Name: Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprende a examinar interacciones entre células tumorales circulantes de próstata y células endoteliales humanas usando un sistema de flujo dinámico con microcámaras. Este método permite visualizar en tiempo real los mecanismos de adhesión celular.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento de Defensa de la próstata Programa de Investigación del Cáncer (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 del Instituto Nacional del Cáncer y el Fondo de Investigación Robert McCooey Oncología Genitourinaria. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patología) para proporcionar anticuerpos VE-cadherina, y el Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirugía) para proporcionar HUVECs.

1. El cultivo de HUVEC microportaobjetos para Interacciones de Observación del CTC-endoteliales <ol><li> Bajo la campana de cultivo de tejidos, primero enjuague el microportaobjetos, ancho de canal de 1 mm con PBS. Suavemente la capa MicroSlide con 200 l de 50 mg / ml de fibronectina (disuelto en PBS) usando una jeringa de cierre Luer de 1 ml. </li><li> Cubrir el MicroSlide con la tapa y mantenerlo dentro de la campana de cultivo de tejido durante 30 min. De dispensación lenta del líquido en el MicroSlide impide la formación de burbujas en el canal. </li><li> Perfundir 200 l de agua tibia (37 ° C) de HUVEC medio de crecimiento (medio M199, HEPES 1 M, 20% de FBS, 5 mg / ml de heparina, factor de crecimiento celular endotelial 100 g / ml, y L-glutamina) sobre el MicroSlide e incubar 20 min a temperatura ambiente. Durante la perfusión, preparar la suspensión de células HUVEC. </li><li> Enjuague HUVECs con PBS y añadir 0,05% de tripsina-EDTA durante 1-2 min a TA. Centrífuga HUVECs en 2 ml de medio de crecimiento a 180 xg durante 5 min. </li><li> Medir la concentración de células usando un Neubahemocitómetro uer y preparar 10 7 HUVEC células/100 l medio de cultivo. A continuación, retire con cuidado el medio de la entrada de la microportaobjetos usando una punta de pipeta de 200 l. </li><li> Llevar el MicroSlide a nivel de los ojos y el uso de una jeringa de 1 ml Luer-Lock, perfundir suavemente 200 l de concentración de preparado de HUVECs en el canal. Se debe tener precaución en este paso para evitar la formación de burbujas. Si aparecen burbujas, mantenga la perfusión durante un tiempo un poco más largo hasta que las burbujas entren en el canal de salida. </li><li> Ponga un volumen igual (~ 80 l) de los medios de comunicación HUVEC tanto en la entrada y salida de la MicroSlide. Esto evita que el flujo de células en cualquier dirección. </li><li> Cubrir el portaobjetos y mantenerlo en la incubadora (37 ° C) durante 1,5 horas. </li></ol> 2. Preparación de Flujo Asamblea Cámara para pasar la noche HUVEC Cultura en un MicroSlide <ol><li> Coloque una jeringa estéril de 20 ml, conectores Luer hembra y macho, los tubos y una bomba de jeringa en la incubadora durante 15 millasn. </li><li> Para un volumen muerto mínimo, utilizar el tubo con diámetro interior de 0,04 pulgadas. Menor diámetro tubo impide la formación de burbujas. </li><li> Llene la jeringa de 20 ml con agua caliente (37 ° C) HUVEC medios de comunicación (12 ml). Una el tubo con los conectores en la jeringa. Quite las burbujas. Conecte este conjunto a la microportaobjetos. </li><li> Llenar completamente la entrada de la MicroSlide con medios HUVEC. Traiga la jeringa de 20 ml conectada al conector junto al microportaobjetos. Conecte con cuidado el conector a la microportaobjetos. </li><li> Traiga la puesta a punto en la incubadora y conectarlo a la bomba de jeringa, puesta a régimen de cizalladura 10 l / min. Deje las células O / N en la incubadora a 37 ° C. </li><li> Al día siguiente, desmontar la puesta a punto mediante la eliminación de el conector unido a la entrada de la MicroSlide. </li><li> Para regular positivamente la expresión de E-selectina sobre las CE, preparar el medio de cultivo fresco que contenía IL-1β a 10 ng / ml en 4 ml de medio. Aspirar los medios de comunicación en una jeringa de 10 ml. Retire tque los medios de comunicación a partir de la entrada de la microportaobjetos y conectar la jeringa a la diapositiva. </li><li> Ajuste la bomba de jeringa a 10 la velocidad de cizalla l / min durante 4 horas en la incubadora. </li></ol> 3. Elaboración de Anti-PSMA (J591-488) con etiqueta células del cáncer de próstata <ol><li> Durante la incubación IL-1β de HUVECs, preparar anti-PSMA J591-Alexa488 etiquetados células de CaP. Añadir 0,05% de tripsina-EDTA para células MDA durante 1 min. No exponer las células a tripsina durante tiempos más largos, ya que puede afectar a los glicopéptidos presentes en la superficie celular. Reactivo de disociación celular libre de enzimas también se puede utilizar en lugar de la tripsina. