Name: Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y Ex vivo Los fibroblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a caracterizar la biología del frente invasivo tumoral en modelos organotípicos 3D de cáncer colorrectal mediante microdisección láser. Este método permite aislar células invasivas y estromales para perfilado molecular.

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MB es apoyada por subvenciones de una beca MRC. KP y AHM son apoyados por subvenciones del Wessex de Investigación Médica y de Investigación del Cáncer del Reino Unido / RCS (Inglaterra) (C28503/A10013). Estamos agradecidos por el apoyo de la Universidad de la Unidad de Investigación Histoquímica Southampton.

1. Establecimiento de cultivos de fibroblastos primarios de colon explantes <ol><li> Obtener muestras de tejido normal de la mucosa del colon humano directamente de la sala de operaciones quirúrgica, y suspender en 7-10 ml de PBS suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,25 mg / ml de Fungizone. </li><li> En el laboratorio, colocar la muestra en el centro de un 10 cm de placa de cultivo tisular y lavar 3 veces con PBS / Pen-Strep / Fungizone. No aspirar después del último lavado. </li><li> Con pinzas y bisturí estériles, cortar el tejido en trozos pequeños (aproximadamente 2 mm) y colocar cada pieza en el centro de una cruz dibujada con la hoja de bisturí en una placa de 12 pocillos. Rock the bisturí suavemente sobre el tejido para permitir que se adhiera. </li><li> Cultura los especímenes en 750 l de medios de crecimiento de fibroblastos primario (DMEM suplementado con 20% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 292 mg / ml de L-Glutamina), que debe submerge del tejido sin que le permite flotar. Evite molestar a la placa en los próximos 5 días, salvo para volver a la alimentación cada 2 días. </li><li> Durante los siguientes 5 días fibroblastos se lentamente comenzar a crecer fuera desde el borde del tejido. En aproximadamente 7 días, este será más visible. Después de aproximadamente 3-4 semanas, y si no son suficientes los fibroblastos que crecen fuera, añadir 750 l de tripsina a cada pocillo. Después las células se han separado (que puede tardar 5-10 min), la piscina y la transferencia a un matraz de cultivo tisular T-25. </li></ol> 2. Preparación Organotípicos Preparación de los fibroblastos impregnada de gel de organotípicos: <ol><li> Preparar una suspensión de células de fibroblastos que contiene 5 x 10 5 células por organotípicos en DMEM suplementado con 10% de FCS y 292 mg / ml de L-Glutamina. </li><li> Se llevan los geles organotípicos en el hielo, en las siguientes proporciones: <ul><li> 7 volúmenes de colágeno de cola de rata: mezcla de Matrigel (01:01) </li><li> 1 volumen de filtrado 10x DMEM </li><li> 1 volumen de FCS </li><li> 1 volumen de suspensión celular de fibroblastos que contiene 5 x 10 5 fibroblastos Para 9 geles (1 ml por gel) preparar 10 ml y mezclar suavemente para evitar burbujas. </li></ul></li><li> Añadir 1 ml a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 hora a 37 ° C en una atmósfera húmeda para permitir que los geles para ajustar. Después de 1 hora se añade 1 ml de DMEM (10% de FCS) / GLUT en la parte superior de los geles y volver a la incubadora durante la noche. </li><li> Al día siguiente, el medio aspirado desde la parte superior de los geles y la placa 1 ml de medio que contiene 5 x 10 5 células epiteliales CRC. </li></ol> Preparación de láminas de nylon recubierto de gel: <ol start="5"><li> Preparar estéril, hojas de nylon autoclave de 1,5 cm x 1,5 cm, por adelantado. </li><li> El uso de pinzas estériles, colocar el número requerido de hojas de nylon en una placa de cultivo de 10 cm (por lo general 4 hojas de nylon pueden ser acomodados por plato). </li><li> Invente gel en el hielo en el siguiente orden (250 l total deSe requiere volumen por hoja de nylon): <ul><li> 7 volúmenes de colágeno de cola de rata </li><li> 1 volumen de filtrado 10x DMEM </li><li> 1 volumen de FCS </li><li> 1 volumen de DMEM 10% FCS / Superabundancia </li></ul></li><li> Si la solución es de color amarillo, neutralizar añadiendo 0,1 M de NaOH en 50 ml de alícuotas hasta que la solución se vuelve rosa. </li><li> Añadir 250 l de esta solución a cada lámina de nylon y se incuba a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 durante 30 minutos para permitir gel se cuaje. </li><li> Invente solución de glutaraldehído al 1% en PBS. Añadir 10 ml a cada 10 cm de placa de cultivo una vez que el gel se haya establecido y se incuba a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Sábanas de nylon lava 3X en PBS y 1x en DMEM (10% de FCS) / Glu y Incubar toda la noche en DMEM / Glu en 4 ° C. </li></ol> Elevar geles organotípicos en las parrillas de acero para la invasión: <ol start="12"><li> Pre-preparar rejillas de andamiaje por plegado de chapas de acero inoxidable en una formación de trípode. Esterilizar en autoclave antes de su uso.