Name: Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a aislar fragmentos Fab de alta afinidad de bibliotecas de fagos mediante selección paralela de antígenos. Este método escalable acelera el descubrimiento de anticuerpos recombinantes para inmunología.

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Nos gustaría reconocer el Fondo Común NIH - Proteína Programa de reactivos de captura para financiar el desarrollo de la selección y caracterización de anticuerpos tubería recombinante de anticuerpos de red y de la Fundación Canadiense para la Innovación para la compra de financiación de la plataforma de selección robótica.

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Al llevar a cabo en la selección de anticuerpos in vitro, los dos determinantes principales de éxito selección son 1) el aislamiento de dianas antigénicas bien plegadas para seleccionar sobre y 2) la disponibilidad de una biblioteca de anticuerpos de alta diversidad funcional. En muchos casos, la disponibilidad de cantidades suficientes de bien plegada, proteína de longitud completa puede ser limitante. Un enfoque para superar esta limitación es el uso de dominios identificados a partir del análisis bi...

Con el inicio de la era post-genómica, la disponibilidad de reactivos de unión de alta calidad para caracterizar y modular proteínas es esencial para abrir nuevas investigaciones y vías terapéuticas. Los anticuerpos siguen siendo fundamentales para los investigadores académicos e industriales como la investigación básica y las herramientas de diagnóstico y terapéuticos potenciales. No en vano, se ha registrado un impresionante crecimiento de las empresas de desarrollo de anticuerpos contrato, la mayoría de los cuales se basan en tecnologías de hibridoma convencionales para generar anticuerpos personalizados. Sin embargo, la selección in vitro usando bibliotecas de anticuerpos en fagos se está convirtiendo en una tecnología poderosa alternativa que puede ofrecer ventajas únicas y éxito donde las tecnologías convencionales pueden enfrentar limitaciones 1, 2. A la luz de la considerable demanda de anticuerpos de alta calidad como herramientas de investigación, dos retos principales para la generación de anticuerpos renovables son 1) el rendimiento de la selección y 2) av antígenodimensiones pueden ser. Un número de grupos han descrito en las tuberías de selección in vitro destinadas a aumentar el rendimiento y la tasa de identificación de anticuerpos. Estas descripciones detalle una variedad de enfoques viables que incluyen la selección a ya sea de longitud completa se dirige a 3,4, o dominios 5,6,7 estructuralmente relacionado, utilizando ya sea 6,8 o placa de base 3,4 esquemas de inmovilización del antígeno basado en perlas. Además, la creciente adopción de las tecnologías de síntesis de genes 9 ha hecho la generación de antígeno sistemática, en particular de dominios aislados, razonablemente rentable y puede potencialmente aliviar la dificultad en la obtención de cantidades suficientes de antígeno purificado, de longitud completa. Mediante el uso de las dos tecnologías en tándem, un oleoducto autónomo y generación antígeno escalable y selección de anticuerpos se ideó que permita el aislamiento paralelo de anticuerpos para grandes conjuntos de dominios de antígenos expresados ​​y facilitar el desarrollo de reactivos para characterizing clases enteras de proteínas estructuralmente o funcionalmente relacionados. Con este objetivo, un gasoducto integrado que las parejas en la identificación in silico de dominios antígeno expresables, síntesis de genes, expresión bacteriana de alto rendimiento de antígenos y escalables fagos selecciones de anticuerpos se ha desarrollado. Este gasoducto requiere sólo la infraestructura básica disponible para la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida (incluidas las bibliotecas de anticuerpos que son cada vez más accesibles a través de un acuerdo de licencia o de transferencia de material), pero también es susceptible de automatización para el uso a escala industrial. El uso de este protocolo, es posible generar cientos de dominios antigénicos de afinidad de etiquetado, y aislar fragmentos de anticuerpos rutinariamente altamente específicos para muchos de estos antígenos. La tecnología de presentación en fagos ha demostrado demostrado la compatibilidad con una amplia variedad de formatos de reactivo de afinidad recombinantes incluyendo Fab, scFv, Fv y los dominios autónomos y unacreciente variedad de pequeños &quot;marcos alternativos&quot; (proteínas ankyrin repetir diseñados (DARPins), fibronectina (FN), dominios de lipocalina y más 10). Discusión se limita en este ejemplo para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos Fab, aunque se presume que estos métodos pueden adaptarse a otros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnología, los Fab con baja afinidad nanomolar a pequeña, etiquetados dominios de la proteína incluyendo dominios del factor de transcripción, dominios SH2, proteínas y otros ARN vinculante se han seleccionado con éxito, muchos de los que se unen para pedir una proteína y son funcionales en inmunoensayos, como la inmunofluorescencia , inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Es importante destacar que los clones de unión recombinantes son totalmente renovable y se puede volver a generar a partir de construcciones de expresión a través de la producción bacteriana oferta mayor coherencia, la reproducibilidad y la rentabilidad, lo que justifica el gasto de validación clon riguroso. En este protocol y video que lo acompaña, se demuestran los métodos básicos para la selección de anticuerpos de bibliotecas de fagos utilizando dominios de antígenos inmovilizados. Este método particular emplea dominios de la proteína marcada con GST inmovilizado por adsorción pasiva en placas de micropocillos, aunque otras etiquetas 11,12,13 y formatos de selección 13,14,2 también se han utilizado con éxito. Consideraciones críticas para la configuración y el comportamiento de las selecciones con control paralelo de parámetros de selección destinados a identificar y aislar anticuerpos monoclonales específicamente enriquecidos para la validación se detallan.

