Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas
15 de mayo de 2014
Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.
El objetivo general de este procedimiento es examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata y células endoteliales que expresan e selectina, utilizando un ensamblaje de flujo con microportaobjetos. Esto se logra primero recubriendo un microportaobjetos con fibronectina. El segundo paso consiste en cultivar células endoteliales de vena umbilical humana o VE en un sistema de flujo dinámico sobre un microportaobjetos con un canal de ancho reducido.
A continuación, las células de cáncer de próstata se marcan con un anticuerpo monoclonal humanizado antígeno de membrana específico de próstata o PSMA, el cual se internaliza. El paso final consiste en perfundir las células de cáncer de próstata marcadas con anti-PSMA sobre las VE que expresan e-selectina. Finalmente, se utiliza microscopía de video para mostrar las interacciones entre las células de cáncer de próstata y las células endoteliales.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la cámara de flujo de placas paralelas y otros ensamblajes dinámicos, es que con ella se pueden examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata, tales como células tumorales circulantes y células endoteliales cultivadas, en un sistema de flujo dinámico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis, como ¿cómo metastatizan las células tumorales de próstata a través del sistema vascular sanguíneo? ¿Utilizan el mismo mecanismo que emplean los leucocitos durante su ización?
Generalmente, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque implica cultivar una monocapa de células endoteliales en un canal estrecho bajo perfusión dentro de la cabina de cultivo celular. Primero, enjuague la microplaca con solución salina tamponada con fosfato o PBS. Luego, recubra suavemente la microplaca con 200 microlitros de fibronectina al 50 microgramos por mililitro utilizando una jeringa de bloqueo de 1 mililitro.
Cubra la microplaca con la tapa y déjela dentro de la campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos. A continuación, perfunda 200 microlitros de medio de crecimiento tibio sobre la microplaca e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. La dispensación lenta del líquido en la microplaca evita la formación de burbujas en el canal.
Durante la perfusión, prepare la suspensión de vex lavando el vex con PBS y agregando colagenasa al 0,1 % más EDTA al 0,05 % en PBS durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Centrifugue el hve en dos mililitros de medio de crecimiento a 180 ×g durante cinco minutos. Luego, mida la concentración celular utilizando un hemocitómetro y prepare 10 millones de células por 100 microlitros de medio de crecimiento.
A continuación, retire cuidadosamente el medio de la entrada de la microplaca. Utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros, coloque la microplaca a la altura de los ojos y, con una jeringa de bloqueo de 1 mililitro, perfunda suavemente 200 microlitros de la concentración preparada de vex en el canal. Se requiere precaución en este paso para evitar la formación de burbujas; si aparecen burbujas, continúe perfundiendo durante un tiempo ligeramente más largo hasta que las burbujas entren en el canal de salida.
A continuación, pipete un volumen igual de aproximadamente 80 microlitros de medio VE en la entrada y la salida del portaobjetos microscópico. Esto evita el flujo de células en cualquier dirección. Cubra el portaobjetos y colóquelo en un incubador a 37 grados Celsius durante 1,5 horas.
Para comenzar el ensamblaje de la cámara de flujo, coloque una jeringa estéril de 20 mililitros, conectores hembra y macho del tipo lure, una bomba de jeringa y tubos en el incubador durante 15 minutos para minimizar el volumen muerto. Utilice tubos con un diámetro interno de 0,04 pulgadas. Un diámetro menor del tubo evita la formación de burbujas.
A continuación, llene la jeringa de 20 mililitros con 12 mililitros de medio VE tibio. Elimine por completo la burbuja de la jeringa. Llene la entrada del portaobjetos microscópico con medio VE.
Conecte este conjunto a la microplaca. Fije suavemente el conector de salida a la microplaca. Lleve el montaje al incubador y conéctelo a la bomba de jeringa.
Luego, configure la bomba a una velocidad de cizallamiento de 10 microlitros por minuto antes de dejar las células durante la noche en el incubador a 37 grados Celsius. Al día siguiente, desarme el montaje retirando el conector unido a la entrada del portaobjeto microscópico. Luego, retire el conector de salida dos para upregulizar la expresión de e-selectina en las células endoteliales.
Prepare medio de crecimiento fresco que contenga interleucina uno beta. Aspire el medio con una jeringa de 10 mililitros. Retire el medio residual de la entrada del portaobjetos, luego agregue medio fresco llenando completamente la entrada.
Conecte la jeringa al portaobjetos. Establezca la bomba de jeringa a una velocidad de cizallamiento de 10 microlitros por minuto durante cuatro horas en el incubador durante la incubación con interleucina uno beta de vex, prepare células de cáncer de próstata marcadas con anticuerpo anti-PSMA Alexa 488. Primero, agregue tripsina-EDTA al 0,05 % a las células de cáncer de próstata MDA durante un minuto.