</li><li> El uso de fórceps esterilizados en etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos. </li><li> Coloque una lámina de nylon recubierto de gel con la parte superior de colágeno, en cada cuadrícula. </li><li> Transferir cuidadosamente los geles organotípicos de la placa de 24 pocillos a la lámina de nylon planteado usando una espátula esterilizada en etanol. </li><li> Llenar el pocillo con DMEM 10% de FCS / GLUT suplementado con 10% de FCS hasta que la lámina de nylon está en contacto con el medio, pero no sumergido. Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico. </li><li> Incubar durante 14 días a 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO 2, en sustitución de los medios de comunicación cada 2 días. </li></ol> 3. Organotípicos Fijación <ol><li> Retire toda organotípico incluyendo lámina de nylon del bien y colocar en papel film. </li><li> Biseccionar organotípico y lámina de nylon con un bisturí desechable limpio y fijar las dos mitades en formol durante 24 horas a temperatura ambiente. </li><li> Reemplace formaldehído con 70% ethanol después de 24 horas y dejar toda la noche antes de la inclusión en parafina, seccionando y tinción. </li></ol> 4. Microdisección láser del Margen Invasiva <ol><li> Sección a 10 micras de espesor sobre una membrana de diapositivas montadas. </li><li> Desparafinar secciones mediante la aplicación de xileno durante 1 minuto, luego retire Xileno y fijan en etanol al 75% durante 1 min. </li><li> Eliminar el etanol y tinción con solución de violeta de cresilo 0,125% durante 1 min. Cresil violeta resalta las células epiteliales y permite una fácil discriminación de la estroma. </li><li> Eliminar violeta de cresilo y aplicar etanol al 100% durante 1 min antes de enjuagar con etanol al 100%. Permitir diapositivas secar al aire durante 30 min. </li><li> Realizar microdisección láser utilizando plataforma elegida (por ejemplo, el sistema Leica AS). </li><li> Coloque la placa de vidrio con la sección manchada que se microdissected boca abajo en la platina del microscopio. </li><li> Montar un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en el casete de la colección y añadir 50 l detampón de lisis celular (por ejemplo, ADN, ARN o proteína de tampón de lisis) a la tapa en la que el tejido microdissected recogerá. </li><li> Bajo visión directa, utilice el joystick para identificar el tejido de interés, y el uso de la interfaz de software, realizar anotaciones en la sección orgánica de colores, destacando las células que se microdissected en el frente de invasión tumoral. </li><li> Instruir al láser para disparar, que debe tanto cortar la sección resaltada e impulsar el tejido microdissected en la tapa del tubo de microcentrífuga. </li><li> Una vez que el material suficiente se ha recogido, expulse el cassette colección, cerrar el tubo de microcentrífuga y girar suavemente para sacarla del tampón de lisis a la parte inferior del tubo. </li><li> Coloque las muestras en hielo hasta microdisección se ha completado. Procesar muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés. </li></ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li>
<li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+invasion+in+an+organotypic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li>
<li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li>
<li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li>
<li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li>
<li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+roads+to+maturity%3A+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+cells+and+snap+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li>
<li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li>
</ol>

Los autores describen posibles conflictos de interés.