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender sedimento celular MDA in 1 ml de H / H tampón (sal de Hanks equilibrada solution/0.1% HSA/10 HEPES / CaCl2 1 mM). Añadir anticuerpo-J591 Alexa488 anti-PSMA a 20 mg / mL durante 30 min a TA en un lugar oscuro. Resuspender las células durante la incubación. </li><li> Después de 30 min, se centrifuga la solución de células a 800 xg durante 5 min. Aspitasa y resuspender el precipitado en 1 ml de tampón H / H. Contar las células MDA etiquetados y llevar la concentración final de 1x10 6 células / ml. Llene una jeringa de 5 ml con J591-488 células MDA etiquetados y eliminar las burbujas. </li></ol> 4. Preparación de anti-PSMA (J591-488) Etiquetada CTCs Enriquecido de CaP pacientes <ol><li> Recoger 7,5 ml de sangre de pacientes con cáncer de próstata en un tubo de tapa azul (que contiene citrato de sodio). Suavemente diluir 1:01 sangre en 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS. </li><li> Añadir 5,3 ml de Ficoll-Paque Plus en un tubo cónico de 50 ml. Capa diluyó la sangre en la parte superior de la Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 xg durante 30 min. </li><li> Pre-coat todos los tubos o consejos de entrar en contacto con las CTC con un 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (tampón R / S) para evitar la unión no específica de los CTC a las superficies. Mantener 4 ° C de temperatura de los medios y tampones que entran en contacto con los CTC. </li><li> Recoger el de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fraccióncontiene CTCs de la interfaz en otro tubo cónico de 50 ml que contiene 30 ml de tampón de R / S. Se centrifuga a 400 g durante 8 min. </li><li> Resuspender el precipitado y lavar de nuevo en tampón de R / S a 400 xg durante 8 min. Después de la centrifugación, se resuspende el sedimento en tampón H / h. Añadir anti-PSMA J591-488 anticuerpo a 20 mg / ml durante 30 min a TA en un lugar oscuro. </li><li> Después de 30 minutos, centrifugar los PBMCs que contengan J591-488 CTCs etiquetados a 800 xg durante 5 min. Volver a suspender en tampón H / H. Llene una jeringa de 1 ml (pre-recubiertos con tampón de R / S) con la muestra. </li></ol> 5. Preparación del microscopio, la bomba de jeringa y flujo Asamblea Cámara <ol><li> Encienda el microscopio invertido y ajuste la iluminación Kohler a 10X objetivo. Traiga la bomba de jeringa al mismo nivel que la etapa de la muestra del microscopio y lo fijó en 1 dyn / cm 2 esfuerzo de corte (~ 10 l / min). </li><li> Abra el software Zeiss Axiovision. Seleccione el objeto en la pantalla de ordenador. Crear un nuevocarpeta en la opción de herramientas en el software. </li><li> Abra la opción experimentos inteligentes en Axiovision y ajuste la configuración para grabar vídeos de corta duración 30 seg durante 30 min. </li><li> Para el vídeo fluorescente en vivo, establezca las opciones-12 de imagen ms de exposición, 2 x 2 bandejas, 5 Gain. Estos parámetros ayudan en la consecución de los vídeos cercanas a la velocidad de fotogramas de vídeo (~ 23 cuadros por segundo) con la cámara Zeiss MRM. </li><li> Para visualizar ancho del canal de flujo a 10 X objetivo en la pantalla del ordenador, utilice un adaptador de montura C (0,63 mm xf/60 Interface). </li><li> Encienda la lámpara de mercurio. </li><li> Coloque la jeringa y el conector que contiene las células en la bomba de jeringa. </li><li> Llevar la IL-1β estimulada HUVEC de la incubadora. Enchufe el conector en el canal de entrada de lleno de la microportaobjetos contiene HUVECs. </li><li> Conectar el canal de salida con el conector unido a la tubería. Ponga el tubo en un plato o 15 ml tubo cónico para recoger el flujo a través. </li><li> Inicie la infusia través de la MicroSlide a 10 l / min. Tenga en cuenta las interacciones entre las células endoteliales y las células MDA marcados o etiquetados CTC derivados de pacientes menores de filtro de 488 nm en el microscopio de epifluorescencia. </li><li> Comienza la grabación del experimento como 30 seg videos cortos. Durante el análisis de la reproducción, medir la velocidad de rotación. La velocidad de rotación se mide dividiendo la distancia recorrida por las células con el tiempo. </li></ol> 6. La inmunotinción de la MicroSlide <ol><li> Retire el papel de la entrada y salida del microportaobjetos después de la perfusión de las células MDA en IL-1β estimulada HUVECs durante 10 min. </li><li> Con una punta de 200 l, poner caliente (37 ° C) de PBS que contiene calcio y magnesio en la entrada de la microportaobjetos durante 5 min. Incline la microportaobjetos usando su tapa como un apoyo en el banquillo. Mantenga el MicroSlide en una posición inclinada para todas las incubaciones durante inmunotinción. </li><li> Fijar HUVECs perfundiendo cálida formaldehído al 2% en la entrada </li><li&gt; incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Añadir Triton X-100 (0,1%) en 5% de BSA en PBS durante 10 min a TA. </li><li> Enjuague dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Se bloquea con 5% de BSA en PBS durante 30 min. </li><li> Se incuba con anticuerpo de cabra anti-primaria VE-cadherina (1:100) en 2,5% BSA O / N a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Añadir burro secundario de cabra anti-647 de anticuerpos durante 45 minutos. Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Incubar a temperatura ambiente con anticuerpo humanizado conjugado-J591 Alexa488 durante 1 hora. </li><li> Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Añadir DAPI durante 5 min. Lavar con agua destilada durante 5 min. </li><li> Añadir PBS (o Mowiol para el almacenamiento a largo plazo). Visualice el microportaobjetos bajo el microscopio confocal. </li></ol>

