Name: El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a analizar la composición de ácidos grasos en hígado de rata durante el embarazo mediante cromatografía de gases. Este método permite estudiar los cambios metabólicos maternos y evaluar el impacto de la dieta.

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Los autores desean agradecer la contribución de Meritxell Romeu-Nadal al estudio de la rata.

1. Procedimientos animales <ol><li> Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo de acuerdo con el Ministerio del Interior Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley (1986). </li><li> Mate de ratas Wistar a partir de 10 semanas de edad mediante la cría monógama, y ​​confirmar el embarazo por la aparición de un tapón vaginal. Anote este como el día 1 de la gestación, y comenzar la dieta experimental. Para las hembras vírgenes, albergar cada rata individual, y comenzar la dieta experimental. </li><li> Después de alimentar a las dietas experimentales durante 20 días la eutanasia a las ratas por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> El uso de fórceps y tijeras de disección para exponer la cavidad abdominal y extirpar el hígado mediante la reducción de los ligamentos, que conectan el hígado al diafragma, la pared anterior del abdomen, el estómago y el duodeno. Lavar el hígado en PBS y congelar en nitrógeno líquido antes de guardarlo a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparación de un extracto lipídico total 9 <ol><li> Añadir molecultamices ar (para llenar 1/10 del recipiente de disolvente) a todos los disolventes para crear disolventes &quot;secos&quot;. Llevar a cabo todos los trabajos de disolvente dentro de una campana de humos. </li><li> Cortar aproximadamente 100 mg de hígado congelado y pesar. Coloque el tejido en un tubo en un cubo de hielo y se añade 0,8 ml de hielo frío 0,9% de NaCl. Homogeneizar el tejido. </li><li> Añadir estándares internos disueltos en 1 ml / mg de cloroformo seco: metanol (02:01, v / v) que contiene hidroxitolueno butilado (BHT; 50 mg / l) como anti-oxidante. Durante 100 mg de hígado de rata añaden 100 g de la norma CE (Cholesteryl heptadecanoato 17:00) Precaución:. Cloroformo y BHT son peligrosos. </li><li> Añadir 5,0 ml de cloroformo seco: metanol (02:01, v / v) que contenía BHT (50 mg / L). </li><li> Añadir 1,0 ml de 1 M NaCl, mezclar bien por agitación hasta que la mezcla se ve uniforme. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li><li> Centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos, bajo el freno a temperatura ambiente. </li><li> Recoger menorfase con una pipeta Pasteur de vidrio, traslado al nuevo tubo de vidrio de tapón de rosca y seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li></ol> 3. La separación de clases de lípidos por extracción en fase sólida (SPE) 10 <ol><li> Conectar el depósito de la SPE a una bomba de vacío y colocar aminopropil cartucho SPE de sílice en el tanque. </li><li> Coloque el nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca TAG marcado CE y en el bastidor del tanque en la columna para recoger primera fracción. </li><li> Disolver el extracto de lípidos totales en 1,0 ml de cloroformo seco y vórtice. </li><li> Aplicar la muestra a la columna usando una pipeta Pasteur de vidrio y dejar a gotear a través de en el tubo con tapón de rosca por gravedad. Cuando no hay más gotas caen, eliminar el líquido restante por medio de vacío. </li><li> Se eluye la fracción TAG y CE al vacío, se lava la columna con 2 x 1,0 ml lavados de cloroformo seco. </li><li> Cuando se elimina todo el líquido, se seca el TAG y CE fraction bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li><li> Coloque el nuevo tapón de rosca tubo de vidrio PC marcado en la bandeja del tanque, en la columna. </li><li> Eluir la fracción de PC bajo vacío con la adición de 2 x 1,0 ml de cloroformo seco: metanol (60:40, v / v) hasta que se retira todo el líquido de la columna. </li><li> Retire y fracción PC seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li><li> Colocar un nuevo tapón de rosca de tubo de vidrio de PE marcado en la bandeja de depósito y eluir la fracción de PE con la adición de 1,0 ml de metanol seco bajo vacío. </li><li> Retire y fracción PE seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li><li> Coloque el nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca marcado NEFA en la bandeja de depósito y eluir la fracción de NEFA bajo vacío por la adición de 2 x 1,0 ml de lavados de cloroformo seco: metanol: ácido acético glacial. (100:2:2, v / v / v) Precaución: El ácido acético glacial es peligroso. </li><li> Eliminar fracción recogida de NEFA y seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li><li> Coloque un nuevo cartucho de SPE de sílice aminopropilo en el tanque de SPE y colocar un tubo de vidrio con tapón de rosca en la bandeja del tanque debajo del cartucho de recogida de residuos. </li><li> Lavar la columna con 3 lavados de hexano seco bajo vacío y luego un lavado de 1,0 ml final bajo la gravedad. No permita que el cartucho se seque (a su vez los canales de columna de cartucho a una posición cerrada cuando el nivel de hexano se encuentra cerca de la matriz de