Name: Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a aislar fragmentos Fab de alta afinidad de bibliotecas de fagos mediante selección paralela de antígenos. Este método escalable acelera el descubrimiento de anticuerpos recombinantes para inmunología.

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Nos gustaría reconocer el Fondo Común NIH - Proteína Programa de reactivos de captura para financiar el desarrollo de la selección y caracterización de anticuerpos tubería recombinante de anticuerpos de red y de la Fundación Canadiense para la Innovación para la compra de financiación de la plataforma de selección robótica.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Al llevar a cabo en la selección de anticuerpos in vitro, los dos determinantes principales de éxito selección son 1) el aislamiento de dianas antigénicas bien plegadas para seleccionar sobre y 2) la disponibilidad de una biblioteca de anticuerpos de alta diversidad funcional. En muchos casos, la disponibilidad de cantidades suficientes de bien plegada, proteína de longitud completa puede ser limitante. Un enfoque para superar esta limitación es el uso de dominios identificados a partir del análisis bi...

Con el inicio de la era post-genómica, la disponibilidad de reactivos de unión de alta calidad para caracterizar y modular proteínas es esencial para abrir nuevas investigaciones y vías terapéuticas. Los anticuerpos siguen siendo fundamentales para los investigadores académicos e industriales como la investigación básica y las herramientas de diagnóstico y terapéuticos potenciales. No en vano, se ha registrado un impresionante crecimiento de las empresas de desarrollo de anticuerpos contrato, la mayoría de los cuales se basan en tecnologías de hibridoma convencionales para generar anticuerpos personalizados. Sin embargo, la selección in vitro usando bibliotecas de anticuerpos en fagos se está convirtiendo en una tecnología poderosa alternativa que puede ofrecer ventajas únicas y éxito donde las tecnologías convencionales pueden enfrentar limitaciones 1, 2. A la luz de la considerable demanda de anticuerpos de alta calidad como herramientas de investigación, dos retos principales para la generación de anticuerpos renovables son 1) el rendimiento de la selección y 2) av antígenodimensiones pueden ser. Un número de grupos han descrito en las tuberías de selección in vitro destinadas a aumentar el rendimiento y la tasa de identificación de anticuerpos. Estas descripciones detalle una variedad de enfoques viables que incluyen la selección a ya sea de longitud completa se dirige a 3,4, o dominios 5,6,7 estructuralmente relacionado, utilizando ya sea 6,8 o placa de base 3,4 esquemas de inmovilización del antígeno basado en perlas. Además, la creciente adopción de las tecnologías de síntesis de genes 9 ha hecho la generación de antígeno sistemática, en particular de dominios aislados, razonablemente rentable y puede potencialmente aliviar la dificultad en la obtención de cantidades suficientes de antígeno purificado, de longitud completa. Mediante el uso de las dos tecnologías en tándem, un oleoducto autónomo y generación antígeno escalable y selección de anticuerpos se ideó que permita el aislamiento paralelo de anticuerpos para grandes conjuntos de dominios de antígenos expresados ​​y facilitar el desarrollo de reactivos para characterizing clases enteras de proteínas estructuralmente o funcionalmente relacionados. Con este objetivo, un gasoducto integrado que las parejas en la identificación in silico de dominios antígeno expresables, síntesis de genes, expresión bacteriana de alto rendimiento de antígenos y escalables fagos selecciones de anticuerpos se ha desarrollado. Este gasoducto requiere sólo la infraestructura básica disponible para la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida (incluidas las bibliotecas de anticuerpos que son cada vez más accesibles a través de un acuerdo de licencia o de transferencia de material), pero también es susceptible de automatización para el uso a escala industrial. El uso de este protocolo, es posible generar cientos de dominios antigénicos de afinidad de etiquetado, y aislar fragmentos de anticuerpos rutinariamente altamente específicos para muchos de estos antígenos. La tecnología de presentación en fagos ha demostrado demostrado la compatibilidad con una amplia variedad de formatos de reactivo de afinidad recombinantes incluyendo Fab, scFv, Fv y los dominios autónomos y unacreciente variedad de pequeños &quot;marcos alternativos&quot; (proteínas ankyrin repetir diseñados (DARPins), fibronectina (FN), dominios de lipocalina y más 10). Discusión se limita en este ejemplo para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos Fab, aunque se presume que estos métodos pueden adaptarse a otros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnología, los Fab con baja afinidad nanomolar a pequeña, etiquetados dominios de la proteína incluyendo dominios del factor de transcripción, dominios SH2, proteínas y otros ARN vinculante se han seleccionado con éxito, muchos de los que se unen para pedir una proteína y son funcionales en inmunoensayos, como la inmunofluorescencia , inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Es importante destacar que los clones de unión recombinantes son totalmente renovable y se puede volver a generar a partir de construcciones de expresión a través de la producción bacteriana oferta mayor coherencia, la reproducibilidad y la rentabilidad, lo que justifica el gasto de validación clon riguroso. En este protocol y video que lo acompaña, se demuestran los métodos básicos para la selección de anticuerpos de bibliotecas de fagos utilizando dominios de antígenos inmovilizados. Este método particular emplea dominios de la proteína marcada con GST inmovilizado por adsorción pasiva en placas de micropocillos, aunque otras etiquetas 11,12,13 y formatos de selección 13,14,2 también se han utilizado con éxito. Consideraciones críticas para la configuración y el comportamiento de las selecciones con control paralelo de parámetros de selección destinados a identificar y aislar anticuerpos monoclonales específicamente enriquecidos para la validación se detallan.