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<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li>
</ol>

Dr. Bander es el inventor de las patentes que se asignan a la Fundación de Investigación de Cornell (&quot;IRC&quot;) para el anticuerpo J591 utilizada en este artículo. Dr. Bander es consultor y posee acciones en BZL Biologics, la empresa a la que las patentes han sido autorizados por el CRF de una mayor investigación y desarrollo.

Debido al bajo número de CTC entre las células de la sangre, es difícil aislar los CTC como una población pura de células. Con el fin de estudiar las interacciones CTC / CE, la población rara e impuro de los CTC plantea dos grandes retos: a) Identificación de los CTC entre las células de la sangre; b) Observación de las interacciones CTC / CE. Para superar la primera limitación de la identificación de los CTC de próstata entre los glóbulos, tomamos ventaja del hec...

La metástasis es un proceso de múltiples pasos compleja que sigue siendo poco conocida. El eje ligando E-selectin/selectin se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la promoción de interacciones adhesivas primarias entre el endotelio vascular y células de cáncer de 1,2. Endotelial (E)-selectina es una proteína transmembrana expresada por las células endoteliales activadas, mientras diferente ligando (s) de E-selectina se expresan por las células tumorales 3. Numerosos enfoques in vitro se han empleado con éxito para modelar las interacciones de ligando E-selectin/selectin entre las células tumorales y las células endoteliales (EC) 1. Para el estudio de estas interacciones, se están empleando diferentes sistemas de cámara de flujo para simular el sistema vascular arterial. Entre conjuntos de cámara de flujo, la cámara de flujo de placas paralelas (PPFC) en conjunción con las EC se utiliza rutinariamente como un modelo in vitro simulando in vivo en condiciones de estrés de cizallamiento. En estemétodo, ECs se cultivan en un plato de 35 mm y después de la consecución de una monocapa, las EC se adjuntan a la PPFC y experimentos basados ​​en la tensión de cizallamiento se realizan. Sin embargo, PPFC y otros sistemas actuales presentan muchas limitaciones para el estudio de las interacciones adhesivas entre las células tumorales (CTC) derivadas de pacientes y EC, que circula principalmente, porque CTC son una población rara de células, arrojar desde el tumor primario, que circula entre los millones de células de la sangre (1 CTC por 10 9 células de la sangre) 4. Por lo tanto, a diferencia de suministro ilimitado de líneas de células cultivadas, bajo recuento de CTC conducen a muy pocas y raras interacciones CTC / CE, requiriendo adecuado ancho de canal de flujo para registrar las interacciones de análisis de la reproducción. Además, dado que los pacientes CTC derivados son una población impura, por lo tanto, se requiere un marcador de identificación para rastrear las CTC en específico. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un nuevo método para identificar el cáncer de próstata (CaP) CTCs tomando ventaja del hecho de que prácticamente todos estos CTC expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en su superficie celular 5,6. En este informe, se utilizó la línea celular de cáncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demostrar la utilidad potencial de nuestro nuevo sistema para el estudio de la próstata interacciones CTC con EC, con el tiempo para comprender el mecanismo de la metástasis. Nuestra metodología se puede aplicar para varios experimentos de cizalla basada en la simulación de sistema vascular in vivo en 7-9. Además de examinar las interacciones CaP CTC / CE, el sistema de cámara de flujo de corriente podría adaptarse fácilmente para el análisis de células mononucleares de sangre periférica o de las interacciones de células tumorales con EC. La facilidad de montaje y desmontaje de la cámara de flujo, un microportaobjetos III (0,1) (en lo sucesivo denominada como microportaobjetos), permite el cultivo de EC bajo perfusión y la estimulación de los EC con diferentes citocinas para inducir prOtein expresión. Además, cultivos de ECS, proteínas recombinantes, tales como E-y P-selectina se pueden cubrir en el microportaobjetos y las interacciones con las células tumorales pueden ser observados bajo condiciones de flujo laminar 10.

