Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de transcripciones de ARN individuales en células vivas en tiempo real. Esto se logra hibridando primero dos oligonucleótidos que fueron diseñados para formar una sonda formadora de horquilla conocida como métrica de relación por baliza molecular. El segundo paso es purificar la relación métrica por balizas moleculares mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

A continuación, la métrica de la relación mediante balizas moleculares se introduce en las células que expresan el objetivo de ARN diseñado a través de micro poriones. El paso final es ver las células en una placa de micropocillo adecuada para la microscopía de células vivas. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para monitorear los movimientos de las transcripciones de ARN individuales visualizadas como puntos fluorescentes brillantes dentro de células individuales.

La principal ventaja de esta técnica es que utiliza sondas sintéticas que son fotoestables brillantes y exhiben una alta señal de fondo, lo que abre la posibilidad de obtener imágenes de cualquier ARN endógeno Comience la preparación de la métrica de proporción mediante balizas moleculares o RBM BS mezclando los siguientes reactivos en un tubo. 20 microlitros de Rbm B uno 30 microlitros de Rbm B dos seis microlitros de 10 x tampón de fosfato, y cuatro microlitros de ADNs y ARNs de agua libre. Por lo general, esto es suficiente para aproximadamente 50 estudios.

Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, prepare una columna de cromatografía líquida para eliminar cualquier oligonucleótido RBM B hibridado por las Naciones Unidas. Utilice 75 superdecks de grado de preparación en una columna de cromatografía líquida de ocho mililitros con un volumen de lecho de aproximadamente cuatro mililitros utilizando una bomba de jeringa que funcione a un caudal de 0,6 mililitros por minuto.

Lave y equilibre el SUEx con unos 50 mililitros de un tampón de fosfato antes de que todo el líquido entre en el volumen del lecho. Detenga la bomba de jeringa, desconéctela y deje que el líquido restante pase a través de la columna por gravedad. A continuación, cargue la mezcla de RBMB en la columna de cromatografía.

Después de que la muestra de RBMB haya ingresado completamente al lecho, agregue lentamente otros 250 microlitros de un tampón de fosfato en la parte superior del lecho para asegurarse de que toda la muestra haya ingresado completamente a la columna. Llene la columna hasta el borde con un tampón de fosfato. Cierre la parte superior y ponga en marcha la bomba de jeringa.

La jeringa se llena con unos 50 mililitros de un XPBS y funciona a un caudal de 0,6 mililitros por minuto. Por lo general, la muestra de RBMB se puede visualizar fácilmente debido al color del tinte incorporado en la sonda. Una vez que el RBMB se acerque a la parte inferior de la columna, recoja el flujo a través de dos gotas por tubo de microcentrífuga.

Deje de recoger la muestra. Una vez que el color de la muestra dentro de los tubos de microcentrífuga se aclare, combine los tubos que contienen la muestra de RBMB coloreada, generalmente de cinco a seis tubos, y cárguelos en un dispositivo de filtro centrífugo. Centrifugar la muestra a 10.000 RCF durante 20 minutos o hasta alcanzar el volumen deseado.

Esta velocidad y tiempo suelen producir un volumen final de unos 30 microlitros. En este protocolo, se diseñó una línea celular de fibrosarcoma humano para expresar Q-F-P-R-N-A con 96 repeticiones en tándem de la secuencia objetivo RBMB en las tres UTR principales, la línea celular de control se diseñó para expresar Q-F-P-R-N-A de tipo salvaje un día antes de las células de placa de entrega de la sonda en un matraz T 25 con un cultivo de fluidez del 40 al 50%. Las células con medios DMEM se suplementan con un 1% de estreptococo en pluma y un 10% de suero fetal bovino e incuban a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono al día siguiente.

Encienda el micro por y configure los parámetros de micro portración optimizados para celdas HT 10 80. Llene el tubo de micro porión con cuatro mililitros de tampón electrolítico y colóquelo en la estación de micropreparación. Descongele una muestra de stock de RBMB purificado y diluya varios microlitros hasta una concentración final de 12 micromolares con un tampón de fosfato.

Se necesita un microlitro por cada micro porción. Para cada reacción de micro porión Pipetear un mililitro de medio de cultivo con FBS, pero sin antibióticos en un tubo de microcentrífuga. Déjelo a un lado cerca del dispositivo de micro porción.

Se utilizará más tarde para suspender las células inmediatamente después de la micropreparación. Los antibióticos no se utilizan porque disminuirían la viabilidad celular después de la micropreparación. Las celdas HT 10 80 diseñadas el día anterior ahora deberían tener un 60 a 80% de confluente.