cartucho) Precaución:. Hexano es peligroso. </li><li> Vuelva a colocar el tubo de residuos con tubo de vidrio nuevo tapón de rosca marcado CE. </li><li> Disolver la fracción TAG y CE se secó (preparado en la etapa 3.6) en 1,0 ml de hexano seco y vórtice. Aplicar esto a la columna usando una pipeta Pasteur de vidrio y dejar a gotear a través de bajo gRavity. </li><li> Cuando no hay más gotas caen, eliminar el líquido restante al vacío. </li><li> En el vacío, se lava la columna con 2 x 1,0 ml lavados de hexano seco para eluir CE y fracción recogida seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li><li> Coloque el nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca de TAG marcado en la bandeja del tanque y TAG eluir con la adición de 2 x 1,0 ml de lavados de hexano seco: metanol: acetato de etilo (100:5:5) bajo vacío. </li><li> Fracción seco recogido en nitrógeno a 40 ° C. Las muestras pueden ser tapados y almacenados a -20 ° C en esta etapa hasta por una semana Precaución:. Acetato de etilo es peligroso. </li></ol> 4. Preparación de FAME de CE 10 <ol><li> Añadir 0,5 ml de tolueno seco a la fracción CE separados (recogido en el paso 3.19) y agitar Precaución:. Tolueno es peligroso. </li><li> Prepare el reactivo de metilación (metanol seco con 2% (v/ V) de H 2 SO 4), de los cuales 1,0 ml se requiere por muestra. Dispensar el volumen de metanol seco en un vaso o recipiente de plástico con tapa apto y agregue la cantidad necesaria de H 2 SO 4, gota a gota y mezcle por inversión Precaución:. El ácido sulfúrico es peligroso. </li><li> Añadir 1,0 ml de reactivo de metilación de las muestras disueltas en tolueno seco, tapar los tubos de forma segura, y mezclar suavemente. </li><li> Calentar las muestras durante 2 horas a 50 ° C. </li><li> Después de 2 horas retirar los tubos de calor. Una vez fría añadir 1,0 ml solución neutralizante (0,25 M KHCO3 0.5MK 2 CO 3) Precaución:. Bicarbonato de potasio y carbonato de potasio son peligrosos. </li><li> Añadir 1,0 ml de hexano seco y vórtice. </li><li> Se centrifuga a 250 g durante 2 min, bajo el freno a temperatura ambiente. </li><li> Recoger la fase superior, que contiene la FAME, y transferir a un nuevo tubo de vidrio desechable sin tapa roscada. </li><li> Seque el FAMA recogido bajode nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana. </li></ol> 5. Eliminación de la contaminación colesterol libre de FAME CE 14 (Colesterol libre puede contaminar la muestra; vea la Figura 1 en busca de rastros ejemplo cromatógrafo con y sin eliminación de colesterol). <ol><li> Coloque un tubo de residuos en el tanque de SPE y colocar un cartucho de SPE de gel de sílice en el tanque. </li><li> Lavar la columna con 3 x 1 ml de lavados de hexano seco bajo vacío y 1 x 1 ml bajo la gravedad. </li><li> Retire los residuos lavados y agregar nuevo tubo de residuos en el tanque. </li><li> Disolver FAME CE en 1 ml de hexano seco, vórtice. </li><li> Aplicar a la columna usando una pipeta Pasteur de vidrio y dejar que gotee a través bajo gravedad. </li><li> Lavar la columna con 3 x 1 ml lavados de hexano al vacío. </li><li> Retire los residuos lavados y colocar nuevo tubo sin tapón de rosca en el tanque de la etiqueta FAME CE. </li><li> Eluir laFAME CE con 2 x 1 ml de hexano seco: éter dietílico (95:5 v / v) lavados. </li><li> Seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras pueden ser tapados y almacenados a -20 ° C en esta etapa hasta por una semana Precaución:. Éter dietílico es peligroso. </li></ol> 6. Transferencia de FAME en GC Auto Sampler Vial <ol><li> Añadir 75 l de hexano seco para probar, vórtice, y la transferencia a un GC muestra auto vial. </li><li> Añadir un 75 hexano l seca aún más a la muestra, vórtice y traslado a la misma GC muestra auto vial. Las muestras pueden ser tapados y almacenados a -20 ° C en esta etapa hasta por un mes. </li></ol> 7. Análisis utilizando el cromatógrafo de gases 14 <ol><li> Analizar FAME en un cromatógrafo de gases. Ejemplo creado: 30 mx 0,25 m x 0,25 mm BPX-70 columna capilar de sílice fundida con el protocolo de la temperatura: Temperatura inicial de 115 ° C, mantenga 2 min, rampa de 10 ° C / min hasta 200 ° C, mantenga 18,5 min, rampa de 60 ° C / min hasta 245 ° C, hedad 4 min. Columna: de gas helio, velocidad de flujo 1.0, 14.6 presión y la velocidad 29. Inyector: Temperatura = 300 ° C. Detector: El flujo de hidrógeno 40.0, aire fluya 184.0, conforman Helio gas, flujo 45.0, temperatura = 300 º C. </li><li> Establecer relación de división en su caso (por ejemplo, 25:1 para el análisis FAME CE). </li><li> Determinar el área bajo cada pico usando el software apropiado y FAME identificar por comparación con patrones. Consulte la Figura 2, por ejemplo cromatogramas. </li><li> Utilice el área bajo los picos de los datos para calcular la contribución de los ácidos grasos individuales como porcentaje de los ácidos grasos totales. </li><li> Cálculo de las concentraciones absolutas de los ácidos grasos dividiendo el área del patrón interno por la cantidad añadida. Divida el área de cada ácido graso por este resultado a obtener concentraciones absolutas de cada ácido graso dentro de la cantidad de tejido usado. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