Aquí se describe un método para aislar y caracterizar las células tumorales que han adquirido la capacidad de invadir el estroma asociado cáncer durante las primeras etapas de la progresión metastásica en un constructo de co-cultivo de 3 dimensiones de células epiteliales y estromales específicamente. Se utilizaron modelos de co-cultivo formadas por células epiteliales CRC yuxtapuestos con un estroma sintética que contiene ex vivo fibroblastos colon humano para estudiar la invasión ...

Co-cultivos organotípicos son modelos de ingeniería tisular que ayuda en la reconstrucción del microambiente del tumor in vivo en en 3-dimensiones mediante la yuxtaposición de las células epiteliales malignas y células estromales en un gel de colágeno que contiene componentes de la matriz extracelular esenciales 1-3. Principalmente concebido como un método de medición de la invasión tumoral, organotypics reducir la dependencia en modelos animales in vivo, y evitar las deficiencias de otras técnicas in vitro tales como ensayos Transwell, en el que las células invasoras se ven obligados artificialmente en un estado mono-dispersado 2-4. La inclusión de las células del estroma en estos modelos, tales como fibroblastos, refleja el papel esencial de la microambiente del tumor en la regulación de la invasión maligna y metástasis 3-4, sin embargo, la heterogeneidad fenotípica de la estroma es tal que con el fin de maximizar la relevancia fisiológica de organotípicos modelos, específica de órganos, de precisión anatómica ex vivofibroblastos deberían incluirse siempre que sea posible de 3,6. Organotypics son una plataforma versátil para estudiar las interacciones entre el tumor y las células del estroma y se utilizan cada vez más en nuevas formas de examinar el impacto en la invasión tumoral de los inhibidores químicos y alteraciones genéticas específicas 7,8. Estudiar el margen del tumor invasivo es una perspectiva particularmente emocionante. En los modelos organotípicos, cáncer colorrectal establecido (CRC) las líneas celulares se caracterizan por producir una capa epitelial bien estratificada, y en sección transversal, las células que han adquirido la capacidad de invadir la matriz extracelular (ECM) son fácilmente discernibles. A la luz de la heterogeneidad de micro-topográfico establecido de tumor y el tumor asociado células estromales in vivo, la extracción de estas células usando microdisección láser y el estudio de ellos en el aislamiento, puede revelar importantes conocimientos biológicos con respecto a los orígenes de la metástasis del cáncer colorrectal y cómo puede ser más eficiente apuntado. Yon la siguiente metodología, todos los pacientes que donaron muestras de tejidos por escrito el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por los comités de ética instituciones regionales de investigación.

<table><tbody><tr><td>Líneas celulares de cáncer colorrectal - ejemplo mostrado SW480</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-228</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>BD Biosciences</td><td>354265</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nylon</td><td>Merck Millipore</td><td>VVLP01300</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla metálica</td><td>The Mesh Company</td><td>WSS20-A4</td><td></td></tr><tr><td>themeshcompany.com Laser plataforma de microdisección</td><td>: Leica Microsystems</td><td>, Leica AS LMD,</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos montados en membrana</td><td>, dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>moleculares, Cresyl, violeta</td>, <td>Merck, Millipore</td>, <td>1052350025</td><td></td></tr></tbody></table>

molecular profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em&gt; ex vivo</em&gt; los fibroblastos

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invadir el cáncer colorrectal células (CRC) han adquirido la capacidad de liberarse de sus células hermanas, infiltrarse en el estroma, y ​​remodelar la matriz extracelular (ECM). La caracterización de la biología de este grupo fenotípicamente distintas de células podría mejorar sustancialmente nuestra comprensión de los eventos tempranos durante la cascada metastásica. La invasión tumoral es un proceso dinámico facilitado por interacciones bidireccionales entre epitelio maligno y el estroma cáncer asociado. Con el fin de examinar las respuestas de células específicas en el estroma interfaz tumor hemos combinado co-cultivo y técnicas de micro-disección láser organotípico. Modelos organotípicos, en el que los componentes del estroma clave tales como los fibroblastos son 3-dimentioanally co-cultivadas con células epiteliales cancerosas, son herramientas experimentales altamente manipulables que permiten la invasión y las interacciones con el cáncer del estroma para ser estudiados en casi phcondiciones ysiological. Microdisección láser (LMD) es una técnica que implica la disección quirúrgica y la extracción de los diversos estratos dentro del tejido del tumor, con precisión nivel de micras. Mediante la combinación de estas técnicas con el perfil genómico, transcriptómica y epigenética nos proponemos desarrollar una comprensión más profunda de las características moleculares de la invasión de las células del tumor y el tejido circundante del estroma, y ​​al hacerlo, potencialmente revelar nuevos biomarcadores y oportunidades para el desarrollo de fármacos en el CCR.

