Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

El objetivo general de este procedimiento es examinar las interacciones entre las células raras de cáncer de próstata y las células endoteliales que expresan eselectina utilizando un conjunto de flujo de microportaobjetos. Esto se logra recubriendo primero un micro portaobjetos con fibronectina. El segundo paso es cultivar células endoteliales de la vena umbilical humana o EV en un sistema de flujo dinámico en un microportaobjetos con un ancho de canal pequeño.

A continuación, las células de cáncer de próstata se marcan con un antígeno de membrana específico contra la próstata o un anticuerpo monoclonal humanizado PSMA, que se internaliza. El paso final es perfundir las células cancerosas de próstata marcadas con anti PSMA sobre la selectina e que expresa ve. En última instancia, la microscopía de video se utiliza para mostrar las interacciones entre las células cancerosas de próstata y las células endoteliales.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la cámara de flujo de placas paralelas y otros ensamblajes dinámicos, es que con esta técnica se pueden examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata, como las células tumorales circulantes y las células endoteliales cultivadas en un sistema de flujo dinámico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis, como ¿cómo hacen metástasis las células tumorales de próstata a través del sistema vascular sanguíneo? ¿Utilizan el mismo mecanismo que los leucocitos durante su ización?

Por lo general, las personas que son nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque implica el cultivo de una monocapa de células endoteliales en un canal estrecho bajo perfusión bajo la campana de cultivo de tejidos. Primero, enjuague el micro portaobjetos con solución salina tamponada con fosfato o PBS. A continuación, cubra suavemente el microportaobjetos con 200 microlitros de 50 microgramos por mililitro de fibronectina con una jeringa de bloqueo de señuelo de un mililitro.

Cubra el microportaobjetos con la tapa y manténgalo dentro de la campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos. A continuación, perfunde 200 microlitros de medio de crecimiento qve tibio sobre el microportaobjetos e incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. La dispensación lenta del líquido en el microportaobjetos evita la formación de burbujas en el canal.

Durante la perfusión, prepare la suspensión de vex enjuagando vex con PBS y agregando 0,1% de colagenasa más 0,05% de EDTA en PBS durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Centrifugar el producto en dos mililitros de medio de crecimiento a 180 veces G durante cinco minutos. A continuación, mida la concentración celular con un hemocímetro y prepare 10 millones de células por cada 100 microlitros de medio de crecimiento.

A continuación, retire con cuidado el medio de la entrada del microportaobjetos. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, lleve el microportaobjetos a la altura de los ojos y, con una jeringa de bloqueo de señuelo de un mililitro, perfu suavemente 200 microlitros de la concentración preparada de vex en el canal. Se requiere precaución en este paso para evitar la formación de burbujas si aparecen las burbujas, siga perfundiendo durante un tiempo un poco más largo hasta que las burbujas ingresen al canal de salida.

A continuación, pipetee un volumen igual de aproximadamente 80 microlitros de medio VE tanto en la entrada como en la salida del microportaobjetos. Esto evita el flujo de células en cualquier dirección. Cubra el portaobjetos y manténgalo en una incubadora a 37 grados centígrados durante 1,5 horas.

Para comenzar el ensamblaje de la cámara de flujo, coloque una jeringa estéril de 20 mililitros, conectores de señuelo hembra y macho, una bomba de jeringa y un tubo en la incubadora durante 15 minutos para obtener un volumen muerto mínimo. Tubería usada con un diámetro interior de 0.04 pulgadas. El diámetro de tubo más pequeño evita la formación de burbujas.

A continuación, llene la jeringa de 20 mililitros con 12 mililitros de medio VE tibio. Retire la burbuja de la jeringa por completo. Llene la entrada del micro portaobjetos con medio VE.

Conecte este conjunto a la microcorredera. Conecte suavemente el conector de salida al micro portaobjetos. Lleve la instalación a la incubadora y conéctela a la bomba de jeringa.

A continuación, ajuste la bomba a una velocidad de cizallamiento de 10 microlitros por minuto antes de dejar las células durante la noche en la incubadora a 37 grados centígrados. Al día siguiente, desmonte la configuración quitando el conector conectado a la entrada del micro portaobjetos. A continuación, retire el conector de salida dos para regular al alza la expresión de selectina en las células endoteliales.

Prepare un medio de crecimiento fresco que contenga interleucina una beta. Aspire el medio en una jeringa de 10 mililitros. Retire el medio sobrante de la entrada del portaobjetos, luego agregue el medio fresco llenando completamente la entrada.