La cromatografía de gases es una técnica precisa a utilizar para el análisis de ácido graso, y su alta reproducibilidad considere esta técnica adecuada para análisis clínicos. Columnas de CG apropiados deben ser utilizados para permitir la identificación de ácidos grasos de interés, con columnas disponibles que tiene variaciones en la polaridad de la fase estacionaria, longitud de la columna y el diámetro interno. El uso de una columna capilar de sílice fundida en este método de análisis proporciona una buena estabilida...

La cromatografía de gases (GC) es una técnica bien establecida se utiliza para identificar y cuantificar la incorporación de ácidos grasos al interior de las acumulaciones de lípidos y membranas celulares de 1,2 durante la suplementación o fisiológicas condiciones tales como la obesidad y enfermedades relacionadas (como la diabetes) o un embarazo 3 - 5. También es adecuado para el análisis de los tipos y cantidades de grasas en los alimentos. Esto es útil cuando la caracterización de las dietas experimentales, así como garantizar que la industria alimentaria cumple con la normativa. Por ejemplo, GC se puede utilizar para confirmar la identidad y la cantidad de ácidos grasos dentro de un producto, tales como un suplemento dietético para asegurar que el etiquetado es correcto y reglamentos se adhiere a 6,7. Análisis de ácidos grasos puede proporcionar información valiosa sobre el metabolismo de lípidos en la salud y la enfermedad, el impacto del cambio en la dieta, y el efecto de los cambios en el estado fisiológico 8. Uso de GC para estudiar muestras durante el embarazo ha proporcionado importanteinformación sobre los cambios en los ácidos grasos y la homeostasis de los lípidos complejos 3. Antes de la separación cromatográfica, los lípidos son típicamente extrae de la muestra usando la solubilidad de los lípidos en mezclas de disolventes de cloroformo y metanol. Se añade cloruro de sodio para facilitar la separación de la mezcla en lípidos acuosa y orgánica que contiene fases 9,10. Clases de lípidos complejo de interés se pueden separar a partir del extracto total de lípidos por extracción en fase sólida (SPE). Esta técnica de separación eluye clases de lípidos basados ​​en su polaridad o afinidad de unión. Triacilgliceroles (TAG) y los ésteres de colesterol (CE) se eluyen primero como una fracción combinada, otras clases, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), y ácidos grasos no esterificados (NEFA) se eluyen mediante el aumento de la polaridad del disolvente de elución . La separación de los TAG de CE explota la unión de TAG sólo a un cartuc SPE frescadge, lo que permite a la CE ser eluido. TAG puede entonces ser eluido mediante el aumento de la polaridad del disolvente de elución 9,10. Este método permite múltiples muestras para ser separadas simultáneamente con un mayor rendimiento que se consigue con cromatografía en capa fina, lo que significa que muestras relativamente pequeñas de tamaño (por ejemplo, &lt;100 l de plasma o suero, &lt;100 mg de tejido) pueden ser analizados 11,12. GC es una técnica bien establecida descrita por primera vez en la década de 1950; se sugirió que la fase móvil en los sistemas a continuación, líquido-líquido podría ser sustituido con de vapor. Fue utilizado inicialmente para el análisis de petróleo, pero rápidamente se expandió a otras áreas como el análisis de aminoácidos y la bioquímica de los lípidos, que sigue siendo de gran interés. Los avances en equipos de