<table><tbody><tr><td>MATERIALES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova44 incubadora agitadora apilable</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator 96 canales sistema de pipeteo manual de sobremesa</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Sorvall ST-40 centrífuga de sobremesa</td><td>Thermo Product</td><td></td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Select Lavadora de microplacas de pozo profundo</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Robot de selección de fagos automatizado de alto rendimiento personalizado</td><td>S& P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de plástico Falcon: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de plástico Falcon: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1,7 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>Corning</td><td>MCT-175-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa Maxisorp de 96 pocillos/384 pocillos Sigma</td><td></td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning Bloque de pozos profundos con fondo en V de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Minitubo Microplaca estéril de 96 pocillos</td><td>caja azul Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Placa adhesiva transpirable película de sellado</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr><tr><td>REACTIVOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td> polietilenglicol <td></td></tr><tr><td></td><td>Bioshop PEG800.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>bio-triptona</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>N-Z amina</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>lactosa</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>carbenicilina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>tetraciclina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Bioshop</td><td></td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potasio monobásico</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>fosfato sódico dibásico</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>cloruro sódico</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>cloruro potásico</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnesio</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de magnesio</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe Tinción de gel de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ácido fosfórico</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>benzonasa</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>cóctel inhibidor de proteasas comprimidos</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>resina Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1.000x fago auxiliar (M13K07) stock (1013 fago por ml)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP anticuerpo conjugado específico M13 (anti-M13-HRP).</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato TMB: mezcle volúmenes iguales de TMB y sustrato de peroxidasa H2O2</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Biobásico</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasa</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Camarones fosfatasa alcalina</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

La demanda de los anticuerpos que se satisfagan las necesidades de las aplicaciones básicas y clínicas de investigación es alta y se incrementará dramáticamente en el futuro. Sin embargo, es evidente que las tecnologías tradicionales no son monoclonales solo hasta esta tarea. Esto ha llevado al desarrollo de métodos alternativos para satisfacer la demanda de alta calidad y reactivos de afinidad renovables a todos los elementos accesibles del proteoma. Con este fin, métodos de alto rendimiento para la realización de selecciones de bibliotecas de anticuerpos en fagos sintéticos se han diseñado para aplicaciones que implican diversos antígenos y optimizado para un rendimiento rápido y el éxito. En la presente memoria, un protocolo se describe en detalle que ilustra con la demostración de vídeo la selección paralela de clones Fab fagos a partir de bibliotecas de alta diversidad contra cientos de objetivos usando un manipulador de líquidos 96 manual de canales o el sistema de robótica automatizada. El uso de este protocolo, un solo usuario puede generar cientos de antígenos,seleccionar anticuerpos a ellos en paralelo y validar la unión de anticuerpos dentro de 6-8 semanas. Se destacan: i) un formato antígeno viable, ii) caracterización del antígeno preselección, iii) los pasos críticos que influyen en la selección de clones específicos y de alta afinidad, y iv) las formas de efectividad selección monitoreo y etapa temprana caracterización anticuerpo clon. Con este enfoque, hemos obtenido fragmentos de anticuerpos sintéticos (FABS) a muchas clases de objetivos, incluyendo los receptores de un solo paso de membrana, hormonas de proteínas secretadas y proteínas intracelulares multi-dominio. Estos fragmentos se convierten fácilmente a los anticuerpos de longitud completa y se han validado para exhibir una alta afinidad y especificidad. Además, se han demostrado para ser funcionales en una variedad de inmunoensayos estándar, incluyendo transferencia de Western, ELISA, inmunofluorescencia celular, inmunoprecipitación y ensayos relacionados. Esta metodología se acelerará el descubrimiento de anticuerpos y en última instancia, nos acercan a la realización del objetivo of generación de anticuerpos de alta calidad, renovables a la proteoma.