Hemos aplicado el método anterior para múltiples combinaciones de líneas celulares de CRC y células del estroma. Un ejemplo que se presenta aquí es las líneas de células SW480 epitelial CRC con ex vivo fibroblastos primarios de colon humano. Co-cultivos 3-dimensionales se construyen (Figura 1), se sometieron a microscopía de láser y microdisección de captura (Figura 2), y se analizaron por microARN (miARN) de perfiles (Figura 3) para la comparación de miRNAs ex...

Las características moleculares de las células láser microdissected y estroma de, modelos de cáncer colorrectal ingeniería de tejidos sintéticos representa un enfoque novedoso y manipulable para caracterizar y diseccionar la biología distintiva en la interfaz entre las células tumorales en el cáncer de células del estroma asociado frente invasivo y.

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Los fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la biología distintiva en la interfase entre las células epiteliales malignas en el frente tumoral invasivo y las células estromales asociadas al cáncer. Esto se logra primero mediante el establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos a partir de implantes colónicos. El segundo paso consiste en construir modelos de co-cultivo organotípicos utilizando fibroblastos colónicos primarios y células de cáncer colorrectal en cultivo.A continuación, los modelos organotípicos se fijan en formol, se seccionan sobre portaobjetos con membrana y se tiñen con violeta de cresilo. El paso final es la microdisección láser para separar las células tumorales invasoras de las no invasoras y de las células estromales asociadas al cáncer. En última instancia, pueden utilizarse técnicas de perfilado molecular para caracterizar la biología de las células tumorales invasoras y no invasoras, así como de las células estromales en el microentorno tumoral circundante.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando nos dimos cuenta de lo claramente distinguibles que son las células invasoras de las células no invasoras en modelos de cultivo co-cultivo organotípico tridimensional de cáncer colorrectal. Para comenzar, obtenga muestras de tejido de mucosa de colon humano normal directamente del quirófano quirúrgico en el laboratorio. Coloque un espécimen en el centro de una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro, luego lave el cultivo tres veces con solución salina tamponada con fosfato o PBS suplementada con penicilina, estreptomicina y fungizona.No aspire después del lavado final; con pinzas estériles y un escalpelo, corte el tejido en trozos pequeños. Luego coloque cada trozo en el centro de una cruz dibujada con la hoja del escalpelo. En una placa de 12 pocillos, mueva suavemente el escalpelo sobre el tejido para permitir que se adhiera al cultivo.Los especímenes en 750 microlitros de medio de crecimiento primario para fibroblastos, que debe cubrir el tejido sin permitir que flote. Luego coloque los especímenes en un incubador a 37 grados Celsius y con una concentración de CO2 entre el 5 y el 10 % durante los próximos cinco días. Los fibroblastos comenzarán lentamente a crecer desde el borde del tejido aproximadamente a los siete días.Esto será más visible después de aproximadamente tres a cuatro semanas. Y si hay suficientes fibroblastos creciendo, agregue 750 microlitros de tripsina a cada pocillo después de que las células se hayan desprendido, reúna y transfiera a un frasco de cultivo de tejidos T 25 para el gel organotípico impregnado con fibroblastos. Primero, prepare una suspensión celular de fibroblastos que contenga 500.000 células por gel en dmm suplementado.Prepare los geles organotípicos sobre hielo en las proporciones indicadas en el protocolo del texto para nueve geles de un mililitro cada uno. Prepare 10 mililitros y mezcle suavemente para evitar burbujas. A continuación, añada un mililitro a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incube durante una hora a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida.Para permitir que los geles se solidifiquen después de una hora, agregue un mililitro de DM EM suplementado encima de los geles y devuélvalos al incubador durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio de la parte superior de los geles y siembre un mililitro de medio que contenga 500.000 células epiteliales de cáncer colorrectal sobre las láminas de nailon recubiertas con gel.Prepare con antelación láminas de nailon estériles de 1,5 centímetros por 1,5 centímetros utilizando pinzas estériles. Coloque el número requerido de láminas de nailon en una placa de cultivo