GC y la tecnología, como el desarrollo de las columnas capilares de las columnas de relleno utilizados anteriormente han llevado a nuestras técnicas actuales en los que los ácidos grasos son capaces de serseparados de manera más eficiente a temperaturas más bajas que resultan en GC se utiliza rutinariamente para identificar y cuantificar los ácidos grasos en una amplia gama de investigaciones 13. GC requiere ácidos grasos para ser derivatizados con el fin de que puedan llegar a ser suficientemente volátil para ser eluida a temperaturas razonables sin descomposición térmica. Esto normalmente implica la sustitución de un grupo funcional que contiene hidrógeno para formar ésteres, tioésteres o amidas para el análisis. Los ésteres metílicos se estudian comúnmente derivados, que son producidos por metilación. En este método los enlaces éster en los lípidos complejos se hidrolizan para liberar ácidos grasos libres, que se transmethylated para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). El perfil resultante de FAME, determinado por GC, se conoce como la composición de ácidos grasos y puede ser fácilmente comparado entre los diferentes grupos experimentales 9,10. La técnica permite tanto a las proporciones de indiviácidos grasos UAL y sus concentraciones a medir. Además de la utilización de GC para el análisis de ácidos grasos en los estudios de nutrición y en la industria alimentaria, la técnica se puede utilizar en una amplia gama de campos analíticos. Por ejemplo, los análisis ambientales utilizando GC incluyen la medición de la contaminación del agua por los insecticidas y los análisis de suelos medir el contenido de clorobenceno. En toxicología, GC también se ha utilizado para identificar las sustancias ilegales en la orina y muestras de sangre de los individuos; unos potenciadores tales rendimiento deportivo 12 y la capacidad de separar mezclas complejas de hidrocarburos hace que esta técnica popular en la industria petrolera para el análisis petroquímica 12. El embarazo se asocia con cambios significativos en la composición de ácidos grasos de los tejidos maternos, específicamente en el contenido de ácidos grasos omega-3 (n-3) y omega-6 (n-6) aci grasos poliinsaturadosds (PUFA) 3. En el estudio actual, ejemplificamos el uso de GC en la medición de los ácidos grasos mediante la descripción de su uso en el análisis de la composición de ácidos grasos del tejido del hígado tomado de ratas vírgenes y gestantes alimentadas con dietas altas y bajas en grasa con diferentes fuentes de petróleo. Las dietas experimentales que aquí eran una base de aceite de soja dieta baja en grasas, una dieta alta en grasas a base de aceite de soja (130,9 g de grasa total / kg de grasa total) o (130,9 g de grasa total / kg con una dieta alta en grasas a base de aceite de linaza dieta), proporcionado por 20 días. La composición de ácido graso total de nutrientes y de estas dietas se han descrito previamente 14. Las dietas de aceite de soja son ricos en ácido linoleico (18:2 n-6) y contienen algo de ácido α-linolénico (18:3 n-3), mientras que la dieta de aceite de linaza es rica en ácido α-linolénico. Estas dietas altas en grasas representan diferentes raciones de ácidos linoleicos a α-linolénico (raciones de 08:01 y 01:01, respectivamente). El método para el aislamiento de clases de lípidos individuales y el análisis por GC es quell establecido y validado, y que ha sido previamente publicado 10 pero sin la descripción técnica detallada contenida aquí.

