Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

El objetivo general de este procedimiento escalable es aislar clones de fagos fabulosos específicos y de alta afinidad de una biblioteca de fagos mostrados utilizando un enfoque de alto rendimiento que permite la selección paralela contra cientos de dominios objetivo antigénicos. Esto se logra inmovilizando primero los dominios antigénicos purificados en placas de micropocillos. Los siguientes pasos consisten en exponer, capturar, liberar y amplificar clones de fagos fabulosos que se unen específicamente al antígeno inmovilizado en microplacas en rondas sucesivas de selección.

Durante este proceso, la eficacia de la selección se supervisa utilizando métodos agrupados en cada paso. El paso final es evaluar la especificidad, afinidad y/o actividad de los clones fab aislados. En última instancia, se aíslan en paralelo fragmentos fab específicos de alta afinidad contra un gran número de antígenos, lo que permite la generación de anticuerpos útiles en el análisis de clases enteras de proteínas relacionadas estructural o funcionalmente.

La importancia de este método radica en que ofrece una alternativa que puede ayudar a superar las limitaciones y acelerar el ritmo de las tecnologías convencionales de desarrollo de anticuerpos, tanto en un laboratorio académico como en un laboratorio industrial. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas convencionales de desarrollo de anticuerpos, como el hibridoma, es que no requiere el uso de animales. Se puede utilizar para prácticamente cualquier proteína, incluidas las proteínas tóxicas y no inmunogénicas.

Como veremos, se paraleliza fácilmente y, en última instancia, produce ADN recombinante renovable que codifica un anticuerpo de alta afinidad específico para antígenos particulares e inmunoensayos funcionales y estándar en tan solo seis a ocho semanas. Dada la importancia de los anticuerpos en la investigación en biomedicina, vimos la oportunidad de adaptar y escalar la generación de antígenos y la selección e identificación de anticuerpos a un enfoque de alto rendimiento, manteniendo al mismo tiempo la accesibilidad a los laboratorios que varían tanto en tamaño como en recursos disponibles. En la mañana del día de la selección de fagos, elija una sola colonia de células de E. coli resistentes a fagos T. uno.

Agréguelo a un mililitro de dos medios yt con tetraciclina a 50 microgramos por mililitro. Deje que la colonia incube agitando a 200 RPM en un agitador orbital de 2,5 centímetros. Una vez que el crecimiento del cultivo es visualmente evidente, transfiera las células al volumen requerido de medios suplementados con tetraciclina.

Debe haber suficiente para 100 microlitros por pocillo de selección, o aproximadamente 10 mililitros por 96. La placa de pocillos expande las alícuotas del cultivo tanto a la penicilina de carbono como a los medios suplementados con canina. Estos cultivos aseguran contra la preinfección en las células que se van a utilizar para la amplificación.

Cuando la absorbancia óptica del cultivo llega a 0,4 a 0,8 a 595 nanómetros. Después de cinco a siete horas, las células están listas para aplicarse a las placas de antígenos. Para que este protocolo garantice la cobertura deseada de la biblioteca, prepare suficientes placas de antígenos replicados y placas de proteínas de control no específicas.

Con el uso de los detalles de cálculo mostrados, se proporcionan en el protocolo de texto. Después de la inmovilización durante la noche de las proteínas de control diana e inespecíficas, retire la solución proteica de la placa. Agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo y bloquee durante una hora agitando y lave la placa cuatro veces antes de agregar la biblioteca de fagos mientras las células están creciendo.

El día de la selección de fagos, eliminamos previamente los clones de FAB mostrados por el fago no específico o el fago de unión específico de la etiqueta de la biblioteca transfiriendo 100 microlitros de la biblioteca de fagos a las placas de selección de negativos para una selección negativa adicional. Elimine el fagogo de unión de etiquetas agregando un exceso de etiqueta de afinidad soluble. Para ello, añada una concentración final de 10 micromolares de GST soluble a cada uno.

Pues bien, entonces incuba las placas durante una o dos horas en una coctelera a temperatura ambiente. Para preparar la placa de proteína objetivo, aspire la solución de proteína de la placa, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo y bloquee durante una hora agitando y lave cuatro veces antes de agregar la biblioteca de fagos. Después de la incubación, recoja el fago, snat de las placas.

Usando un manejador de líquidos de 96 canales, transfiera el supinato del fago a placas recubiertas de antígeno. A continuación, incubar las placas durante una o dos horas en una coctelera a temperatura ambiente. Después de la incubación, elimine el fago suelto lavando los pocillos de ocho a 15 veces con tampón PT.

Esto se puede hacer manualmente o con una lavadora automática de placas. Luego, justo antes de agregar las células, retire todo el exceso de tampón de lavado cuando las células y las placas de antígenos estén listas. Eluir el fago añadiendo 100 microlitros de células en crecimiento a cada pocillo y dejar que las placas se incuben a 37 grados centígrados durante media hora.

No se espera que las primeras rondas de selección produzcan un enriquecimiento significativo, pero la cuantificación de los títulos de fagos de salida puede garantizar la ilusión de las concentraciones mínimas de fagos necesarias para una selección exitosa. Para hacer esto, se puede eliminar una alícuota de células antes de la adición de fagos auxiliares con el fin de ajustar la salida de fagos mediante la preparación y siembra de diluciones seriadas de las células en placas de agar suplementadas con antibióticos. Después de incubar durante media hora, agregue M 13 K oh siete fagos auxiliares a cada pocillo para obtener una concentración de 10 mil millones de unidades formadoras de colonias por mililitro.