de 10 centímetros. Prepare la mezcla de gel sobre hielo según se describe en el protocolo del texto y añada hidróxido de sodio 0,1 molar a la mezcla de gel hasta que se vuelva rosa, lo que indica que la solución ha sido neutralizada.Luego, agregue 250 microlitros de esta solución a cada lámina de nailon. A continuación, incube a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida de 5% CO2 durante 30 minutos para permitir que el gel se solidifique. Después, agregue 10 mililitros de una solución al 1% de glutaraldehído en PBS a cada placa de cultivo de 10 centímetros.Una vez que el gel haya solidificado, incubar a cuatro grados Celsius durante una hora, luego lavar las láminas de nailon tres veces en PBS y una vez en dme suplementado. Incubar las láminas durante la noche en el mismo tampón a cuatro grados Celsius para elevar los geles organotípicos sobre rejillas de acero para invasión, rejillas de soporte esterilizadas que se han preparado doblando láminas de acero inoxidable en forma de trípode. Luego, usar pinzas esterilizadas y etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos.Coloque una lámina de nailon recubierta de gel con el lado de colágeno hacia arriba sobre cada rejilla. Transfiera cuidadosamente los geles organotípicos desde la placa de 24 pocillos hasta la lámina de nailon elevada utilizando una espátula, esterilizada y con etanol. Llene el pocillo con DMEM suplementado hasta que la lámina de nailon esté en contacto con el medio pero sin sumergirla.Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico. Incube durante 14 días a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 5%CO2. Reemplace el medio cada dos días.Retire el órgano completo, incluida la lámina de nailon, del pocillo y colóquelo sobre una película adhesiva. Seccione por la mitad el órgano y la lámina de nailon utilizando un escalpelo desechable limpio y fije ambas mitades en formaldehído durante 24 horas. A temperatura ambiente, sustituya el formaldehído por etanol al 70 % después de 24 horas y deje reposar durante la noche antes de incluirlo en parafina, seccionar y teñir para realizar la microdisección láser.Primera sección, el corte organotípico hasta un grosor de 10 micrómetros sobre portaobjetos con membrana. Después de tratar los cortes según se describe en el protocolo del texto, prepárese para realizar la microdisección láser utilizando la plataforma elegida. Coloque el portaobjetos de vidrio con la sección teñida que se va a microdiseccionar.Boca abajo sobre la platina del microscopio, monte un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros en la cinta de recolección y agregue 50 microlitros de tampón de lisis celular a la tapa, en donde el tejido microdiseccionado se acumulará bajo visión directa. Utilice el joystick para identificar el tejido de interés y, mediante la interfaz de software, anote la sección orgánica teñida, resaltando las células que se microdiseccionarán en el frente de invasión tumoral. Instruya al láser para que dispare, lo que debería cortar la sección resaltada y propulsar el tejido microdiseccionado hacia la tapa del tubo microcentrífugo.Proceda a procesar las muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés. Aquí se muestran imágenes de microdisección láser de células cancerosas colorrectales SW 480 invadiendo el estroma organotípico. Se utiliza violeta de genciana para resaltar las células epiteliales cancerosas colorrectales.Luego se definen las islas tumorales invasivas antes de que ocurra la disección láser, y el fragmento cortado se transporta a un dispositivo de recolección. Las células no invasivas y las células estromales se identifican y aíslan utilizando la misma metodología. Los cultivos co-tridimensionales se analizaron mediante perfilado de microARN para comparar los microARN expresados diferencialmente entre las células en el frente tumoral invasivo y aquellas en las zonas tumorales estratificadas.Los datos se ordenaron según el cambio completo y los valores de datos más o menos el doble. Se presentan los cambios de un experimento representativo que muestran la expresión diferencial de genes de microARN entre las células del margen invasivo y las células del margen no invasivo. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo construir modelos organotípicos anatómicamente adecuados y cómo utilizar la microdisección láser para aislar poblaciones individuales de células para su posterior estudio. Vaya.

molecular-profiling-invasive-tumor-microenvironment-3-dimensional

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Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.

Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia

Hemos desarrollado modelos 3D para el cocultivo de células vivas imágenes en tiempo real de las interacciones entre las células tumorales de mama y otras células en el microambiente que afectan la progresión a un fenotipo invasivo. Estos modelos pueden servir como pantallas preclínicos de los medicamentos que se dirigen a paracrinos inducidos por las vías proteolíticas, quimiocinas / citocinas y la quinasa implicados en la invasión.

MAME Modelos de 4D Live de células de imagen de un tumor: Interacciones microambiente que la progresión maligna del impacto

El video describe la disección láser del modelo de cocultivo organotípico 3D con precisión a nivel de micras. En los modelos organotípicos 3D, los constituyentes del estroma, como los fibroblastos, se cocultivan tridimensionalmente con células epiteliales cancerosas. El modelo 3D sirve como una herramienta experimental que permite estudiar la invasión y las interacciones cáncer-estroma en condiciones casi fisiológicas.

Microdisección láser: una técnica para aislar células invasoras de cáncer colorrectal a partir de un modelo de cultivo organotípico en 3D

De ingeniería tisular matriz nativa derivado de fibroblastos es un nuevo instrumento para generar un sustrato del estroma que apoya la proliferación de células epiteliales y la diferenciación. Aquí se presenta un protocolo de aplicación de esta metodología para evaluar el impacto de los diferentes tipos de células del estroma en la biología de las células tumorales.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

Este artículo proporciona metodologías detalladas para el uso de ensayos (3D) en tres dimensiones para cuantificar la invasión de células de cáncer de mama. En concreto, se discuten los procedimientos necesarios para configurar este tipo de ensayos, la cuantificación y el análisis de datos, así como los métodos para examinar la pérdida de integridad de la membrana que se produce cuando las células invaden.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

Aquí presentamos un protocolo para el cocultivo en tres dimensiones, que es útil para investigar las interacciones multicelulares y la modulación dependiente de la matriz extracelular del comportamiento de las células cancerosas. En este modelo experimental, las células cancerosas se cultivan en geles de colágeno incrustados con fibroblastos asociados al cáncer humano.

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

Demostramos un método para generar sustitutos de cáncer de mama en 3D, que se pueden cultivar utilizando un sistema de biorreactor de perfusión para suministrar oxígeno y nutrientes. Después del crecimiento, los sustitutos se fijan y se procesan en parafina para la evaluación de los parámetros de interés. Se explica la evaluación de uno de estos parámetros, la densidad de celdas.

Preparación y análisis de<em&gt; In Vitro</em&gt; Tres de mama Carcinoma de dimensiones Surrogates

Aquí, describimos un método de cultivo tridimensional para analizar la morfología de primario de mama las células cancerosas, así como para estudiar sus interacciones directa e indirecta con los monocitos y los resultados tales como la degradación de colágeno, reclutamiento de células inmunes de la célula invasión y la promoción de la inflamación relacionada con el cáncer.

Análisis de la comunicación entre monocitos y las células de cáncer de mama primario en una matriz extracelular extracto (ECME)-sistema tridimensional basado en

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Existe una necesidad crítica de modelos de cáncer en 3D que capturen la diafonía heterocelular para estudiar la metástasis del cáncer. Nuestro estudio presenta la generación de estromas-epiteliales heteromulticelulares en un entorno de andamios y libres de andamios que pueden ser utilizados para estudiar la invasión y las distribuciones espaciales celulares.

Células estromales heteromulticelulares en cultivos 3D sin andamios de células de cáncer epitelial para impulsar la invasión

Aprende a caracterizar la biología del frente invasivo tumoral en modelos organotípicos 3D de cáncer colorrectal mediante microdisección láser. Este método permite aislar células invasivas y estromales para perfilado molecular.

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y Ex vivo Los fibroblastos (Video) | JoVE Journal

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y

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