<table><tbody><tr><td>Microportaobjetos</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador Luer macho</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador Luer hembra</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Luer-lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medio</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Mitógeno endotelial</td><td>Tecnologías biomédicas</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Laboratorio de Oncología</td><td></td><td></td>Urológica</tr><tr><td>Interleucina-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Departamento de Cirugía</td><td></td><td>proporcionado por Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>objetivo Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación de células libres de enzimas</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

método in vitro para observar interacciones mediadas por e-selectina entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

La metástasis es un proceso en el que las células tumorales se desprenden de tumor intravasate vascular de la sangre primaria y el sistema linfático, de ese modo, obtener el acceso a la extravasación y formar un nicho secundaria. La extravasación de las células tumorales desde el sistema vascular de la sangre puede ser estudiada usando células endoteliales (ECs) y las células tumorales obtenidas a partir de diferentes líneas celulares. Se llevaron a cabo estudios iniciales usando condiciones estáticas, pero se ha documentado bien que los EC se comportan de manera diferente bajo condiciones de flujo fisiológico. Por lo tanto, los diferentes conjuntos de cámara de flujo actualmente se utilizan para el estudio de las interacciones celulares de cáncer con EC. Ensambles de cámara de flujo actuales ofrecen resultados reproducibles, ya sea utilizando diferentes líneas celulares o de líquido a diferentes condiciones de estrés de cizalla. Sin embargo, para observar y estudiar las interacciones con las células raras, como las células del tumor (CTCs) en circulación, se requieren ciertos cambios que deben introducirse en el conjunto de la cámara de flujo convencional. CTCsson una población de células raras entre millones de células sanguíneas. En consecuencia, es difícil obtener una población pura de CTC. La contaminación de las CTC con diferentes tipos de células que se encuentran normalmente en la circulación es inevitable el uso de presente de enriquecimiento o técnicas de agotamiento. En el presente informe se describe un método único para la etiqueta circular las células de cáncer de próstata con fluorescencia y estudiar sus interacciones con EC en un sistema de cámara de flujo auto-ensamblado. Esta técnica se puede aplicar además a observar las interacciones entre CTC próstata y cualquier proteína de interés.

La figura 1 muestra un cultivo O / N de una monocapa de EC en la MicroSlide. Los batiduras en la Figura 1A muestra que el 100% de la MicroSlide es visible usando objetivo 5X mientras que el 70% es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos (figura 1B). Para E-selectina mediada por las interacciones, las células de rodadura en los bordes no se consideran que hace más de 70% de la MicroSlide disponible para la grabación en vídeo y análisis de la reproducción. En nuestr...

Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.

Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata y células endoteliales que expresan e selectina, utilizando un ensamblaje de flujo con microportaobjetos. Esto se logra primero recubriendo un microportaobjetos con fibronectina. El segundo paso consiste en cultivar células endoteliales de vena umbilical humana o VE en un sistema de flujo dinámico sobre un microportaobjetos con un canal de ancho reducido.A continuación, las células de cáncer de próstata se marcan con un anticuerpo monoclonal humanizado antígeno de membrana específico de próstata o PSMA, el cual se internaliza. El paso final consiste en perfundir las células de cáncer de próstata marcadas con anti-PSMA sobre las VE que expresan e-selectina. Finalmente, se utiliza microscopía de video para mostrar las interacciones entre las células de cáncer de próstata y las células endoteliales.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la cámara de flujo de placas paralelas y otros ensamblajes dinámicos, es que con ella se pueden examinar las interacciones entre células raras de cáncer de próstata, tales como células tumorales circulantes y células endoteliales cultivadas, en un sistema de flujo dinámico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis, como ¿cómo metastatizan las células tumorales de próstata a través del sistema vascular sanguíneo? ¿Utilizan el mismo mecanismo que emplean los leucocitos durante su ización?Generalmente, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque implica cultivar una monocapa de células endoteliales en un canal estrecho bajo perfusión dentro de la cabina de cultivo celular. Primero, enjuague la microplaca con solución salina tamponada con fosfato o PBS. Luego, recubra suavemente la microplaca con 200 microlitros de fibronectina al 50 microgramos por mililitro utilizando una jeringa de bloqueo de 1 mililitro.Cubra la microplaca con la tapa y déjela dentro de la campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos. A continuación, perfunda 200 microlitros de medio de crecimiento tibio sobre la microplaca e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. La dispensación lenta del líquido en la microplaca evita la formación de burbujas en el canal.Durante la perfusión, prepare la suspensión de vex lavando el vex con PBS y agregando colagenasa al 0,1 % más EDTA al 0,05 % en PBS durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Centrifugue el hve en dos mililitros de medio de crecimiento a 180 ×g durante cinco minutos. Luego, mida la concentración celular utilizando un hemocitómetro y prepare 10 millones de células por 100 microlitros de medio de crecimiento.A continuación, retire cuidadosamente el medio de la entrada de la microplaca. Utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros, coloque la microplaca a la altura de los ojos y, con una jeringa de bloqueo de 1 mililitro, perfunda suavemente 200 microlitros de la concentración preparada de vex en el canal. Se requiere precaución en este paso para evitar la formación de burbujas; si aparecen burbujas, continúe perfundiendo durante un tiempo ligeramente más largo hasta que las burbujas entren en el canal de salida.A continuación, pipete un volumen igual de aproximadamente 80 microlitros de medio VE en la entrada y la salida del portaobjetos microscópico. Esto evita el flujo de células en cualquier dirección. Cubra el portaobjetos y colóquelo en un incubador a 37 grados Celsius durante 1,5 horas.Para comenzar el ensamblaje de la cámara de flujo, coloque una jeringa estéril de 20 mililitros, conectores hembra y macho del tipo lure, una bomba de jeringa y tubos en el incubador durante 15 minutos para minimizar el volumen muerto. Utilice tubos con un diámetro interno de 0,04 pulgadas. Un diámetro menor del tubo evita la formación de burbujas.A continuación, llene la jeringa de 20 mililitros con 12 mililitros de medio VE tibio. Elimine por completo la burbuja de la jeringa. Llene la entrada del portaobjetos microscópico con medio VE.Conecte este conjunto a la microplaca. Fije suavemente el conector de salida a la microplaca. Lleve el montaje al incubador y conéctelo a la bomba de jeringa.Luego, configure la bomba a una velocidad de cizallamiento de 10 microlitros por minuto antes de dejar las células durante la noche en el incubador a 37 grados Celsius. Al día siguiente, desarme el montaje retirando el conector unido a la entrada del portaobjeto microscópico. Luego, retire el conector de salida dos para upregulizar la expresión de e-selectina en las células endoteliales.Prepare medio de crecimiento fresco que contenga interleucina uno beta. Aspire el medio con una jeringa de 10 mililitros. Retire el medio residual de la entrada del portaobjetos, luego agregue medio fresco llenando completamente la entrada.Conecte la jeringa al portaobjetos. Establezca la bomba de jeringa a una velocidad de cizallamiento de 10 microlitros por minuto durante cuatro horas en el incubador durante la incubación con interleucina uno beta de vex, prepare células de cáncer de próstata marcadas con anticuerpo anti-PSMA Alexa 488. Primero, agregue tripsina-EDTA al 0,05 % a