El protocolo descrito en el presente documento se ha utilizado para aislar fragmentos de anticuerpos a una variedad de ambos dominios de antígenos estructuralmente y funcionalmente relacionados con bibliotecas combinatorias de Fab presentados en fagos en paralelo. Cuestiones relacionadas con la disponibilidad de antígeno pueden eludirse, en muchos casos, por la identificación in silico de dominios antígeno expresables que son adecuados para la selección de anticuerpos 23. Mediante el acoplamiento de la expres...

Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

El objetivo general de este procedimiento escalable es aislar clones fágicos de fragmentos Fab específicos y de alta afinidad a partir de una biblioteca expuesta en fagos, mediante un enfoque de alto rendimiento que permita la selección paralela frente a cientos de dominios antigénicos diana. Esto se logra primero inmovilizando dominios antigénicos purificados en placas de microplacas. Los siguientes pasos consisten en exponer, capturar, liberar y amplificar clones fágicos de fragmentos Fab que se unan específicamente al antígeno inmovilizado en la microplaca, en rondas sucesivas de selección.Durante este proceso, la eficacia de la selección se monitorea utilizando métodos agrupados en cada paso. El paso final consiste en evaluar la especificidad, afinidad y/o actividad de los clones de fragmentos Fab aislados. En última instancia, se aíslan en paralelo fragmentos Fab específicos de alta afinidad frente a un gran número de antígenos, lo que permite la generación de anticuerpos útiles en el análisis de clases completas de proteínas relacionadas estructural o funcionalmente.La importancia de este método radica en que ofrece una alternativa que puede ayudar a superar las limitaciones y acelerar el ritmo de las tecnologías convencionales de desarrollo de anticuerpos, ya sea en un laboratorio académico o industrial. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos convencionales de desarrollo de anticuerpos, como el hibridoma, es que no requiere el uso de animales. Puede utilizarse para prácticamente cualquier proteína, incluyendo proteínas tóxicas y no inmunogénicas.Como veremos, se puede paralelizar fácilmente y finalmente produce ADN recombinante renovable que codifica un anticuerpo de alta afinidad específico para un antígeno determinado y funcional en ensayos inmunológicos estándar en tan solo seis u ocho semanas. Dada la importancia de los anticuerpos en la investigación biomédica, vimos una oportunidad para adaptar y escalar la generación de antígenos y la selección e identificación de anticuerpos mediante un enfoque de alto rendimiento, manteniendo al mismo tiempo el acceso para laboratorios de diferentes tamaños y recursos disponibles. En la mañana del día de selección del fago, seleccione una colonia individual de células de E. coli resistentes al fago T uno.Añádalo a un mililitro de medio Yt2 con tetraciclina a 50 microgramos por mililitro. Incube la colonia agitándola a 200 rpm en un agitador orbital de 2,5 centímetros. Una vez que el crecimiento del cultivo sea visualmente evidente, transfiera las células al volumen requerido de medio suplementado con tetraciclina.Debe haber suficiente para 100 microlitros por pocillo de selección, o aproximadamente 10 mililitros por placa de 96 pocillos. Amplíe alícuotas del cultivo a medios suplementados con penicilina y canina. Estos cultivos previenen la infección previa en las células que se utilizarán para la amplificación.Cuando la absorbancia óptica del cultivo alcance entre 0,4 y 0,8 a 595 nanómetros. Después de cinco a siete horas, las células estarán listas para aplicarse en las placas de antígeno. Para este protocolo, con el fin de garantizar la cobertura deseada de la biblioteca, prepare suficientes placas de antígeno replicadas y placas de proteína de control no específico.Los detalles del cálculo mostrados se proporcionan en el protocolo escrito. Después de la inmovilización nocturna de las proteínas diana y de control no específico, retire la solución proteica de la placa. Añada 200 microlitros de tampón de bloqueo y bloquee durante una hora con agitación, luego lave la placa cuatro veces antes de añadir la biblioteca de fagos, mientras las células están creciendo.El día de la selección de fagos, preeliminamos los fagos que muestran uniones inespecíficas o específicas para la etiqueta, procedentes de los clones FAB de la biblioteca, transfiriendo 100 microlitros de la biblioteca de fagos a las placas de selección negativa para realizar una selección negativa