Name: Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprende a examinar interacciones entre células tumorales circulantes de próstata y células endoteliales humanas usando un sistema de flujo dinámico con microcámaras. Este método permite visualizar en tiempo real los mecanismos de adhesión celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento de Defensa de la próstata Programa de Investigación del Cáncer (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 del Instituto Nacional del Cáncer y el Fondo de Investigación Robert McCooey Oncología Genitourinaria. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patología) para proporcionar anticuerpos VE-cadherina, y el Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirugía) para proporcionar HUVECs.

1. El cultivo de HUVEC microportaobjetos para Interacciones de Observación del CTC-endoteliales <ol><li> Bajo la campana de cultivo de tejidos, primero enjuague el microportaobjetos, ancho de canal de 1 mm con PBS. Suavemente la capa MicroSlide con 200 l de 50 mg / ml de fibronectina (disuelto en PBS) usando una jeringa de cierre Luer de 1 ml. </li><li> Cubrir el MicroSlide con la tapa y mantenerlo dentro de la campana de cultivo de tejido durante 30 min. De dispensación lenta del líquido en el MicroSlide impide la formación de burbujas en el canal. </li><li> Perfundir 200 l de agua tibia (37 ° C) de HUVEC medio de crecimiento (medio M199, HEPES 1 M, 20% de FBS, 5 mg / ml de heparina, factor de crecimiento celular endotelial 100 g / ml, y L-glutamina) sobre el MicroSlide e incubar 20 min a temperatura ambiente. Durante la perfusión, preparar la suspensión de células HUVEC. </li><li> Enjuague HUVECs con PBS y añadir 0,05% de tripsina-EDTA durante 1-2 min a TA. Centrífuga HUVECs en 2 ml de medio de crecimiento a 180 xg durante 5 min. </li><li> Medir la concentración de células usando un Neubahemocitómetro uer y preparar 10 7 HUVEC células/100 l medio de cultivo. A continuación, retire con cuidado el medio de la entrada de la microportaobjetos usando una punta de pipeta de 200 l. </li><li> Llevar el MicroSlide a nivel de los ojos y el uso de una jeringa de 1 ml Luer-Lock, perfundir suavemente 200 l de concentración de preparado de HUVECs en el canal. Se debe tener precaución en este paso para evitar la formación de burbujas. Si aparecen burbujas, mantenga la perfusión durante un tiempo un poco más largo hasta que las burbujas entren en el canal de salida. </li><li> Ponga un volumen igual (~ 80 l) de los medios de comunicación HUVEC tanto en la entrada y salida de la MicroSlide. Esto evita que el flujo de células en cualquier dirección. </li><li> Cubrir el portaobjetos y mantenerlo en la incubadora (37 ° C) durante 1,5 horas. </li></ol> 2. Preparación de Flujo Asamblea Cámara para pasar la noche HUVEC Cultura en un MicroSlide <ol><li> Coloque una jeringa estéril de 20 ml, conectores Luer hembra y macho, los tubos y una bomba de jeringa en la incubadora durante 15 millasn. </li><li> Para un volumen muerto mínimo, utilizar el tubo con diámetro interior de 0,04 pulgadas. Menor diámetro tubo impide la formación de burbujas. </li><li> Llene la jeringa de 20 ml con agua caliente (37 ° C) HUVEC medios de comunicación (12 ml). Una el tubo con los conectores en la jeringa. Quite las burbujas. Conecte este conjunto a la microportaobjetos. </li><li> Llenar completamente la entrada de la MicroSlide con medios HUVEC. Traiga la jeringa de 20 ml conectada al conector junto al microportaobjetos. Conecte con