Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de transcritos individuales de ARN en células vivas en tiempo real. Esto se logra primero hibridizando dos oligonucleótidos que fueron diseñados para formar una sonda en horquilla conocida como baliza molecular ratiométrica. El segundo paso consiste en purificar las balizas moleculares ratiométricas mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

A continuación, se introducen en células que expresan el ARN diana modificado las sondas moleculares basadas en balizas mediante microinyección. El paso final consiste en colocar las células en una placa de micropocillos adecuada para microscopía de células vivas. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para monitorear los movimientos de transcritos individuales de ARN visualizados como puntos fluorescentes brillantes dentro de células individuales.

La principal ventaja de esta técnica es que utiliza sondas sintéticas que son brillantes, fotostables y presentan una alta relación señal-fondo, lo que abre la posibilidad de obtener imágenes de cualquier ARN endógeno. Comience la preparación del indicador de relación mediante balizas moleculares o RBM BS mezclando los siguientes reactivos en un tubo: 20 microlitros de Rbm B uno, 30 microlitros de Rbm B dos, seis microlitros de tampón fosfato 10 x y cuatro microlitros de agua libre de ADN y ARN. Esto generalmente es suficiente para aproximadamente 50 estudios.

Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, prepare una columna de cromatografía líquida para eliminar cualquier oligonucleótido RBM B dos híbrido UN no hibridado. Utilice 75 super decks de grado preparativo en una columna de cromatografía líquida de ocho mililitros con un volumen de lecho de aproximadamente cuatro mililitros, empleando una bomba de jeringa que funcione a un flujo de 0,6 mililitros por minuto.

Lave y equilibre el SUEx con aproximadamente 50 mililitros de tampón fosfato 1x antes de que todo el fluido entre en el volumen de la columna. Detenga la bomba de jeringa, deséngancla y deje que el líquido restante pase por la columna por gravedad. A continuación, cargue la mezcla RBMB sobre la columna de cromatografía.

Después de que la muestra de RBMB haya entrado completamente en el lecho, agregue lentamente otros 250 microlitros de tampón fosfato 1x en la parte superior del lecho para asegurar que toda la muestra haya entrado completamente en la columna. Llene la columna hasta el borde con tampón fosfato 1x. Cierre la parte superior e inicie la bomba de jeringa.

La jeringa se llena con aproximadamente 50 mililitros de un XPBS y se hace fluir a una velocidad de 0,6 mililitros por minuto. Por lo general, la muestra de RBMB puede visualizarse fácilmente debido al color del colorante incorporado en la sonda. Una vez que el RBMB se acerca al fondo de la columna, recoja el flujo saliente a razón de dos gotas por tubo de microcentrífuga.

Deje de recolectar la muestra. Una vez que el color de la muestra dentro de los tubos de microcentrífuga se vuelva transparente, combine los tubos que contienen la muestra coloreada de RBMB, típicamente cinco o seis tubos, y colóquelos en un dispositivo de filtro centrífugo. Centrifugue la muestra a 10.000 RCF durante 20 minutos o hasta alcanzar el volumen deseado.

Esta velocidad y tiempo normalmente producirán un volumen final de aproximadamente 30 microlitros. En este protocolo, una línea celular de fibrosarcoma humano fue modificada genéticamente para expresar Q-F-P-R-N-A con 96 repeticiones en tándem de la secuencia diana RBMB en la región UTR tres prima; la línea celular control fue modificada genéticamente para expresar Q-F-P-R-N-A de tipo silvestre un día antes de la entrega de la sonda, sembrando las células en una placa para cultivo en un frasco T 25 con una confluencia del 40 al 50%. Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con 1 % de penicilina-estreptomicina y 10 % de suero bovino fetal, e incubadas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono al día siguiente.

Encienda el micro por y configure los parámetros de micro porción optimizados para células HT 10 80. Llene el tubo de micro porción con cuatro mililitros de tampón electrolítico y colóquelo en la estación de preparación micro. Derrita una muestra de stock de RBMB purificado y diluya varias microlitros a una concentración final de 12 micromolar con tampón fosfato 1 x.

Se necesita un microlitro para cada micro porción. Para cada reacción de micro porción, pipete un mililitro de medio de cultivo con FBS, pero sin antibióticos, en un tubo microcentrífugo. Colóquelo aparte cerca del dispositivo de micro porción.

Se utilizará más adelante para suspender las células inmediatamente después de la preparación del micro. No se usan antibióticos porque disminuirían la viabilidad celular tras la preparación del micro. Las células HT 10 80 modificadas genéticamente sembradas el día anterior deben tener ahora una confluencia del 60 al 80%.

Retire el medio de cultivo celular y lave las células una vez con un mililitro de DPBS sin calcio ni magnesio. Incube con un mililitro de tripsina durante uno a dos minutos. Detenga la tripsina añadiendo un mililitro de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, sin antibióticos ni rojo de fenol, y transfiera las células a dos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Centrifugue las células en los tubos microcentrífugos a 200 ×g durante cinco minutos.