Retire los medios de cultivo celular y lave las células una vez con un mililitro de DPBS sin calcio y magnesio, incube con un mililitro de tripsina durante uno o dos minutos. Detenga la tripsina añadiendo un mililitro de medio DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal sin antibióticos y rojo de fenol y transfiera las células a dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Gire las celdas en el tubo de microcentrífuga a 200 veces G durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante, resuspenda y combine los pellets de celda en un volumen final de un mililitro de DPBS. Retire 10 microlitros de la suspensión de células bien mezcladas para contar las células, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que estén bien dispersas y transfiera 300.000 células con DPBS a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Gire a 200 veces G durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar la pellet. Vuelva a suspender el pellet en 11 microlitros de suspensión Resus, tampón y pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que las células estén bien dispersas. Asegúrese de no generar burbujas de aire.

Agregue un microlitro de RBMB diluido y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Nuevamente, tenga cuidado de no generar burbujas de aire. Es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire en la suspensión de ventas de RBMB porque las burbujas de aire causarán una chispa durante la microoperación y resultarán en una entrega deficiente de RBMB y muertes de células.

Con la pipeta de micropreparación, aspire 10 microlitros de la mezcla de células RBMB e inserte la pipeta en el tubo de micropreparación. Presione el botón de inicio para iniciar la micro corporación. No debe haber burbujas de aire visibles en la punta cuando la pantalla del micro por muestra la finalización.

Retire la pipeta de la estación y expulse la mezcla de 10 microlitros en el tubo de microcentrífuga previamente preparado que contiene un mililitro de medio de cultivo con FBS, pero sin antibióticos mezclados suavemente balanceando el tubo de lado a lado varias veces. Gira las celdas a 200 veces G durante cinco minutos. Lave las células dos veces en un mililitro de medio de cultivo libre de rojo de fenol con FBS, pero sin antibióticos para eliminar cualquier BS de rbm que no se haya introducido en las células.

Después del segundo lavado. Resus suspende las células en 400 microlitros de medio de cultivo libre de rojo de fenol con FBS, pero sin antibióticos. Coloque las células microprorrateadas en un cubreobjetos de ocho pozos recubierto de polilisina previamente preparado a 200 microlitros por pocillo o a la cofluidez deseada.

Coloque el cubreobjetos con cámara en una incubadora de cultivo celular. Las imágenes se pueden realizar tan pronto como 30 minutos después de la micropreparación. Para comenzar este procedimiento, encienda el sistema de incubación superior de la etapa de células vivas y equilibre hasta que alcance 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 75% de humedad.

Encienda el microscopio y la fuente de luz fluorescente y abra el software de adquisición de imágenes metamórficas. Aplica aceite sumergible en el objetivo. Transfiera el cubreobjetos con cámara con células microporosas a la etapa de células vivas.

Sistema de incubación superior. Incubar el sistema de la parte superior de la etapa hasta que la temperatura y los niveles de dióxido de carbono se estabilicen. Abra la pestaña Adquirir en el software metamorph.

Haga clic en el botón Mostrar en vivo para encontrar el campo. Ajuste el enfoque bajo luz blanca y haga clic en el botón Detener en vivo. En la pestaña Adquirir.

Haga clic y abra el botón emergente de adquisición de transmisión y configure los parámetros de adquisición de películas deseados. Adquiera 150 fotogramas con el filtro SCI five, CF, six, 40 R. Guarde las imágenes en el disco duro.

Aquí se muestran imágenes representativas de HT 10 80 células que expresan ARN de manera estable con 96 repeticiones en tándem, o cuatro repeticiones en tándem del sitio de unión RBMB en las tres UTR principales. Después de la liberación intracelular de mbs. La presencia de 96 repeticiones en tándem permite que las transcripciones individuales de ARN aparezcan como puntos fluorescentes brillantes.

Por el contrario, el ARN que contiene solo cuatro repeticiones en tándem aparece como puntos fluorescentes muy tenues y, a menudo, solo son detectables en áreas de fondo excepcionalmente bajo. La adquisición de imágenes de streaming permite obtener imágenes de transcripciones de ARN individuales en tiempo real. Las transcripciones individuales de ARN se pueden ver fácilmente dentro del citoplasma y el núcleo de las células que experimentan movimientos brownianos o subdifusivos.

En casos raros, se observará un ARN que se somete a transporte dirigido, como se muestra aquí. Los transcritos de ARN que se someten a transporte dirigido generalmente se mueven rápidamente a lo largo de una trayectoria recta. En este montaje, la trayectoria de la transcripción de ARN se muestra superpuesta a un solo fotograma de la serie temporal.

Los movimientos dirigidos del ARN son consistentes con el transporte del ARN a lo largo de microtúbulos y microfilamentos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y purificar la métrica racial mediante balizas moleculares. Entregue métricas raciales mediante balizas moleculares en las células a través de micro parión e imágenes de transcripciones de ARN único mediante microscopio fluorescente.