No exponga las células a la tripsina durante períodos más largos, ya que esto puede afectar los glicopéptidos presentes en la superficie celular. Centrifugue las células a 200 veces G durante cinco minutos. A continuación, re suspenda el paladar celular MDA en un mililitro de tampón de Hank y agregue el anticuerpo anti-PSMA; incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en un lugar oscuro, re suspendiendo las células durante la incubación.
Después de 30 minutos, centrifugue la solución celular a 800 ×g durante cinco minutos. Aspire y resuspenda el precipitado en un mililitro de tampón de Hank. Cuente las células MDA marcadas y ajuste la concentración final a un millón de células por mililitro.
Llene una jeringa de cinco mililitros con las células MDA marcadas y elimine las burbujas. Encienda el microscopio invertido y configure la iluminación de campo claro en el objetivo de 10 x. Coloque la bomba de jeringa al mismo nivel que la platina de la muestra del microscopio y ajústela a un esfuerzo cortante de un centavo por centímetro cuadrado.
A continuación, abra el software Zeiss Axio Vision. Seleccione el objetivo en la pantalla del ordenador. Cree una nueva carpeta en la opción de herramientas del software.
Abra la opción de experimentos inteligentes en Axio Vision y ajuste la configuración para grabar videos cortos de 1/32 segundos durante 30 minutos. Para el video fluorescente en vivo, configure las opciones de imagen. Estos parámetros ayudan a obtener videos cercanos a la velocidad de fotogramas del video con la cámara Zeiss MRM para visualizar el ancho completo del canal de flujo con un objetivo de 10x en la pantalla del ordenador; utilice un adaptador de montura CM, encienda la lámpara de mercurio antes de colocar la jeringa y el conector que contiene las células en la bomba de jeringa. A continuación, conecte el conector al canal de entrada lleno del microportaobjetos que contiene el ax estimulado con interleucina uno beta.
Conecte el canal de salida con el conector unido al tubo. Coloque el tubo en un recipiente o en un tubo cónico de 15 mililitros para recoger el flujo que atraviesa. Inicie la infusión a través de la microplaca a 10 microlitros por minuto.
Observe las interacciones entre las células endoteliales y las células MDA marcadas o las CTC marcadas derivadas de pacientes bajo 488 nanómetros. Filtre en el microscopio de fluorescencia episcópica. Comience a grabar el experimento como 32 videos cortos.
Durante el análisis de reproducción, mida la velocidad de rodadura. La velocidad de rodadura se mide dividiendo la distancia recorrida por las células entre el tiempo. Se muestra aquí un cultivo de sobrenoche de una monocapa de células endoteliales.
En la microplaca. Las escalas indican que el 100 % de la microplaca es visible utilizando un objetivo de cinco aumentos, mientras que el 70 % es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos para interacciones mediadas seleccionadas; las células que ruedan en los bordes no se consideran, lo que hace que más del 70 % de la microplaca esté disponible para el análisis mediante grabación y reproducción de video. El diagrama de caja muestra la distribución de las velocidades de rodadura de las células MDA no marcadas y marcadas con anti-PSMA sobre células endoteliales estimuladas con interleucina-1 beta en diferentes condiciones de tensión cortante.
No se observó una diferencia significativa en las velocidades de rodadura a uno y cinco centímetros cuadrados con un esfuerzo cortante más alto de 10 dinas por centímetro cuadrado. Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre las velocidades de rodadura de las células MDA no marcadas y las marcadas con anti-PSMA. Un video tomado con sangre de un paciente con cáncer de próstata muestra tres tipos de interacciones entre las CTCs prostáticas marcadas y las células endoteliales que expresan lectina: sujeción, donde las CTCs se adhieren y vuelven a adherirse; adhesión estable, donde las CTCs no se desprenden incluso después de 30 segundos; y ausencia de interacciones, cuando las CTCs no interactivas entran en el campo de visión. Las microplacas pueden ser fácilmente inmunotincionadas y analizadas mediante imágenes de fluorescencia para observar la adhesión firme de las células MDA marcadas con anti-PSMA.
Después de la profusión sobre células endoteliales estimuladas con interleucina uno beta se puede observar aquí. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar las interacciones entre células raras, como las células tumorales prostáticas circulantes, y las células endoteliales que expresan S-selectina siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la inmunofluorescencia, también se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como la presencia de ligandos de S-selectina.
Técnicas como estas pueden ayudar a los investigadores a comprender los diferentes pasos implicados en la metástasis.
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Resumen
Este informe presenta un método novedoso para visualizar y analizar las interacciones entre células tumorales circulantes (CTCs) y células endoteliales (ECs) en el cáncer de próstata bajo condiciones fisiológicas de flujo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Biología celular
- Microfluídica
Antecedentes
- Las células tumorales circulantes desempeñan un papel fundamental en la metástasis del cáncer.
- Las células endoteliales son esenciales para la extravasación de las células tumorales.
- Comprender las interacciones entre CTC y EC puede proporcionar información sobre la progresión del cáncer.
- Los métodos actuales carecen de la capacidad para estudiar estas interacciones en condiciones fisiológicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para examinar las interacciones entre CTC y EC en tiempo real.