adicional. Elimine los fagos que se unen a la etiqueta añadiendo un exceso de etiqueta de afinidad soluble. Para ello, añada una concentración final de 10 micromolar de GST soluble a cada muestra.A continuación, incube las placas durante una a dos horas en un agitador a temperatura ambiente. Para preparar la placa de la proteína diana, aspire la solución de proteína de la placa, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo y bloquee durante una hora con agitación, luego lave cuatro veces antes de añadir la biblioteca de fagos. Tras la incubación, recoja el sobrenadante de fagos de las placas.Utilizando un manipulador líquido de 96 canales, transfiera el sobrenadante de fagos a placas recubiertas con antígeno. A continuación, incube las placas durante una a dos horas en agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación, elimine los fagos no ligados lavando los pocillos de ocho a 15 veces con tampón PT.Esto puede hacerse manualmente o con un lavador automático de placas. Luego, justo antes de agregar las células, retire todo el tampón de lavado en exceso cuando las células y las placas de antígeno estén listas. Eluya el fago añadiendo 100 microlitros de células en crecimiento a cada pocillo y deje que las placas incuben a 37 grados Celsius durante media hora.No se espera que las primeras rondas de selección produzcan un enriquecimiento significativo, pero la cuantificación de los títulos de fagos de salida puede garantizar la ilusión de las concentraciones mínimas de fagos necesarias para selecciones exitosas. Para ello, se puede retirar una alícuota de células antes de la adición del fago auxiliar con el fin de determinar la producción de fagos mediante la preparación y siembra de diluciones seriadas de las células en placas de agar suplementadas con antibiótico. Después de incubar durante media hora, añada el fago auxiliar M13KO7 a cada pocillo para alcanzar una concentración de 10 mil millones de unidades formadoras de colonias por mililitro.Deje que las placas se incuben otros 45 minutos esta vez con agitación a 200 RPM. A continuación, transfiera las células a un bloque de placas de 96 pocillos con fondo en V que contenga 1,2 mililitros de medio dos YT suplementado por pocillo. Deje que las placas de fondo profundo se incuben a 37 grados Celsius durante la noche con agitación a 200 RPM al día siguiente.Centrifugar las bacterias a 4.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius para obtener el sedimento. Luego, transferir desde cada placa replicada volúmenes iguales del sobrenadante que contiene el fago a un tubo pequeño. Usar la caja azul de microplaca de 96 pocillos como entrada para rondas subsiguientes de selección al fago agrupado; agregar un volumen igual a un décimo de 10 XPBT y mezclar para neutralizar.Ahora, repita el proceso de selección a partir de la biblioteca. Realice la precorrección y la incubación con fagos antigénicos de tres a cuatro veces utilizando fagos amplificados a partir de la ronda anterior de selección. Haga esto hasta observar un enriquecimiento en la unión al objetivo en comparación con la unión a proteínas de control no específicas mediante placas Eliza Micro con codificación de dos microgramos por mililitro de antígeno o proteína de control, como se describió previamente. La precorrección de la biblioteca y la incubación con fagos antigénicos se bloquean y lavan luego como antes, para placas recubiertas con antígeno y proteína de control bloqueadas y lavadas. Aplique 100 microlitros de sobrenadante de fagos diluido a los pozos y deje que las placas incuben con agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, lave las placas ocho veces con tampón PT.A continuación, tras los lavados, añada 100 microlitros de anticuerpo anti M13 conjugado con HRP en una dilución 1:5.000 en PBT a cada pocillo e incube durante media hora para permitir la unión del anticuerpo al fago unido al antígeno. Luego lave las placas con buffer PT seis veces y dos veces más con PBS puro. Prepare, mezcle y añada 100 microlitros de sustrato TMB al 1:1 a cada uno de los pocillos. Deje que la reacción transcurra durante cinco a 15 minutos, deteniendo las reacciones cuando se observe un cambio de color significativo.Detenga las reacciones añadiendo 100 microlitros de ácido fosfórico uno molar. Ahora lea la absorbancia en los pocillos a 450 nanómetros y compare las señales de unión del blanco con las señales de unión de las proteínas de control tras el enriquecimiento. Se pueden aislar y caracterizar clones individuales mediante la secuenciación del ADN