cuidado el conector a la microportaobjetos. </li><li> Traiga la puesta a punto en la incubadora y conectarlo a la bomba de jeringa, puesta a régimen de cizalladura 10 l / min. Deje las células O / N en la incubadora a 37 ° C. </li><li> Al día siguiente, desmontar la puesta a punto mediante la eliminación de el conector unido a la entrada de la MicroSlide. </li><li> Para regular positivamente la expresión de E-selectina sobre las CE, preparar el medio de cultivo fresco que contenía IL-1β a 10 ng / ml en 4 ml de medio. Aspirar los medios de comunicación en una jeringa de 10 ml. Retire tque los medios de comunicación a partir de la entrada de la microportaobjetos y conectar la jeringa a la diapositiva. </li><li> Ajuste la bomba de jeringa a 10 la velocidad de cizalla l / min durante 4 horas en la incubadora. </li></ol> 3. Elaboración de Anti-PSMA (J591-488) con etiqueta células del cáncer de próstata <ol><li> Durante la incubación IL-1β de HUVECs, preparar anti-PSMA J591-Alexa488 etiquetados células de CaP. Añadir 0,05% de tripsina-EDTA para células MDA durante 1 min. No exponer las células a tripsina durante tiempos más largos, ya que puede afectar a los glicopéptidos presentes en la superficie celular. Reactivo de disociación celular libre de enzimas también se puede utilizar en lugar de la tripsina. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender sedimento celular MDA in 1 ml de H / H tampón (sal de Hanks equilibrada solution/0.1% HSA/10 HEPES / CaCl2 1 mM). Añadir anticuerpo-J591 Alexa488 anti-PSMA a 20 mg / mL durante 30 min a TA en un lugar oscuro. Resuspender las células durante la incubación. </li><li> Después de 30 min, se centrifuga la solución de células a 800 xg durante 5 min. Aspitasa y resuspender el precipitado en 1 ml de tampón H / H. Contar las células MDA etiquetados y llevar la concentración final de 1x10 6 células / ml. Llene una jeringa de 5 ml con J591-488 células MDA etiquetados y eliminar las burbujas. </li></ol> 4. Preparación de anti-PSMA (J591-488) Etiquetada CTCs Enriquecido de CaP pacientes <ol><li> Recoger 7,5 ml de sangre de pacientes con cáncer de próstata en un tubo de tapa azul (que contiene citrato de sodio). Suavemente diluir 1:01 sangre en 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS. </li><li> Añadir 5,3 ml de Ficoll-Paque Plus en un tubo cónico de 50 ml. Capa diluyó la sangre en la parte superior de la Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 xg durante 30 min. </li><li> Pre-coat todos los tubos o consejos de entrar en contacto con las CTC con un 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (tampón R / S) para evitar la unión no específica de los CTC a las superficies. Mantener 4 ° C de temperatura de los medios y tampones que entran en contacto con los CTC. </li><li> Recoger el de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fraccióncontiene CTCs de la interfaz en otro tubo cónico de 50 ml que contiene 30 ml de tampón de R / S. Se centrifuga a 400 g durante 8 min. </li><li> Resuspender el precipitado y lavar de nuevo en tampón de R / S a 400 xg durante 8 min. Después de la centrifugación, se resuspende el sedimento en tampón H / h. Añadir anti-PSMA J591-488 anticuerpo a 20 mg / ml durante 30 min a TA en un lugar oscuro. </li><li> Después de 30 minutos, centrifugar los PBMCs que contengan J591-488 CTCs etiquetados a 800 xg durante 5 min. Volver a suspender en tampón H / H. Llene una jeringa de 1 ml (pre-recubiertos con tampón de R / S) con la muestra. </li></ol> 5. Preparación