Conecte la jeringa al portaobjetos. Configure la bomba de jeringa a una velocidad de cizallamiento de 10 microlitros por minuto durante cuatro horas en la incubadora durante la incubación beta de interleucina uno de vex, prepare células de cáncer de próstata marcadas con anticuerpos anti PSMA Alexa 4 88. Primero, agregue 0.05% de tripsina EDTA a las células de cáncer de próstata MDA durante un minuto.

No exponga las células a la tripsina durante más tiempo, ya que puede afectar a los glicopéptidos presentes en la superficie celular. Centrifugar las células a 200 veces G durante cinco minutos. A continuación, resuspenda el paladar de las células MDA en un mililitro de Hank's Buffer y agregue el anticuerpo anti PSMA incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en un lugar oscuro, resus suspendiendo las células durante la incubación.

Después de 30 minutos, centrifugue la solución celular a 800 veces G durante cinco minutos. Aspire y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de Hank. Cuente las células de MDA marcadas y lleve la concentración final a 1 millón de células por mililitro.

Llene una jeringa de cinco mililitros con las pilas de MDA marcadas y retire las burbujas. Encienda el microscopio invertido y ajuste la iluminación del rizador a 10 x objetivo. Coloque la bomba de jeringa al mismo nivel que la etapa de muestra del microscopio y ajústela a una tensión de cizallamiento cuadrado de diez centavos por centímetro.

A continuación, abra el software de visión Zeiss Axio. Seleccione el objetivo en la pantalla de la computadora. Cree una nueva carpeta en la opción herramientas del software.

Abra la opción de experimentos inteligentes en Axio vision y ajuste la configuración para grabar videos cortos de 32 durante 30 minutos Para video fluorescente en vivo, configure las opciones de imagen. Estos parámetros ayudan a lograr videos cercanos a la velocidad de fotogramas de video con la cámara Zeiss MRM para visualizar el ancho completo del canal de flujo a 10 x objetivo en la pantalla de la computadora, use un interruptor adaptador de montaje CM en la lámpara de mercurio antes de colocar la jeringa y el conector que contiene las celdas en la bomba de jeringa. A continuación, conecte el conector al canal de entrada lleno del microportaobjetos que contiene interleucina un hacha estimulada beta.

Conecte el canal de salida con el conector conectado al tubo. Coloque el tubo en un plato o en un tubo cónico de 15 mililitros para recoger el flujo. Iniciar la infusión a través del micro portaobjetos a 10 microlitros por minuto.

Observe las interacciones entre las células endoteliales y las células MDA marcadas o CTC marcadas derivadas de pacientes menores de 488 nanómetros. Filtro en el microscopio de epifluorescencia. Comience a grabar el experimento como videos cortos número 32.

Durante el análisis de reproducción, mida la velocidad de rodadura. La velocidad de rodadura se mide dividiendo la distancia recorrida por las celdas a lo largo del tiempo. Aquí se muestra un cultivo nocturno de una monocapa de células endoteliales.

En el micro portaobjetos. Las escalas muestran que el 100% de la microdiapositiva es visible con un objetivo de cinco veces, mientras que el 70% es visible con un objetivo de 10 veces para las interacciones mediadas seleccionadas, las células que ruedan en los bordes no se consideran, lo que hace que más del 70% de la microdiapositiva esté disponible para la grabación de video y el análisis de reproducción. El diagrama de caja muestra la distribución de las velocidades de rodadura de las células MDA marcadas y no marcadas con PSMA y anti PSMA en células endoteliales estimuladas con interleucina una beta en diferentes condiciones de esfuerzo cortante.

No se observaron diferencias significativas en las velocidades de laminación a uno y cinco centímetros cuadrados con una tensión máxima de 10 centavos por centímetro cuadrado. Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre las velocidades de rodadura de las células MDA no marcadas y anti PSMA, marcadas con MDA, Un video cosido en el tiempo tomado con la sangre de un paciente con cáncer de próstata muestra tres tipos de interacciones entre las CTC prostáticas marcadas y las células endoteliales que expresan lectina: anclaje donde las CTC se unen y vuelven a unir, adhesión estable donde las CTC no se desprenden incluso después de 30 segundos y no hay interacciones, ya que las CTC que no interactúan ingresan al campo de visión. Los micro portaobjetos se pueden teñir inmunológicamente fácilmente y obtener imágenes fluorescentes de la adhesión firme de las células MDA marcadas con anti PSMA.

Después de la profusión sobre la interleucina, se pueden ver aquí células endoteliales estimuladas por beta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar las interacciones entre las células raras, como las células tumorales de próstata circulantes, y las células endoteliales que expresan S selectina después de este procedimiento. También se pueden realizar otros métodos, como la inmunofluorescencia, para responder a preguntas adicionales, como la presencia de selectina. Ligandos.

Técnicas como estas pueden ayudar a los investigadores a comprender los diferentes pasos involucrados en la metástasis.