Elimine el sobrenadante, resuspenda y combine los botones celulares en un volumen final de un mililitro de DPBS. Retire 10 microlitros de la suspensión celular bien mezclada para contar las células; pipeteé las células hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar que estén bien dispersas, y transfiera 300.000 células con DPBS a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugue a 200 ×g durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el pellet celular. Re-suspenda el pellet en 11 microlitros de tampón de suspensión de re-suspensión y pase la pipeta arriba y abajo varias veces para asegurar que las células estén bien dispersas. Asegúrese de no generar burbujas de aire.

Añada un microlitro de RBMB diluido y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Nuevamente, tenga cuidado de no generar burbujas de aire. Es fundamental evitar introducir burbujas de aire en la suspensión de células RBMB porque las burbujas de aire provocarán una chispa durante la microoperación y resultarán en una mala administración de RBMB y muerte celular.

Utilizando la pipeta de preparación micro, aspire 10 microlitros de la mezcla celular de RBMB e inserte la pipeta en el tubo de preparación micro. Presione el botón de inicio para comenzar la micro corporación. No deben observarse burbujas de aire visibles en la punta cuando la pantalla del micro por muestre que ha finalizado.

Retire la pipeta de la estación y expulse la mezcla de 10 microlitros en el tubo de microcentrífuga previamente preparado que contiene un mililitro de medio de cultivo con FBS, pero sin antibióticos, mezclando suavemente mediante movimientos laterales del tubo varias veces. Centrifugue las células a 200 veces G durante cinco minutos. Lave las células dos veces con un mililitro de medio de cultivo libre de rojo de fenol con FBS, pero sin antibióticos, para eliminar cualquier BS de rbm que no haya sido introducida en las células.

Después del segundo lavado, resuspenda las células en 400 microlitros de medio de cultivo libre de rojo fenol con FBS, pero sin antibióticos. Incube las células microproporcionadas en una cámara de cubreobjetos de ocho pocillos recubierta con poli-L-lisina y previamente preparada, con 200 microlitros por pocillo o a la confluencia deseada.

Coloque el portaobjetos con cámara en una incubadora para cultivo celular. La adquisición de imágenes puede realizarse tan pronto como 30 minutos después de la preparación microscópica. Para comenzar este procedimiento, encienda el sistema de incubación en la platina para células vivas y equilíbrelo hasta que alcance 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono y 75 % de humedad.

Encienda el microscopio y la fuente de luz fluorescente y abra el software de adquisición de imágenes Metamorph. Aplique aceite de inmersión al objetivo. Transfiera el portaobjetos con cámara que contiene células microperforadas a la platina para células vivas.

Sistema de incubación superior. Incube el sistema de platina hasta que la temperatura y los niveles de dióxido de carbono se estabilicen. Abra la pestaña de adquisición en el software MetaMorph.

Haga clic en el botón mostrar en vivo para encontrar el campo. Ajuste el enfoque bajo luz blanca y haga clic en el botón detener vista en vivo. En la pestaña adquirir.

Haga clic y abra el botón emergente de adquisición de secuencias y configure los parámetros deseados para la adquisición de películas. Adquiera 150 cuadros utilizando el filtro SCI five CF six 40 R. Guarde las imágenes en el disco duro.

Se muestran aquí imágenes representativas de células HT 10 80 que expresan de forma estable ARN con 96 repeticiones en tándem, o cuatro repeticiones en tándem del sitio de unión RBMB en la región UTR tres prima. Tras la entrega intracelular de mbs. La presencia de 96 repeticiones en tándem permite que los transcritos individuales de ARN aparezcan como puntos fluorescentes brillantes.

En contraste, el ARN que contiene solo cuatro repeticiones en tándem aparece como puntos fluorescentes muy tenues y a menudo solo es detectable en áreas con fondo excepcionalmente bajo. La adquisición de imágenes en secuencia permite visualizar transcripciones individuales de ARN en tiempo real. Las transcripciones individuales de ARN pueden observarse fácilmente en el citoplasma y el núcleo de las células, que realizan movimientos brownianos o subdifusivos.

En casos raros, se observará un ARN que realiza transporte dirigido como se muestra aquí. Los transcritos de ARN que realizan transporte dirigido generalmente se mueven rápidamente a lo largo de una trayectoria recta. En este mosaico, la trayectoria del transcrito de ARN se muestra superpuesta sobre un solo cuadro de la serie temporal.

Los movimientos dirigidos de ARN son consistentes con el transporte de ARN a lo largo de microtúbulos y microfilamentos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y purificar racial metric mediante balizas moleculares. Entregar racial metric mediante balizas moleculares a las células mediante micro parion e imaginar transcritos individuales de ARN mediante microscopía fluorescente.