del microscopio, la bomba de jeringa y flujo Asamblea Cámara <ol><li> Encienda el microscopio invertido y ajuste la iluminación Kohler a 10X objetivo. Traiga la bomba de jeringa al mismo nivel que la etapa de la muestra del microscopio y lo fijó en 1 dyn / cm 2 esfuerzo de corte (~ 10 l / min). </li><li> Abra el software Zeiss Axiovision. Seleccione el objeto en la pantalla de ordenador. Crear un nuevocarpeta en la opción de herramientas en el software. </li><li> Abra la opción experimentos inteligentes en Axiovision y ajuste la configuración para grabar vídeos de corta duración 30 seg durante 30 min. </li><li> Para el vídeo fluorescente en vivo, establezca las opciones-12 de imagen ms de exposición, 2 x 2 bandejas, 5 Gain. Estos parámetros ayudan en la consecución de los vídeos cercanas a la velocidad de fotogramas de vídeo (~ 23 cuadros por segundo) con la cámara Zeiss MRM. </li><li> Para visualizar ancho del canal de flujo a 10 X objetivo en la pantalla del ordenador, utilice un adaptador de montura C (0,63 mm xf/60 Interface). </li><li> Encienda la lámpara de mercurio. </li><li> Coloque la jeringa y el conector que contiene las células en la bomba de jeringa. </li><li> Llevar la IL-1β estimulada HUVEC de la incubadora. Enchufe el conector en el canal de entrada de lleno de la microportaobjetos contiene HUVECs. </li><li> Conectar el canal de salida con el conector unido a la tubería. Ponga el tubo en un plato o 15 ml tubo cónico para recoger el flujo a través. </li><li> Inicie la infusia través de la MicroSlide a 10 l / min. Tenga en cuenta las interacciones entre las células endoteliales y las células MDA marcados o etiquetados CTC derivados de pacientes menores de filtro de 488 nm en el microscopio de epifluorescencia. </li><li> Comienza la grabación del experimento como 30 seg videos cortos. Durante el análisis de la reproducción, medir la velocidad de rotación. La velocidad de rotación se mide dividiendo la distancia recorrida por las células con el tiempo. </li></ol> 6. La inmunotinción de la MicroSlide <ol><li> Retire el papel de la entrada y salida del microportaobjetos después de la perfusión de las células MDA en IL-1β estimulada HUVECs durante 10 min. </li><li> Con una punta de 200 l, poner caliente (37 ° C) de PBS que contiene calcio y magnesio en la entrada de la microportaobjetos durante 5 min. Incline la microportaobjetos usando su tapa como un apoyo en el banquillo. Mantenga el MicroSlide en una posición inclinada para todas las incubaciones durante inmunotinción. </li><li> Fijar HUVECs perfundiendo cálida formaldehído al 2% en la entrada </li><li&gt; incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Añadir Triton X-100 (0,1%) en 5% de BSA en PBS durante 10 min a TA. </li><li> Enjuague dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Se bloquea con 5% de BSA en PBS durante 30 min. </li><li> Se incuba con anticuerpo de cabra anti-primaria VE-cadherina (1:100) en 2,5% BSA O / N a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Añadir burro secundario de cabra anti-647 de anticuerpos durante 45 minutos. Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Incubar a temperatura ambiente con anticuerpo humanizado conjugado-J591 Alexa488 durante 1 hora. </li><li> Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Añadir DAPI durante 5 min. Lavar con agua destilada durante 5 min. </li><li> Añadir PBS (o Mowiol para el almacenamiento a largo plazo). Visualice el microportaobjetos bajo el microscopio confocal. </li></ol>