- Utilizar un ensamblaje de flujo en lámina microscópica para la observación dinámica.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de metástasis del cáncer de próstata.
Métodos Utilizados
- Recubrimiento de una lámina microscópica con fibronectina.
- Cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana en un sistema de flujo dinámico.
- Etiquetado de células de cáncer de próstata con un anticuerpo monoclonal anti-PSMA.
- Uso de microscopía de video para visualizar las interacciones entre células de cáncer de próstata marcadas y células endoteliales.
Resultados principales
- Visualización exitosa de las interacciones entre CTC y EC bajo condiciones de flujo.
- Se demostró la internalización del anticuerpo anti-PSMA en células de cáncer de próstata.
- Proporcionó información sobre la dinámica de la adhesión de células cancerosas a células endoteliales.
- Se estableció un método confiable para estudios futuros sobre metástasis del cáncer.
Conclusiones
- El método desarrollado permite el análisis en tiempo real de las interacciones entre CTC y EC.
- Este enfoque puede aplicarse para investigar más a fondo la biología del cáncer de próstata.
- Comprender estas interacciones podría conducir a nuevas estrategias terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la observación directa de interacciones raras entre células tumorales circulantes y células endoteliales bajo flujo fisiológico, abordando una brecha crítica en la investigación de la metástasis. Al proporcionar datos cuantitativos en tiempo real sobre la dinámica de adhesión, apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en el desarrollo de terapias para el cáncer de próstata. El enfoque mejora la confianza predictiva en los modelos preclínicos al capturar interacciones célula-célula fisiológicamente relevantes que los ensayos estáticos pasan por alto.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos mediados por E-selectina en la metástasis del cáncer de próstata, apoyando la comprobación de hipótesis sobre dianas terapéuticas.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para validar dianas de adhesión endotelial utilizando células derivadas de pacientes, escasas en número.
- Valor predictivo: Genera datos cuantitativos sobre la velocidad de rodadura y la adhesión para reducir el riesgo asociado a las hipótesis sobre la interacción con dianas terapéuticas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera condiciones estandarizadas y controladas por esfuerzo cortante para mediciones consistentes de la interacción entre CTC y endotelio.
- Escalabilidad: Utiliza un ensamblaje de flujo microfluídico compatible con sistemas multicanal para la selección paralela de compuestos o anticuerpos.
- Resultado cuantitativo: Proporciona puntos finales medibles como la velocidad de rodadura y la frecuencia de adhesión estable para la optimización del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza células tumorales circulantes derivadas de pacientes para mantener la relevancia fisiológica en modelos preclínicos.
- Continuidad mecanicista: Conecta hallazgos in vitro con metástasis in vivo mediante la modelización de condiciones de cizalladura hemodinámica.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Permite la evaluación de candidatos terapéuticos que interrumpen las interacciones entre CTC y endotelio bajo flujo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica de la eficacia, permitiendo específicamente la evaluación hemodinámica de los mecanismos relacionados con la metástasis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre moléculas de adhesión como la E-selectina en las vías de extravasación de células tumorales.
- Cribado: Proporciona datos cuantitativos de interacción dependientes del esfuerzo cortante, esenciales para campañas reproducibles de cribado de compuestos.
- Análisis: Ofrece métricas de velocidad de rodadura y frecuencia de adhesión que permiten análisis comparativos entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Modela el flujo fisiológico para mejorar la predictibilidad preclínica de intervenciones anti-metastásicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma microfluídica reutilizable para estudiar interacciones de células raras en múltiples proyectos de oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de metástasis al capturar interacciones celulares dinámicas dependientes del flujo.
- Valor operativo: Estandariza el manejo de células raras y el cultivo endotelial bajo flujo, mejorando la reproducibilidad del ensayo.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar al validar la interacción con el blanco en un contexto fisiológicamente relevante.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de terapéuticas antiadhesión basándose en datos funcionales de interacción.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en ensamblaje de microfluidos, cultivo de células endoteliales bajo esfuerzo cortante y marcado fluorescente de células.
- Depende de microscopía invertida con capacidades de fluorescencia y sistemas de bombas de jeringa para un control preciso del flujo.
- Necesita la estandarización de las condiciones de esfuerzo cortante y de los protocolos de preparación celular entre diferentes equipos.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros tipos de tumores o fuentes endoteliales.
- Está limitado por la rareza de las células tumorales circulantes, lo que requiere estrategias eficientes de enriquecimiento y marcado para garantizar una captura suficiente de eventos.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
4:04
Preparation of Flow Chamber Assembly for Overnight HUVEC Culture on a Microslide
5:48
Preparation of Anti-PSMA Labeled Prostate Cancer Cells
7:05
Preparation of Microscope, Syringe Pump and Flow Chamber Assembly
9:11
Results: Analysis of Interactions Between Labeled MDA Prostate Cancer Cells and Endothelial Cells
11:11
Conclusion
1:50
Culturing HUVECs on Microslides for Observing Circulating Tumor Cell (CTC)-endothelial Interactions