del fago, la conversión del ADN del fago unido al Fab libre y la evaluación de la unión directa al blanco utilizando FabuLisa clonal, como se explica en la sección textual del protocolo.Para laboratorios en los que se requiere un mayor rendimiento, esta metodología puede ampliarse y automatizarse. Con este fin, se han desarrollado robots personalizados que pueden aumentar la capacidad de selección mediante la automatización de todos los aspectos del procedimiento, incluyendo el bloqueo, el fago, la unión, la elución y otros más. Un enfoque para obtener antígeno para su uso en selecciones de anticuerpos es el uso de tecnologías de genes sintéticos para obtener construccos para la expresión de dominios proteicos aislados.En la mayoría de los casos, esto permite la expresión y aislamiento de alta capacidad de cantidades adecuadas de antígeno purificado suficientemente puro para la selección. Durante rondas sucesivas del proceso de selección, se monitoreó la concentración de fagos eluidos y el enriquecimiento de fagos que se unieron específicamente al antígeno mediante la titulación de fagos, como se mostró anteriormente, o mediante el seguimiento de grupos de fagos. En un ensayo ELA, una relación de unión mayor que dos generalmente indica la presencia de clones con unión específica.Por el contrario, una proporción más baja puede ayudar a determinar la causa de un fallo en la selección. La caracterización del enlace del clon mediante un ensayo colorimétrico de aminoácidos permite comparar el enlace de fagos Fab o Fab a antígeno inmovilizado frente al enlace a una proteína de control negativo, proporcionando así una medida de especificidad al escalar y automatizar selecciones con unidades robóticas de manipulación de líquidos. El uso de cromóforos absorbentes puede ayudar a detectar cuándo canales específicos en los sistemas de fluidos están obstruidos o han perdido su sellado, lo que resulta en una entrega parcial de volumen, y facilita la resolución de problemas durante la optimización de los procedimientos de lavado; el uso de clones de enlace conocidos asegura que el enlace al objetivo se mantenga mientras el enlace de fondo se elimina durante los lavados.Además, los protocolos de descontaminación eficaces garantizan la ausencia de contaminación cruzada procedente de rondas sucesivas de selección o de diferentes procedimientos de selección, y se recomienda revisar los parámetros adicionales de resolución de problemas descritos en el protocolo escrito. Al escalar esta técnica para su aplicación industrial, esperamos permitir a los investigadores explorar clases completas de proteínas estructural o funcionalmente relacionadas, acelerando la selección y la identificación de anticuerpos renovables de alta afinidad, con el objetivo final de lograr una cobertura máxima del proteoma.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Los protocolos descritos permiten la construcción, caracterización y selección (contra el blanco de la opción) de una biblioteca de "domainome" de cualquier fuente de ADN. Esto se logra mediante una tubería de investigación que combina diferentes tecnologías: exhibición phage, un reportero plegable y próxima generación la secuencia con una herramienta web de análisis de datos.

Interactoma-Seq: Un protocolo para la biblioteca de Domainome construcción, validación y selección de Phage Display y la siguiente secuencia de generación

Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.

Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Este protocolo describe los pasos esenciales para llevar a cabo campañas de selección de exhibición de superficie de levadura para enriquecer las variantes de proteínas que se unen a un antígeno de interés.

Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

Se describe un método eficiente para separar ADN de cadena sencilla, doble cadena de ADN y las moléculas de ARN viral de las comunidades del medio ambiente. Los ácidos nucleicos son fraccionados utilizando cromatografía de hidroxiapatita con una creciente concentración de fosfato que contienen buffers. Este método permite el aislamiento de todos los tipos de ácido nucleico viral de las muestras ambientales.

La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Aprenda a aislar fragmentos Fab de alta afinidad de bibliotecas de fagos mediante selección paralela de antígenos. Este método escalable acelera el descubrimiento de anticuerpos recombinantes para inmunología.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

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