<ol><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li>
<li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+in+transit%3A+the+vascular+interactions+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li>
<li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li>
<li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--%2Frag2--+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li>
<li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li>
<li>Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRemuzzi%2C+A+%22Adhesion+Protein+Protocols%22">Adhesion Protein Protocols</a>. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).</li>
<li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li>
<li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li>
<li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li>
</ol>

Dr. Bander es el inventor de las patentes que se asignan a la Fundación de Investigación de Cornell (&quot;IRC&quot;) para el anticuerpo J591 utilizada en este artículo. Dr. Bander es consultor y posee acciones en BZL Biologics, la empresa a la que las patentes han sido autorizados por el CRF de una mayor investigación y desarrollo.

Debido al bajo número de CTC entre las células de la sangre, es difícil aislar los CTC como una población pura de células. Con el fin de estudiar las interacciones CTC / CE, la población rara e impuro de los CTC plantea dos grandes retos: a) Identificación de los CTC entre las células de la sangre; b) Observación de las interacciones CTC / CE. Para superar la primera limitación de la identificación de los CTC de próstata entre los glóbulos, tomamos ventaja del hec...

La metástasis es un proceso de múltiples pasos compleja que sigue siendo poco conocida. El eje ligando E-selectin/selectin se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la promoción de interacciones adhesivas primarias entre el endotelio vascular y células de cáncer de 1,2. Endotelial (E)-selectina es una proteína transmembrana expresada por las células endoteliales activadas, mientras diferente ligando (s) de E-selectina se expresan por las células tumorales 3. Numerosos enfoques in vitro se han empleado con éxito para modelar las interacciones de ligando E-selectin/selectin entre las células tumorales y las células endoteliales (EC) 1. Para el estudio de estas interacciones, se están empleando diferentes sistemas de cámara de flujo para simular el sistema vascular arterial. Entre conjuntos de cámara de flujo, la cámara de flujo de placas paralelas (PPFC) en conjunción con las EC se utiliza rutinariamente como un modelo in vitro simulando in vivo en condiciones de estrés de cizallamiento. En estemétodo, ECs se cultivan en un plato de 35 mm y después de la consecución de una monocapa, las EC se adjuntan a la PPFC y experimentos basados ​​en la tensión de cizallamiento se realizan. Sin embargo, PPFC y otros sistemas actuales presentan muchas limitaciones para el estudio de las interacciones adhesivas entre las células tumorales (CTC) derivadas de pacientes y EC, que circula principalmente, porque CTC son una población rara de células, arrojar desde el tumor primario, que circula entre los millones de células de la sangre (1 CTC por 10 9 células de la sangre) 4. Por lo tanto, a diferencia de suministro ilimitado de líneas de células cultivadas, bajo recuento de CTC conducen a muy pocas y raras interacciones CTC / CE, requiriendo adecuado ancho de canal de flujo para registrar las interacciones de análisis de la reproducción. Además, dado que los pacientes CTC derivados son una población impura, por lo tanto, se requiere un marcador de identificación para rastrear las CTC en específico. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un nuevo método para identificar el cáncer de próstata (CaP) CTCs tomando ventaja del hecho de que prácticamente todos estos CTC expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en su superficie celular 5,6. En este informe, se utilizó la línea celular de cáncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demostrar la utilidad potencial de nuestro nuevo sistema para el estudio de la próstata interacciones CTC con EC, con el tiempo para comprender el mecanismo de la metástasis. Nuestra metodología se puede aplicar para varios experimentos de cizalla basada en la simulación de sistema vascular in vivo en 7-9. Además de examinar las interacciones CaP CTC / CE, el sistema de cámara de flujo de corriente podría adaptarse fácilmente para el análisis de células mononucleares de sangre periférica o de las interacciones de células tumorales con EC. La facilidad de montaje y desmontaje de la cámara de flujo, un microportaobjetos III (0,1) (en lo sucesivo denominada como microportaobjetos), permite el cultivo de EC bajo perfusión y la estimulación de los EC con diferentes citocinas para inducir prOtein expresión. Además, cultivos de ECS, proteínas recombinantes, tales como E-y P-selectina se pueden cubrir en el microportaobjetos y las interacciones con las células tumorales pueden ser observados bajo condiciones de flujo laminar 10.

<table><tbody><tr><td>Microportaobjetos</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador Luer macho</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador Luer hembra</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Luer-lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medio</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Mitógeno endotelial</td><td>Tecnologías biomédicas</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Laboratorio de Oncología</td><td></td><td></td>Urológica</tr><tr><td>Interleucina-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Departamento de Cirugía</td><td></td><td>proporcionado por Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>objetivo Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación de células libres de enzimas</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

método in vitro para observar interacciones mediadas por e-selectina entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