<table><tbody><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17'PRECAUCIÓN</td><td>' Humos - Cloroformo de grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4966/17'PRECAUCIÓN</td><td>' Humos - Grado de HPLC</td></tr><tr><td>BHT</td><td>Sigma- Aldrich</td><td></td> <td>W218405'PRECAUCIÓN' Humos de polvo -</td></tr><tr><td>Anhidro NaCl</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td> <td>anhidroFisher Scientific</td><td>H/0406/17'PRECAUCIÓN</td><td>' Humos - Grado HPLC</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma- Aldrich</td><td></td> <td>695084'PRECAUCIÓN' Quemaduras - 99.85%</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td></td> <td>339741'PRECAUCIÓN' Quemaduras - 99.999%</td></tr><tr><td>Carbonato de potasio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>209619</td><td>99% ACS Grado reactivo</td></tr><tr><td>Bicarbonato de potasio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>237205</td><td>99.7% ACS</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td> de grado reasgent <td>Fisher Scientific</td> <td>10204340'PRECAUCIÓN' Humos - 99+% GLC Tolueno especiado</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>T/2300/15'PRECAUCIÓN</td><td>' Humos</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma- Aldrich</td> <td>309966'PRECAUCIÓN' Humos</td><td></td></tr> <tr><td>Cilindro de nitrógeno (libre de oxígeno)</td><td>BOC</td><td>44-w</td><td>'ATENCIÓN' Gas comprimido - Riesgo de explosión</td></tr><tr><td>Cartuchos SPE de sílice aminopropílica</td><td>Cartucho Agilent</td><td></td><td>12102014 - Masa del cordón 100 mg</td></tr><tr><td>Gel de sílice Cartucho SPE</td> Cartucho <td>Agilent</td><td>14102010</td><td>- Masa del cordón 100 mg</td></tr><tr><td>Seives moleculares</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>334324</td><td>Pellets, AW-300, 1,6 mm</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50251</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

La cromatografía de gases (GC) es un método altamente sensible para identificar y cuantificar el contenido de ácidos grasos de los lípidos de los tejidos, las células y el plasma / suero, obteniéndose resultados con alta precisión y alta reproducibilidad. En estudios metabólicos y de la nutrición GC permite la evaluación de cambios en las concentraciones de ácidos grasos siguientes intervenciones o durante cambios en el estado fisiológico tal como el embarazo. Extracción en fase sólida (SPE) usando cartuchos de sílice aminopropilo permite la separación de las principales clases de lípidos incluyendo triglicéridos, fosfolípidos diferentes, y ésteres de colesterol (CE). GC combinado con SPE se utilizó para analizar los cambios en la composición de ácidos grasos de la fracción de CE en los hígados de ratas vírgenes y embarazadas que habían sido alimentados con diferentes dietas altas y bajas en grasa. Hay importantes efectos de la interacción dieta / el embarazo sobre el contenido de ácidos grasos omega-3 y omega-6 ácidos grasos de la CE de hígado, lo que indica que las mujeres embarazadas tienen una respuesta diferente a la dieta manipulatión que se observa entre las hembras vírgenes.

El éxito de este método depende de la siguiente protocolo con precisión y en el uso de disolventes y reactivos limpio con el fin de reducir el &quot;ruido&quot; y la contaminación que puede aparecer en un cromatograma. Las muestras contaminadas son más difíciles de analizar, la reducción de la exactitud de la zona bajo los cálculos de la curva. Si el protocolo es seguido con éxito un cromatograma con picos simétricos claros y bien definidos y con un mínimo de ruido de fondo debe ser obtenido como se ilustra en l...

El embarazo provoca cambios significativos en la composición de ácidos grasos de los tejidos maternos. Los perfiles lipídicos se pueden obtener por medio de la cromatografía de gases para permitir la identificación y cuantificación de los ácidos grasos en las clases de lípidos individuales entre las ratas alimentadas con diferentes dietas de alta y baja en grasa durante el embarazo.