<table><tbody><tr><td>MATERIALES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova44 incubadora agitadora apilable</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator 96 canales sistema de pipeteo manual de sobremesa</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Sorvall ST-40 centrífuga de sobremesa</td><td>Thermo Product</td><td></td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Select Lavadora de microplacas de pozo profundo</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Robot de selección de fagos automatizado de alto rendimiento personalizado</td><td>S& P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de plástico Falcon: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de plástico Falcon: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1,7 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>Corning</td><td>MCT-175-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa Maxisorp de 96 pocillos/384 pocillos Sigma</td><td></td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning Bloque de pozos profundos con fondo en V de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Minitubo Microplaca estéril de 96 pocillos</td><td>caja azul Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Placa adhesiva transpirable película de sellado</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr><tr><td>REACTIVOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td> polietilenglicol <td></td></tr><tr><td></td><td>Bioshop PEG800.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>bio-triptona</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>N-Z amina</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>lactosa</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>carbenicilina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>tetraciclina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Bioshop</td><td></td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potasio monobásico</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>fosfato sódico dibásico</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>cloruro sódico</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>cloruro potásico</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnesio</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de magnesio</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe Tinción de gel de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ácido fosfórico</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>benzonasa</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>cóctel inhibidor de proteasas comprimidos</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>resina Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1.000x fago auxiliar (M13K07) stock (1013 fago por ml)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP anticuerpo conjugado específico M13 (anti-M13-HRP).</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato TMB: mezcle volúmenes iguales de TMB y sustrato de peroxidasa H2O2</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Biobásico</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasa</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Camarones fosfatasa alcalina</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