La metástasis es un proceso en el que las células tumorales se desprenden de tumor intravasate vascular de la sangre primaria y el sistema linfático, de ese modo, obtener el acceso a la extravasación y formar un nicho secundaria. La extravasación de las células tumorales desde el sistema vascular de la sangre puede ser estudiada usando células endoteliales (ECs) y las células tumorales obtenidas a partir de diferentes líneas celulares. Se llevaron a cabo estudios iniciales usando condiciones estáticas, pero se ha documentado bien que los EC se comportan de manera diferente bajo condiciones de flujo fisiológico. Por lo tanto, los diferentes conjuntos de cámara de flujo actualmente se utilizan para el estudio de las interacciones celulares de cáncer con EC. Ensambles de cámara de flujo actuales ofrecen resultados reproducibles, ya sea utilizando diferentes líneas celulares o de líquido a diferentes condiciones de estrés de cizalla. Sin embargo, para observar y estudiar las interacciones con las células raras, como las células del tumor (CTCs) en circulación, se requieren ciertos cambios que deben introducirse en el conjunto de la cámara de flujo convencional. CTCsson una población de células raras entre millones de células sanguíneas. En consecuencia, es difícil obtener una población pura de CTC. La contaminación de las CTC con diferentes tipos de células que se encuentran normalmente en la circulación es inevitable el uso de presente de enriquecimiento o técnicas de agotamiento. En el presente informe se describe un método único para la etiqueta circular las células de cáncer de próstata con fluorescencia y estudiar sus interacciones con EC en un sistema de cámara de flujo auto-ensamblado. Esta técnica se puede aplicar además a observar las interacciones entre CTC próstata y cualquier proteína de interés.

La figura 1 muestra un cultivo O / N de una monocapa de EC en la MicroSlide. Los batiduras en la Figura 1A muestra que el 100% de la MicroSlide es visible usando objetivo 5X mientras que el 70% es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos (figura 1B). Para E-selectina mediada por las interacciones, las células de rodadura en los bordes no se consideran que hace más de 70% de la MicroSlide disponible para la grabación en vídeo y análisis de la reproducción. En nuestr...

Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.

Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata y células endoteliales que expresan e selectina, utilizando un ensamblaje de flujo con microportaobjetos. Esto se logra primero recubriendo un microportaobjetos con fibronectina. El segundo paso consiste en cultivar células endoteliales de vena umbilical humana o VE en un sistema de flujo dinámico sobre un microportaobjetos con un canal de ancho reducido.A continuación, las células de cáncer de próstata se marcan con un anticuerpo monoclonal humanizado antígeno de membrana específico de próstata o PSMA, el cual se internaliza. El paso final consiste en perfundir las células de cáncer de próstata marcadas con anti-PSMA sobre las VE que expresan e-selectina. Finalmente, se utiliza microscopía de video para mostrar las interacciones entre las células de cáncer de próstata y las células endoteliales.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la cámara de flujo de placas paralelas y otros ensamblajes dinámicos, es que con ella se pueden examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata, tales como células tumorales circulant

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite...

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

La accesibilidad de modelos fiables para investigar las interacciones vasculares de la sangre en humanos es escasa. Presentamos un modelo in vitro de células endoteliales primarias humanas cultivadas combinadas con sangre entera humana para investigar las interacciones celulares tanto en la sangre (ELISA) como en el compartimento vascular (microscopía).

Una Novela In vitro Modelo para el estudio de las interacciones entre Whole Sangre humana y del endotelio

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Reportamos un método confiable para aislar y cultivar células endoteliales primarias específicas de tumores a partir de modelos de ratón modificados genéticamente.

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Este manuscrito detalla un método utilizado para generar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de próstata (PDX) a partir de células tumorales circulantes (CTC). La generación de modelos PDX a partir de CTCs proporciona un modelo experimental alternativo para estudiar el cáncer de próstata; Es el tumor más comúnmente diagnosticado y una causa frecuente de muerte por cáncer en los hombres.

Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Ratones modificados genéticamente son modelos útiles para la investigación de mecanismos del cáncer de próstata. Aquí presentamos un protocolo para identificar y disecar la próstata lóbulos de un mouse del Sistema urogenital, diferenciarlas basados en la histología y aislar y cultura primaria células prostáticas en vitro como esferoides para análisis posteriores.

Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

Aprende a examinar interacciones entre células tumorales circulantes de próstata y células endoteliales humanas usando un sistema de flujo dinámico con microcámaras. Este método permite visualizar en tiempo real los mecanismos de adhesión celular.

Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal

Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

Explorar más videos