Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y Ex vivo Los fibroblastos

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la biología distintiva en la interfaz entre las células epiteliales malignas en el frente del tumor invasivo y las células estromales asociadas al cáncer. Esto se logra estableciendo primero cultivos primarios de fibroblastos a partir de implantes colónicos. El segundo paso es construir modelos organotípicos de cocultivo utilizando fibroblastos colónicos primarios y células de cáncer colorrectal cultivadas.

A continuación, los modelos organotípicos se fijan en formina, se seccionan en portaobjetos montados en membranas y se tiñen con violeta crestal. El paso final es la microdisección láser para separar las células tumorales invasoras de las células tumorales no invasoras y las células estromales asociadas al cáncer. En última instancia, las técnicas de perfil molecular se pueden utilizar para caracterizar la biología de las células tumorales invasoras y no invasoras y las células estromales en el microambiente tumoral circundante.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de lo claramente distinguibles que son las células invasoras de las células no invasoras en modelos de cocultivo organotípico tridimensional de cáncer colorrectal. Para empezar, obtenga muestras de tejido de la mucosa del colon humano normal directamente del quirófano del laboratorio. Coloque una muestra en el centro de una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros, luego lave el cultivo tres veces con solución salina tamponada con fosfato o PBS suplementado con penicilina, estreptomicina y hongos.

No aspire después del lavado final con pinzas estériles y bisturí, corte el tejido en trozos pequeños. A continuación, coloca cada pieza en el centro de una cruz dibujada con la hoja del bisturí. En una placa de 12 pocillos, balancee suavemente el bisturí sobre el tejido para permitir que se adhiera al cultivo.

Las muestras están en 750 microlitros de medio de crecimiento de fibroblastos primarios, que deben sumergir el tejido sin permitirle flotar. A continuación, coloque las muestras en una incubadora de 37 grados centígrados, con un 5 a un 10% de CO2 durante los cinco días siguientes. Los fibroblastos comenzarán a crecer lentamente desde el borde del tejido aproximadamente a los siete días.

Esto será más visible después de aproximadamente tres o cuatro semanas. Y si hay suficientes fibroblastos creciendo, agregue 750 microlitros de tripsina a cada pocillo después de que las células se hayan desprendido y transfiera a un matraz de cultivo de tejidos T 25 para el gel organotípico impregnado de fibroblastos. Primero, prepare una suspensión de células de fibroblastos que contenga 500.000 células por gel en DMM suplementado.

Componen los geles organotípicos en hielo en las proporciones encontradas en el protocolo de texto para nueve geles a un mililitro por gel. Prepara 10 mililitros y mezcla suavemente para evitar burbujas. Luego agregue un mililitro a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incube durante una hora a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada.

Para permitir que los geles se asienten después de una hora, agregue un mililitro de DM EM suplementado encima de los geles y regrese a la incubadora durante la noche. Al día siguiente. Aspire el medio de la parte superior de los geles y coloque un mililitro de medio que contenga 500.000 células epiteliales de cáncer colorrectal para las láminas de nailon recubiertas de gel.

Prepare autoclaves estériles láminas de nailon de 1,5 centímetros por 1,5 centímetros con anticipación con pinzas estériles. Coloque la cantidad requerida de láminas de nailon en un plato de cultivo de 10 centímetros. Prepare la mezcla de gel en hielo como se describe en el protocolo de texto y agregue hidróxido de sodio 0.1 molar a la mezcla de gel hasta que se vuelva rosada, lo que indica que la solución ha sido neutralizada.

A continuación, añada 250 microlitros de esta solución a cada lámina de nylon. A continuación, incubar a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada de 5%CO2 durante 30 minutos para permitir que el gel se fije. A continuación, agregue 10 mililitros de una solución de glutaraldehído al 1% en PBS a cada placa de cultivo de 10 centímetros.

Una vez que el gel se haya endurecido antes de incubar a cuatro grados centígrados durante una hora, lave las láminas de nailon tres veces en PBS y una vez en dme suplementado. Incubar las láminas durante la noche en el mismo tampón a cuatro grados centígrados para elevar los geles organotípicos sobre rejillas de acero para rejillas de andamios esterilizadas por invasión que se han preparado doblando láminas de acero inoxidable en una formación de trípode. Luego use fórceps, esterilizados y etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos.

Coloque una lámina de nailon recubierta de gel con el lado del colágeno hacia arriba en cada rejilla. Transfiera con cuidado los geles organotípicos de la placa de 24 pocillos a la lámina de nailon elevada con una espátula, esterilizada y etanol. Llene el pocillo con D mem suplementado hasta que la lámina de nailon esté en contacto con el medio pero no sumergida.

Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico. Incubar durante 14 días a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada de 5%CO2, reemplazando el medio cada dos días.

Retire todo el organotípico, incluida la lámina de nylon, del pocillo y colóquelo sobre una película adhesiva. Dividir en dos la lámina organotípica y de nailon con un bisturí desechable limpio y fijar ambas mitades en formaldehído durante 24 horas. A temperatura ambiente, reemplace el formaldehído con etanol al 70% después de 24 horas y déjelo toda la noche antes de incrustarlo en parafina, seccionarlo y tintarlo para realizar la microdisección con láser.

Primera sección, el organotípico a 10 micras de espesor en portaobjetos montados en membrana. Después de tratar las secciones como se describe en el protocolo de texto, prepárese para realizar la microdisección láser utilizando el formulario de plataforma elegido. Coloque el portaobjetos de vidrio con la sección de la mancha que se va a diseccionar.

Boca abajo en la platina del microscopio, monte un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros en el casete de recolección y agregue 50 microlitros de tampón de lisis celular a la tapa en la que se recolectará el tejido microdiseccionado bajo visión directa. Utilice el joystick para identificar el tejido de interés y, mediante la interfaz del software, anote la sección orgánica teñida, resaltando las células que se microdiseccionarán en el frente de invasión del tumor. Indique al láser que dispare, lo que debe cortar la sección resaltada e impulsar el tejido de microdisección hacia la tapa del tubo de microcentrífuga.

Proceda a procesar las muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés. Aquí se muestran imágenes de microdisección láser de células de cáncer colorrectal SW 480 que invaden el estroma organotípico. El violeta crestal se utiliza para resaltar las células epiteliales del cáncer colorrectal.

A continuación, se definen las islas tumorales invasivas antes de que se produzca la disección con láser y la pieza cortada se transporta a un dispositivo de recolección. Las células no invasoras y las células estromales se identifican y aíslan utilizando la misma metodología. Los cocultivos tridimensionales se analizaron mediante perfiles de micro ARN para la comparación de los microARN expresados diferencialmente entre las células en el frente del tumor invasivo y las de las zonas tumorales estratificadas.

Los datos se ordenaron por cambio completo y valores de datos más o menos dos veces. Se presentan cambios de un experimento representativo que muestran la expresión génica diferencial de micro ARN entre las células de margen invasivas y las células de margen no invasivas. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo construir modelos organotípicos anatómicamente apropiados y cómo usar la microdisección láser para aislar poblaciones individuales de células para su posterior estudio. Whoa.