Deje que las placas se incuben otros 45 minutos, esta vez agitando a 200 RPM. A continuación, transfiera las celdas a un bloque de 96 pocillos de profundidad con un fondo en V que contenga 1,2 mililitros de dos medios YT suplementados por pocillo. Deje que las placas de pozos profundos se incuben a 37 grados centígrados durante la noche y se agiten a 200 RPM al día siguiente.

Granule las bacterias girando las placas a 4.000 GS durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, desde cada placa replicada, transfiera volúmenes iguales de sobrenadante que contiene el fago a un mini tubo. Caja azul de microplaca de 96 pocillos para ser utilizada como entrada para las siguientes rondas de selección al fago agrupado, agregue un décimo volumen de 10 XPBT y mezcle para neutralizar.

Ahora, repita el proceso de selección de la biblioteca. Aclaramiento previo e incubación de fagos de antígenos tres o cuatro veces utilizando fagos amplificados de la ronda anterior de selección. Haga esto hasta que se observe el enriquecimiento de la unión al objetivo en comparación con la unión de proteínas de control no específicas por Eliza Las placas de micropocillos codificadas con dos microgramos por mililitro de antígeno o proteína de control como se describió anteriormente en la biblioteca de pre-aclaramiento y la incubación de fagos de antígeno se bloquean y lavan como antes para bloquear y lavar las placas recubiertas de antígeno y proteína de control, aplicar 100 microlitros de séputo de fago diluido a los pocillos y dejar que las placas se incuben agitando durante 15 minutos a temperatura ambiente Después de la incubación, lavar las placas ocho veces con tampón PT.

Luego, después de los lavados, agregue 100 microlitros de anticuerpo anti M 13 HRP en una lución de 1 a 5,000 en PBT a cada pocillo incubar durante media hora para permitir la unión del anticuerpo al fago unido al antígeno. A continuación, lavar las placas con tampón PT seis veces y dos veces más con PBS puro, preparar, mezclar y aplicar 100 microlitros de sustrato TMB uno a uno a cada uno de los pocillos. Deje que esto reaccione durante cinco a 15 minutos, deteniendo las reacciones cuando haya un cambio de color significativo.

Detenga las reacciones agregando 100 microlitros de ácido fosfórico molar. Ahora lea la absorbancia en los pocillos a 450 nanómetros y compare las señales de unión al objetivo con las señales de unión de las proteínas de control después del enriquecimiento. Los clones individuales pueden aislarse y caracterizarse mediante la secuenciación del fago, la conversión del ADN del fago unido a la fab libre y la evaluación de la unión directa al objetivo mediante el clon FabuLisa, como se explica en la parte del texto del protocolo.

Para los laboratorios en los que se requiere un mayor rendimiento, esta metodología se puede escalar y automatizar. Con este objetivo en mente, se ha desarrollado una robótica personalizada que puede ampliar la capacidad de selección mediante la automatización de todos los aspectos del procedimiento, incluido el bloqueo, el fago, el enlace y el elucian, entre otros. Un enfoque para la obtención de antígenos para su uso en la selección de anticuerpos es el uso de tecnologías de genes sintéticos para obtener construcciones para la expresión de dominios de proteínas aisladas.

En la mayoría de los casos, esto permite la expresión de alto rendimiento y el aislamiento de cantidades adecuadas de antígeno purificado suficientemente puro para la selección. Durante las sucesivas rondas del proceso de selección, las concentraciones de fagos eludidos y el enriquecimiento del fago que se unió específicamente al antígeno se controlaron mediante la titulación de fagos, como se ha mostrado anteriormente, o se monitorizaron con grupos de fagos. En un ensayo de ELA, una relación de unión superior a dos generalmente indica la presencia de clones de unión específicos.

Por el contrario, una relación más baja puede ayudar a determinar la causa de un error de selección. La caracterización de la unión de clones mediante un aminoensayo colormétrico permite la comparación de la unión de fabulosos o fab a antígenos inmovilizados en comparación con la unión a proteínas de control negativo, lo que proporciona una medida de especificidad al escalar y automatizar selecciones con unidades robóticas de manejo de líquidos. El uso de cromóforos absorbentes puede ayudar a detectar cuándo canales específicos en los fluídicos están obstruidos o han perdido su sello, lo que resulta en una entrega de volumen parcial, y ayudar en la resolución de problemas durante la optimización de los procedimientos de lavado, el uso de clones de unión conocidos garantiza que se mantenga la unión objetivo mientras que la unión de fondo se elimina durante los lavados.

Además, los protocolos de descontaminación eficaces garantizan la ausencia de contaminación cruzada de rondas sucesivas de selección o diferentes procedimientos de selección y se recomiendan que los parámetros adicionales de solución de problemas se revisen en el protocolo de texto. Mediante el escalado de esta técnica para su aplicación industrial, esperamos permitir a los investigadores explorar clases enteras de proteínas relacionadas estructural o funcionalmente acelerando la selección e identificación de anticuerpos renovables de alta afinidad con el objetivo final de lograr la máxima cobertura del proteoma.