Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la biología distintiva en la interfase entre las células epiteliales malignas en el frente tumoral invasivo y las células estromales asociadas al cáncer. Esto se logra primero mediante el establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos a partir de implantes colónicos. El segundo paso consiste en construir modelos de co-cultivo organotípicos utilizando fibroblastos colónicos primarios y células de cáncer colorrectal en cultivo.

A continuación, los modelos organotípicos se fijan en formol, se seccionan sobre portaobjetos con membrana y se tiñen con violeta de cresilo. El paso final es la microdisección láser para separar las células tumorales invasoras de las no invasoras y de las células estromales asociadas al cáncer. En última instancia, pueden utilizarse técnicas de perfilado molecular para caracterizar la biología de las células tumorales invasoras y no invasoras, así como de las células estromales en el microentorno tumoral circundante.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando nos dimos cuenta de lo claramente distinguibles que son las células invasoras de las células no invasoras en modelos de cultivo co-cultivo organotípico tridimensional de cáncer colorrectal. Para comenzar, obtenga muestras de tejido de mucosa de colon humano normal directamente del quirófano quirúrgico en el laboratorio. Coloque un espécimen en el centro de una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro, luego lave el cultivo tres veces con solución salina tamponada con fosfato o PBS suplementada con penicilina, estreptomicina y fungizona.

No aspire después del lavado final; con pinzas estériles y un escalpelo, corte el tejido en trozos pequeños. Luego coloque cada trozo en el centro de una cruz dibujada con la hoja del escalpelo. En una placa de 12 pocillos, mueva suavemente el escalpelo sobre el tejido para permitir que se adhiera al cultivo.

Los especímenes en 750 microlitros de medio de crecimiento primario para fibroblastos, que debe cubrir el tejido sin permitir que flote. Luego coloque los especímenes en un incubador a 37 grados Celsius y con una concentración de CO2 entre el 5 y el 10 % durante los próximos cinco días. Los fibroblastos comenzarán lentamente a crecer desde el borde del tejido aproximadamente a los siete días.

Esto será más visible después de aproximadamente tres a cuatro semanas. Y si hay suficientes fibroblastos creciendo, agregue 750 microlitros de tripsina a cada pocillo después de que las células se hayan desprendido, reúna y transfiera a un frasco de cultivo de tejidos T 25 para el gel organotípico impregnado con fibroblastos. Primero, prepare una suspensión celular de fibroblastos que contenga 500.000 células por gel en dmm suplementado.

Prepare los geles organotípicos sobre hielo en las proporciones indicadas en el protocolo del texto para nueve geles de un mililitro cada uno. Prepare 10 mililitros y mezcle suavemente para evitar burbujas. A continuación, añada un mililitro a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incube durante una hora a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida.

Para permitir que los geles se solidifiquen después de una hora, agregue un mililitro de DM EM suplementado encima de los geles y devuélvalos al incubador durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio de la parte superior de los geles y siembre un mililitro de medio que contenga 500.000 células epiteliales de cáncer colorrectal sobre las láminas de nailon recubiertas con gel.

Prepare con antelación láminas de nailon estériles de 1,5 centímetros por 1,5 centímetros utilizando pinzas estériles. Coloque el número requerido de láminas de nailon en una placa de cultivo de 10 centímetros. Prepare la mezcla de gel sobre hielo según se describe en el protocolo del texto y añada hidróxido de sodio 0,1 molar a la mezcla de gel hasta que se vuelva rosa, lo que indica que la solución ha sido neutralizada.

Luego, agregue 250 microlitros de esta solución a cada lámina de nailon. A continuación, incube a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida de 5% CO2 durante 30 minutos para permitir que el gel se solidifique. Después, agregue 10 mililitros de una solución al 1% de glutaraldehído en PBS a cada placa de cultivo de 10 centímetros.

Una vez que el gel haya solidificado, incubar a cuatro grados Celsius durante una hora, luego lavar las láminas de nailon tres veces en PBS y una vez en dme suplementado. Incubar las láminas durante la noche en el mismo tampón a cuatro grados Celsius para elevar los geles organotípicos sobre rejillas de acero para invasión, rejillas de soporte esterilizadas que se han preparado doblando láminas de acero inoxidable en forma de trípode. Luego, usar pinzas esterilizadas y etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos.

Coloque una lámina de nailon recubierta de gel con el lado de colágeno hacia arriba sobre cada rejilla. Transfiera cuidadosamente los geles organotípicos desde la placa de 24 pocillos hasta la lámina de nailon elevada utilizando una espátula, esterilizada y con etanol. Llene el pocillo con DMEM suplementado hasta que la lámina de nailon esté en contacto con el medio pero sin sumergirla.

Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico. Incube durante 14 días a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 5%CO2. Reemplace el medio cada dos días.

Retire el órgano completo, incluida la lámina de nailon, del pocillo y colóquelo sobre una película adhesiva. Seccione por la mitad el órgano y la lámina de nailon utilizando un escalpelo desechable limpio y fije ambas mitades en formaldehído durante 24 horas. A temperatura ambiente, sustituya el formaldehído por etanol al 70 % después de 24 horas y deje reposar durante la noche antes de incluirlo en parafina, seccionar y teñir para realizar la microdisección láser.

Primera sección, el corte organotípico hasta un grosor de 10 micrómetros sobre portaobjetos con membrana. Después de tratar los cortes según se describe en el protocolo del texto, prepárese para realizar la microdisección láser utilizando la plataforma elegida. Coloque el portaobjetos de vidrio con la sección teñida que se va a microdiseccionar.

Boca abajo sobre la platina del microscopio, monte un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros en la cinta de recolección y agregue 50 microlitros de tampón de lisis celular a la tapa, en donde el tejido microdiseccionado se acumulará bajo visión directa. Utilice el joystick para identificar el tejido de interés y, mediante la interfaz de software, anote la sección orgánica teñida, resaltando las células que se microdiseccionarán en el frente de invasión tumoral. Instruya al láser para que dispare, lo que debería cortar la sección resaltada y propulsar el tejido microdiseccionado hacia la tapa del tubo microcentrífugo.

Proceda a procesar las muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés. Aquí se muestran imágenes de microdisección láser de células cancerosas colorrectales SW 480 invadiendo el estroma organotípico. Se utiliza violeta de genciana para resaltar las células epiteliales cancerosas colorrectales.

Luego se definen las islas tumorales invasivas antes de que ocurra la disección láser, y el fragmento cortado se transporta a un dispositivo de recolección. Las células no invasivas y las células estromales se identifican y aíslan utilizando la misma metodología. Los cultivos co-tridimensionales se analizaron mediante perfilado de microARN para comparar los microARN expresados diferencialmente entre las células en el frente tumoral invasivo y aquellas en las zonas tumorales estratificadas.

Los datos se ordenaron según el cambio completo y los valores de datos más o menos el doble. Se presentan los cambios de un experimento representativo que muestran la expresión diferencial de genes de microARN entre las células del margen invasivo y las células del margen no invasivo. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo construir modelos organotípicos anatómicamente adecuados y cómo utilizar la microdisección láser para aislar poblaciones individuales de células para su posterior estudio. Vaya.