestra de hígado homogeneizada.

A continuación, se separan las clases individuales de lípidos, como los ésteres de colesterol, mediante extracción en fase sólida. El paso final es la ificación y derivación de las clases de lípidos en ésteres metílicos de ácidos grasos. En última instancia, la cromatografía de gases se utiliza para mostrar cómo la composición de ácidos grasos de los tejidos puede cambiar después de una intervención nutricional o verse influenciada por cambios en el estado fisiológico, como el embarazo.

Aunque este método puede proporcionar una visión de la composición de los ácidos grasos de los tejidos, también se puede aplicar a otros tipos de muestras como aceite, semillas y alimentos. En general, los usuarios nuevos en esta técnica pueden tener dificultades, ya que algunas partes del protocolo requieren destreza manual y necesitan práctica, como la recopilación repetitiva de fases superiores e inferiores. La demostración del procedimiento estará a cargo de Hena, Fisk y Annette West, técnica y estudiante de doctorado de nuestro laboratorio.

Primero corte aproximadamente 100 miligramos de hígado congelado y pese el tejido. Coloque el pañuelo en un tubo de plástico en una cubeta de hielo y agregue 0,5 mililitros de cloruro de sodio al 0,9% de agua helada. A continuación, homogeneizar el tejido y transferirlo a un tubo de vidrio con tapón de rosca.

Utilice otros 0,3 mililitros de cloruro de sodio al 0,9% para transferir el tejido restante al tubo de vidrio con tapón de rosca. A continuación, agregue 100 microgramos de colesterol heta dechen estándar disuelto en dos a uno, cloroformo seco a metanol al tubo, seguido de cinco mililitros adicionales de la misma solución solvente que contiene 50 miligramos por litro de hidroxitolueno butilado. Después de agregar un mililitro de cloruro de sodio molar, tape el tubo y mezcle bien la muestra mediante vórtice hasta que se vea uniforme.

A continuación, centrifugar la muestra a 1000 veces G durante 10 minutos con un descanso lento a temperatura ambiente. Cuando termine, recoja la fase inferior con un vaso más allá de su pipeta y transfiérala a un nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca. A continuación, seque la muestra bajo nitrógeno a 40 grados centígrados.

En este punto, conecte el tanque SPE a una bomba de vacío y coloque un cartucho SPE de aminopropil sílice en el tanque. Coloque un nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca etiquetado como TAG y CCE en el estante del tanque debajo de la columna para recoger la primera fracción. Disuelva el extracto lipídico total en un mililitro de cloroformo seco y mezcle la muestra por vórtice.

A continuación, transfiera la muestra a la columna con una pipeta de pasta de vidrio y deje que el líquido gotee en el tubo con tapón de rosca por gravedad. Cuando el líquido ya no gotee de la columna, retire el líquido restante al vacío. A continuación, eluir la fracción TAG y CE lavando la columna dos veces con un mililitro de cloroformo seco al vacío.

Cuando todo el líquido haya aludido de la columna, seque la fracción TAG y CE bajo nitrógeno a 40 grados centígrados. Coloque un nuevo cartucho de aminopropil sílice SPE en el tanque SPE y coloque un tubo de vidrio con tapón de rosca en la bandeja del tanque debajo del cartucho para recoger los desechos. Lave la columna con un mililitro de hexano seco tres veces al vacío.

Después de apagar la aspiradora, lave la columna con un último mililitro de hexano H por gravedad. Después de reemplazar el tubo de desagüe con un nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca etiquetado como ce, disuelva la fracción seca de TAG y CE en un mililitro de hexano seco y mezcle la muestra por vórtice. A continuación, transfiera la muestra a la columna utilizando un paso de vidrio o una pipeta, y deje que el líquido gotee a través de la columna por gravedad.

Cuando el líquido ya no gotee de la columna, retire el líquido restante al vacío bajo vacío. Lavar la columna dos veces con un mililitro de hexano seco para eluir la CE y secar la fracción recolectada bajo nitrógeno a 40 grados centígrados. A continuación, añada 0,5 mililitros de tolueno seco a la fracción CE separada y mezcle la muestra por vórtice.