las células de cáncer de próstata MDA durante un minuto.No exponga las células a la tripsina durante períodos más largos, ya que esto puede afectar los glicopéptidos presentes en la superficie celular. Centrifugue las células a 200 veces G durante cinco minutos. A continuación, re suspenda el paladar celular MDA en un mililitro de tampón de Hank y agregue el anticuerpo anti-PSMA; incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en un lugar oscuro, re suspendiendo las células durante la incubación.Después de 30 minutos, centrifugue la solución celular a 800 ×g durante cinco minutos. Aspire y resuspenda el precipitado en un mililitro de tampón de Hank. Cuente las células MDA marcadas y ajuste la concentración final a un millón de células por mililitro.Llene una jeringa de cinco mililitros con las células MDA marcadas y elimine las burbujas. Encienda el microscopio invertido y configure la iluminación de campo claro en el objetivo de 10 x. Coloque la bomba de jeringa al mismo nivel que la platina de la muestra del microscopio y ajústela a un esfuerzo cortante de un centavo por centímetro cuadrado.A continuación, abra el software Zeiss Axio Vision. Seleccione el objetivo en la pantalla del ordenador. Cree una nueva carpeta en la opción de herramientas del software.Abra la opción de experimentos inteligentes en Axio Vision y ajuste la configuración para grabar videos cortos de 1/32 segundos durante 30 minutos. Para el video fluorescente en vivo, configure las opciones de imagen. Estos parámetros ayudan a obtener videos cercanos a la velocidad de fotogramas del video con la cámara Zeiss MRM para visualizar el ancho completo del canal de flujo con un objetivo de 10x en la pantalla del ordenador; utilice un adaptador de montura CM, encienda la lámpara de mercurio antes de colocar la jeringa y el conector que contiene las células en la bomba de jeringa. A continuación, conecte el conector al canal de entrada lleno del microportaobjetos que contiene el ax estimulado con interleucina uno beta.Conecte el canal de salida con el conector unido al tubo. Coloque el tubo en un recipiente o en un tubo cónico de 15 mililitros para recoger el flujo que atraviesa. Inicie la infusión a través de la microplaca a 10 microlitros por minuto.Observe las interacciones entre las células endoteliales y las células MDA marcadas o las CTC marcadas derivadas de pacientes bajo 488 nanómetros. Filtre en el microscopio de fluorescencia episcópica. Comience a grabar el experimento como 32 videos cortos.Durante el análisis de reproducción, mida la velocidad de rodadura. La velocidad de rodadura se mide dividiendo la distancia recorrida por las células entre el tiempo. Se muestra aquí un cultivo de sobrenoche de una monocapa de células endoteliales.En la microplaca. Las escalas indican que el 100 % de la microplaca es visible utilizando un objetivo de cinco aumentos, mientras que el 70 % es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos para interacciones mediadas seleccionadas; las células que ruedan en los bordes no se consideran, lo que hace que más del 70 % de la microplaca esté disponible para el análisis mediante grabación y reproducción de video. El diagrama de caja muestra la distribución de las velocidades de rodadura de las células MDA no marcadas y marcadas con anti-PSMA sobre células endoteliales estimuladas con interleucina-1 beta en diferentes condiciones de tensión cortante.No se observó una diferencia significativa en las velocidades de rodadura a uno y cinco centímetros cuadrados con un esfuerzo cortante más alto de 10 dinas por centímetro cuadrado. Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre las velocidades de rodadura de las células MDA no marcadas y las marcadas con anti-PSMA. Un video tomado con sangre de un paciente con cáncer de próstata muestra tres tipos de interacciones entre las CTCs prostáticas marcadas y las células endoteliales que expresan lectina: sujeción, donde las CTCs se adhieren y vuelven a adherirse; adhesión estable, donde las CTCs no se desprenden incluso después de 30 segundos; y ausencia de interacciones, cuando las CTCs no interactivas entran en el campo de visión. Las microplacas pueden ser fácilmente inmunotincionadas y analizadas mediante imágenes de fluorescencia para observar la adhesión firme de las células MDA marcadas con anti-PSMA.Después de la profusión sobre células endoteliales estimuladas con interleucina uno beta se puede observar aquí. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar las interacciones entre células raras, como las células tumorales prostáticas circulantes, y las células endoteliales que expresan S-selectina siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la inmunofluorescencia, también se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como la presencia de ligandos de S-selectina.Técnicas como estas pueden ayudar a los investigadores a comprender los diferentes pasos implicados en la metástasis.

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Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal

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