La demanda de los anticuerpos que se satisfagan las necesidades de las aplicaciones básicas y clínicas de investigación es alta y se incrementará dramáticamente en el futuro. Sin embargo, es evidente que las tecnologías tradicionales no son monoclonales solo hasta esta tarea. Esto ha llevado al desarrollo de métodos alternativos para satisfacer la demanda de alta calidad y reactivos de afinidad renovables a todos los elementos accesibles del proteoma. Con este fin, métodos de alto rendimiento para la realización de selecciones de bibliotecas de anticuerpos en fagos sintéticos se han diseñado para aplicaciones que implican diversos antígenos y optimizado para un rendimiento rápido y el éxito. En la presente memoria, un protocolo se describe en detalle que ilustra con la demostración de vídeo la selección paralela de clones Fab fagos a partir de bibliotecas de alta diversidad contra cientos de objetivos usando un manipulador de líquidos 96 manual de canales o el sistema de robótica automatizada. El uso de este protocolo, un solo usuario puede generar cientos de antígenos,seleccionar anticuerpos a ellos en paralelo y validar la unión de anticuerpos dentro de 6-8 semanas. Se destacan: i) un formato antígeno viable, ii) caracterización del antígeno preselección, iii) los pasos críticos que influyen en la selección de clones específicos y de alta afinidad, y iv) las formas de efectividad selección monitoreo y etapa temprana caracterización anticuerpo clon. Con este enfoque, hemos obtenido fragmentos de anticuerpos sintéticos (FABS) a muchas clases de objetivos, incluyendo los receptores de un solo paso de membrana, hormonas de proteínas secretadas y proteínas intracelulares multi-dominio. Estos fragmentos se convierten fácilmente a los anticuerpos de longitud completa y se han validado para exhibir una alta afinidad y especificidad. Además, se han demostrado para ser funcionales en una variedad de inmunoensayos estándar, incluyendo transferencia de Western, ELISA, inmunofluorescencia celular, inmunoprecipitación y ensayos relacionados. Esta metodología se acelerará el descubrimiento de anticuerpos y en última instancia, nos acercan a la realización del objetivo of generación de anticuerpos de alta calidad, renovables a la proteoma.

El protocolo descrito en el presente documento se ha utilizado para aislar fragmentos de anticuerpos a una variedad de ambos dominios de antígenos estructuralmente y funcionalmente relacionados con bibliotecas combinatorias de Fab presentados en fagos en paralelo. Cuestiones relacionadas con la disponibilidad de antígeno pueden eludirse, en muchos casos, por la identificación in silico de dominios antígeno expresables que son adecuados para la selección de anticuerpos 23. Mediante el acoplamiento de la expres...

Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

El objetivo general de este procedimiento escalable es aislar clones fágicos de fragmentos Fab específicos y de alta afinidad a partir de una biblioteca expuesta en fagos, mediante un enfoque de alto rendimiento que permita la selección paralela frente a cientos de dominios antigénicos diana. Esto se logra primero inmovilizando dominios antigénicos purificados en placas de microplacas. Los siguientes pasos consisten en exponer, capturar, liberar y amplificar clones fágicos de fragmentos Fab que se unan específicamente al antígeno inmovilizado en la microplaca, en rondas sucesivas de selección.Durante este proceso, la eficacia de la selección se monitorea utilizando métodos agrupados en cada paso. El paso final consiste en evaluar la especificidad, afinidad y/o actividad de los clones de fragmentos Fab aislados. En última instancia, se aíslan en paralelo fragmentos Fab específicos de alta afinidad frente a un gran número de antígenos, lo que permite la generación de anticuerpos útiles en el análisis de clases completas de proteínas relacionadas estructural o funcionalmente.La importancia de este método radica en que ofrece una alternativa que puede ayudar a superar las limitaciones

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Los protocolos descritos permiten la construcción, caracterización y selección (contra el blanco de la opción) de una biblioteca de "domainome" de cualquier fuente de ADN. Esto se logra mediante una tubería de investigación que combina diferentes tecnologías: exhibición phage, un reportero plegable y próxima generación la secuencia con una herramienta web de análisis de datos.

Interactoma-Seq: Un protocolo para la biblioteca de Domainome construcción, validación y selección de Phage Display y la siguiente secuencia de generación

Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.

Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Este protocolo describe los pasos esenciales para llevar a cabo campañas de selección de exhibición de superficie de levadura para enriquecer las variantes de proteínas que se unen a un antígeno de interés.

Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Dos métodos distintos a las plantas de pantalla con nematodos, se describen. Los enfoques descritos son de alto rendimiento de las pantallas con los nematodos en una manera no destructiva para facilitar el uso de estas plantas en los programas de mejoramiento.

Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.</em

Aprenda a aislar fragmentos Fab de alta afinidad de bibliotecas de fagos mediante selección paralela de antígenos. Este método escalable acelera el descubrimiento de anticuerpos recombinantes para inmunología.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

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