Añadir un mililitro de un reactivo de metilación previamente preparado a la muestra disuelta en tolueno seco. A continuación, tape el tubo de forma segura y mezcle Caliente suavemente la muestra durante dos horas a 50 grados centígrados. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, agregue un mililitro de solución neutralizante.

A continuación, agregue uno de hexano seco a la muestra Después de centrifugar en vórtice, centrifugar las muestras a 250 veces G durante dos minutos con un descanso bajo a temperatura ambiente. Cuando termine, recoja la fase de fama superior y transfiérala a un nuevo tubo de vidrio desechable con tapa de rosca. Secar la muestra de fama recolectada bajo nitrógeno a 40 grados centígrados.

Después de colocar un tubo de desagüe en el tanque de SPE y un cartucho de gel de sílice SPE en el tanque, lave la columna tres veces con un mililitro de hexano seco al vacío y un mililitro de hexano seco al vacío. Después de la retirada de los lavados de residuos. Agregue un nuevo tubo de desagüe en el tanque, luego disuelva la muestra de fama CE en un mililitro de hexano seco.

Después de mezclar la muestra por vórtice, transfiérala a la columna con un paso de vidrio o una pipeta. Una vez que el líquido haya goteado a través de la columna bajo gravedad, lave la columna tres veces con un mililitro de hexano al vacío. A continuación, retire los lavados de residuos y coloque un nuevo tubo con tapón de rosca con la etiqueta CE fame en el tanque.

Eluir la fracción de fama CE con dos mililitros de 95 a cinco hexano seco a d éter etílico. Luego seque la fracción recolectada bajo nitrógeno a 40 grados Celsius, disuelva la fracción seca en 75 microlitros de hexano seco y mezcle la muestra por vórtice después de que la muestra se haya mezclado por vórtice. Transfiéralo a un vial de muestra automática GC después de repetir el paso anterior.

Analice la muestra en un cromatógrafo de gases si el protocolo se sigue con éxito. Como se ilustra aquí, se debe obtener un cromatograma con picos claros, simétricos y bien definidos y con un ruido de fondo mínimo. Si se ha producido contaminación, el cromatograma mostrará picos adicionales y exhibirá picos no simétricos o sesgados como se muestra aquí.

La contaminación por colesterol libre se producirá cuando se corre fama derivada de CE a menos que se elimine el colesterol. El uso de una mezcla de calibración preparada permite la identificación de la fama en la muestra. La mezcla de calibración se ejecuta utilizando la misma configuración del instrumento que las muestras para que el cromatograma se pueda comparar con la muestra y los picos identificados en función de sus tiempos de retención, como se ilustra aquí.

El pico de 16 ceros se resalta aquí para ilustrar la comparación de los tiempos de retención de la mezcla de calibración en el cromatograma superior con los ácidos grasos. En la traza de la muestra inferior, lo que permite un etiquetado correcto de los ácidos grasos, se utiliza el área máxima para calcular el porcentaje de ácidos grasos específicos dentro del total. Una vez que se han recopilado los datos, es útil inspeccionarlos en busca de valores atípicos, como se muestra aquí.

A continuación, se pueden investigar más a fondo las muestras atípicas y repetir la extracción o el análisis si es necesario. Como se muestra aquí, la fama dentro del hígado de rata CE se describe como un porcentaje del total de ácidos grasos dentro del hígado CE. Estos datos describen los ácidos grasos CE en el hígado de ratas vírgenes o embarazadas alimentadas durante 20 días con una de tres dietas diferentes.

El análisis estadístico utilizando dos factores Innova revela efectos significativos de la dieta y el embarazo sobre la proporción de varios ácidos grasos, así como interacciones significativas entre la dieta y el embarazo. A modo de ilustración, el contenido de ácido ónico de la CE hepática en ratas preñadas está más influenciado por la dieta que el de las hembras vírgenes. Esta técnica permite completar 20 muestras al día de principio a fin si se realiza correctamente.

Una vez dominado, el procesamiento por lotes de muestras puede aumentar el rendimiento y duplicar la cantidad procesada en una semana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la composición de ácidos grasos de clases individuales de lípidos mediante extracción en fase sólida y cromatografía de gases. No olvide que trabajar con disolventes puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como trabajar en campanas extractoras y usar EPI adecuados mientras se realiza este procedimiento.