El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la composición de ácidos grasos del hígado. Esto se logra primero pesando una muestra de hígado y homogenizándola. El segundo paso consiste en extraer todos los lípidos de la muestra de hígado homogenizada.A continuación, se separan las clases individuales de lípidos, como los ésteres del colesterol, mediante extracción en fase sólida. El paso final consiste en la identificación y derivatización de las clases de lípidos en ésteres metílicos de ácidos grasos. En última instancia, se utiliza la cromatografía de gases para mostrar cómo la composición de ácidos grasos en los tejidos puede cambiar tras una intervención nutricional o verse influenciada por cambios en el estado fisiológico, como el embarazo.Aunque este método puede proporcionar información sobre la composición de ácidos grasos en tejidos, también puede aplicarse a otros tipos de muestras, como aceites, semillas y alimentos. En general, los usuarios nuevos en esta técnica podrían tener dificultades, ya que algunas partes del protocolo requieren destreza manual y práctica, como la recogida repetitiva de las fases superior e inferior. La técnica será demostrada por Hena, Fisk y Annette West, una técnica y una estudiante de doctorado de nuestro laboratorio.Corte primero aproximadamente 100 miligramos de hígado congelado y pese el tejido. Coloque el tejido en un tubo de plástico dentro de un recipiente con hielo y agregue 0,5 mililitros de cloruro de sodio al 0,9% frío con hielo. A continuación, homogenice el tejido y transfiéralo a un tubo de vidrio con tapón roscado.Utilice otros 0,3 mililitros de cloruro de sodio al 0,9 % para transferir cualquier tejido restante al tubo de vidrio con tapón roscado. A continuación, agregue 100 microgramos de estándar de colesterol heta dechen disuelto en cloroformo seco y metanol en una proporción de dos a uno al tubo, seguido de cinco mililitros adicionales de la misma solución de disolvente que contiene 50 miligramos por litro de butilhidroxitolueno. Después de agregar un mililitro de cloruro de sodio uno molar, tape el tubo y mezcle la muestra completamente mediante vortex hasta que presente un aspecto uniforme.Luego, centrifugue la muestra a 1000 veces G durante 10 minutos con frenado bajo a temperatura ambiente. Una vez finalizado, recoja la fase inferior utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y transfiérala a un nuevo tubo de vidrio con tapón roscado. A continuación, seque la muestra bajo nitrógeno a 40 grados Celsius.En este momento, conecte el depósito de CE al vacío a una bomba de vacío y coloque una columna de CE de sílice amino propilo en el depósito. Coloque un tubo de vidrio con tapa roscada nuevo, etiquetado como TAG y CCE, en el soporte del depósito debajo de la columna para recoger la primera fracción. Disuelva el extracto lipídico total en un mililitro de cloroformo seco y mezcle la muestra mediante vortex.A continuación, transfiera la muestra a la columna utilizando una pipeta de vidrio con embudo y deje que el líquido gotee en el tubo con tapón roscado por gravedad. Cuando el líquido ya no gotee desde la columna, retire el líquido restante mediante vacío. A continuación, eluya la fracción de TAG y CE lavando la columna dos veces con un mililitro de cloroformo seco bajo vacío.Cuando todo el líquido haya salido de la columna, seque la fracción de TAG y CE bajo nitrógeno a 40 grados Celsius. Coloque un nuevo cartucho de SPE de sílice amino propilo en el depósito de SPE y coloque un tubo de vidrio con tapón de rosca en la bandeja del depósito debajo del cartucho para recoger el desperdicio. Lave la columna con un mililitro de hexano seco tres veces bajo vacío.Después de apagar el vacío, lave la columna con un mililitro final de hexano H por gravedad. Después de reemplazar el tubo de desecho con un nuevo tubo de vidrio con tapón roscado etiquetado como ce, disuelva la fracción de TAG y CE seca en un mililitro de hexano seco y mezcle la muestra mediante vortex. A continuación, transfiera la muestra a la columna utilizando un vaso de vidrio o pipeta, y deje que el líquido gotee a través de la columna por gravedad.Cuando el líquido ya no gotee desde la columna, retire el líquido restante bajo vacío. Lave la columna dos veces con un mililitro de hexano seco para eluir el CE y seque la fracción recolectada bajo nitrógeno a 40 grados Celsius. A continuación, agregue 0,5 mililitros de tolueno seco a la fracción de CE separada y mezcle la muestra mediante vortex.Añada un mililitro de un reactivo de metilación previamente preparado a la muestra disuelta en tolueno seco. Luego, tape el tubo firmemente y mezcle. Caliente suavemente la muestra durante dos horas a 50 grados Celsius. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, añada un mililitro de solución neutralizante.A continuación, agregue un volumen de hexano seco a la muestra. Después de mezclar en vórtex, centrifugue las muestras a 250 ×g durante dos minutos con frenado bajo a temperatura ambiente. Una vez finalizado, recoja la fase superior de hexano y transfiérala a un nuevo tubo de vidrio desechable sin tapón roscado. Seque la muestra de hexano recolectada bajo nitrógeno a 40 grados Celsius.Después de colocar un tubo de desecho en el depósito de extracción en fase sólida (SPE) y un cartucho de gel de sílice en el depósito, lave la columna tres veces con un mililitro de hexano seco bajo vacío y un mililitro de hexano seco por gravedad. Tras eliminar los lavados de desecho, coloque un tubo de desecho nuevo en el depósito y luego disuelva la muestra de ésteres metílicos de ácidos grasos (CE fame) en un mililitro de hexano seco.Después de mezclar la muestra mediante vortex, transfiérala a la columna utilizando un vaso de vidrio o una pipeta. Una vez que el líquido haya goteado a través de la columna por gravedad, lave la columna tres veces con un mililitro de hexano bajo vacío. A continuación, elimine los lavados de desecho y coloque un nuevo tubo con tapón roscado etiquetado como CE fame en el tanque.Eluir la fracción de CE fame con dos mililitros de hexano seco al 95 a 5 de éter dietílico. Luego, secar la fracción recolectada bajo nitrógeno a 40 grados Celsius, disolver la fracción seca en 75 microlitros de hexano seco y mezclar la muestra mediante vortex después de que la muestra haya sido mezclada mediante vortex. Transferirla a un vial de muestra automática para GC tras repetir el paso anterior.Analice la muestra en un cromatógrafo de gases si se sigue correctamente el protocolo. Debe obtenerse un cromatograma con picos claramente simétricos y bien definidos, y con ruido de fondo mínimo, como se ilustra aquí. Si ha ocurrido contaminación, el cromatograma mostrará picos adicionales y presentará picos no simétricos o asimétricos como se muestra aquí.La contaminación por colesterol libre ocurrirá al analizar FAME derivados de CE a menos que se elimine el colesterol. El uso de una mezcla de calibración preparada permite la identificación de los FAME en la muestra. La mezcla de calibración se analiza utilizando los mismos ajustes del instrumento que las muestras, de modo que el cromatograma pueda compararse con el de la muestra y las señales identificarse según sus tiempos de retención, como se ilustra aquí.El pico cero 16 se resalta aquí para ilustrar la comparación de los tiempos de retención de la mezcla de calibración en el cromatograma superior con los de los ácidos grasos. En el trazo de la muestra inferior, se utiliza el área del pico de ácidos grasos para calcular el porcentaje de ácidos grasos específicos dentro del total, permitiendo así su correcta etiquetación. Una vez que se han recopilado los datos, es útil examinarlos en busca de valores atípicos, como se muestra aquí.Las muestras atípicas pueden investigarse más a fondo y la extracción y/o el análisis pueden repetirse si es necesario. Como se muestra aquí, el contenido de ácidos grasos en los ésteres de colesterol (CE) del hígado de rata se describe como un porcentaje del total de ácidos grasos presentes en los CE hepáticos. Estos datos describen los ácidos grasos de los ésteres de colesterol en el hígado de ratas vírgenes o preñadas alimentadas durante 20 días con una de tres dietas diferentes.El análisis estadístico mediante Innova de dos factores revela efectos significativos de la dieta y el embarazo sobre la proporción de varios ácidos grasos, así como interacciones significativas entre dieta y embarazo. Como ejemplo, el contenido de ácido onico en los esteres de colesterol hepáticos de ratas preñadas se ve más influenciado por la dieta que en hembras vírgenes. Esta técnica permite procesar 20 muestras por día desde el inicio hasta el final si se realiza correctamente.Una vez dominada, la agrupación de muestras puede aumentar el rendimiento y duplicar la cantidad procesada en una semana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la composición de ácidos grasos de clases individuales de lípidos utilizando extracción en fase sólida y cromatografía de gases. No olvide que trabajar con disolventes puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en campanas extractoras y usar equipo de protección personal (EPP) adecuado, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Química

Se presentan sólidos métodos bioquímicos y microscópicos para el estudio...

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Aprenda a analizar la composición de ácidos grasos en hígado de rata durante el embarazo mediante cromatografía de gases. Este método permite estudiar los cambios metabólicos maternos y evaluar el impacto de la dieta.

El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo (Video) | JoVE Journal

El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo

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