La broncoscopia guiada visualmente, intrabronquial Inoculación e: El pulmón bovino en la Investigación Biomédica

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las interacciones entre el huésped y el patógeno en un modelo bovino de infección respiratoria. Esto se logra induciendo una infección respiratoria en terneros mediante inoculación intrabronquial con el patógeno de interés durante el curso de la enfermedad. El animal se muestrea repetidamente mediante lavado broncoalveolar.

A continuación, se obtienen cepillados bronquiales y biopsias pulmonares transbronquiales para recuperar células epiteliales y muestras de tejido alveolar o pulmonar, respectivamente. En última instancia, se puede confirmar una enfermedad respiratoria específica del patógeno, por ejemplo, mediante cambios inflamatorios en el lavado, citología y detección inmunohistoquímica del patógeno. En las biopsias pulmonares transbronquiales, la principal ventaja de este modelo de gran animal en comparación con otros modelos animales existentes y con roedores es que, en nuestro modelo, podemos estudiar la evolución de la enfermedad durante un largo período de tiempo en el mismo individuo mediante muestreos repetidos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre el huésped y el patógeno in vivo, también puede aplicarse a otros sistemas, como patógenos alternativos o especies huésped diferentes. Mientras se mantenga la anestesia y se asista con el muestreo, estará presente una pescadora, quien es veterinaria de nuestro laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, llene tres jeringas con uno, dos y cinco mililitros del inóculo, respectivamente.

Luego, tras confirmar la anestesia, saque la lengua del animal y estire el cuello. A continuación, utilizando movimientos rotatorios suaves, coloque un espéculo metálico en la boca del ternero. Empuje el espéculo hacia adelante bajo control visual, usando una linterna para determinar cuándo es visible la laringe.

A continuación, inserte un tubo de teflón en el canal de trabajo de un endoscopio. El tubo no debe sobresalir de la punta del endoscopio. Inserte el endoscopio a través del espéculo.

Pueden ser necesarios ligeros ajustes en el espéculo para permitir el paso del endoscopio. Para atravesar la laringe, utilice el bronquio traqueal, que se ramifica hacia el lado derecho del pulmón, con el fin de alinear la imagen en el monitor. A continuación, conecte la jeringa que contiene cinco mililitros de inóculo al extremo del tubo de teflón.

Diríjase con el tubo hacia las ramas donde se depositará el inóculo y administre la cantidad adecuada de inóculo. A continuación, conecte la jeringa que contiene un mililitro de inóculo al tubo. Navegue hasta el bronquio traqueal y deposite el inóculo en la rama codal.

Retire el endoscopio y el espéculo. A continuación, conecte la última jeringa a un actuador y rocíe un mililitro del inóculo en cada fosa nasal. Coloque al animal de nuevo en su compartimento en posición prona para que despierte.

El establo de recuperación debe estar climatizado. Dado que la capacidad del animal para la termorregulación disminuye bajo anestesia general, caliente cinco jeringas, cada una conteniendo 20 mililitros de solución salina isotónica estéril, en un baño de agua a 38 grados Celsius en el momento deseado para la recolección de muestras. Luego, inserte un catéter de lavado en el canal de trabajo del endoscopio e introduzca el endoscopio en el espéculo metálico.

A continuación, avance hacia delante por el bronquio principal del pulmón izquierdo hasta alcanzar la posición en cuña, momento en el cual el endoscopio no podrá avanzar más. Luego, uno tras otro, conecte las jeringas con la solución tibia de cloruro de sodio al catéter de lavado para instilar y aspirar directamente el líquido.

Almacene el líquido de lavado broncoalveolar inmediatamente en botellas de vidrio silanizadas sobre hielo tras su recuperación para evitar que los macrófagos alveolares se adhieran a la superficie de vidrio. Anote tanto la cantidad de solución salina instilada como la cantidad de líquido recuperado. Luego retire el catéter de lavado del canal de trabajo para recolectar las células epiteliales.

A continuación, dirija el endoscopio hasta la ubicación deseada para la toma de muestra. Por ejemplo, en este experimento, hasta la bifurcación traqueal; cuando el endoscopio esté en su lugar, cubra un cepillo bronquial con el tubo e insértelo en el canal de trabajo del endoscopio hasta que la punta del cepillo aparezca en el monitor. Empuje el cepillo y el tubo de plástico hacia adelante aproximadamente cinco centímetros.

Luego, empuje el mango del cepillo para extraerlo del tubo de plástico. Cuando el cepillo esté en posición, diríjalo hacia el lugar que debe cepillarse. A continuación, empuje y tire suavemente del cepillo hacia adelante y hacia atrás mientras navega el endoscopio.

Para garantizar el contacto entre el cepillo y la pared del bronquio y desprender las células epiteliales. Detenga el frotamiento cuando ocurra sangrado. Luego, cubra el cepillo con el tubo y retírelo del canal de trabajo.

Coloque suavemente las cerdas recubiertas de células epiteliales sobre hasta cinco portaobjetos y fije los frotis en metanol frío durante 10 minutos. Luego, después de permitir que los portaobjetos sequen al aire, almacénelos a menos 20 grados Celsius para realizar una biopsia pulmonar transbronquial. A continuación, dirija el endoscopio hacia la ubicación deseada para la toma de muestra.

Por ejemplo, la pars alis de las AOEL, como en este experimento, antes de insertar la pinza de biopsia en el canal de trabajo, ábrala y ciérrela varias veces para asegurar su correcto funcionamiento, y luego impulse la pinza hacia la rama codal de la tráquea bronquial hasta que ocurra una ligera resistencia. Ahora, retire la pinza dos o tres centímetros y abra la pinza. Vuelva a avanzar la pinza aproximadamente dos centímetros y luego ciérrela.

Retire y extraiga la pinza del canal de trabajo. Utilice una aguja para retirar cuidadosamente el tejido de la pinza de biopsia y guárdelo en un medio de fijación adecuado para prevenir la formación de procesos autolíticos. Finalmente, después de permitir que el ternero se recupere en su establo, supervise nuevamente al animal en busca de neumotórax durante las próximas 24 horas, proporcionando alimento y agua fresca.

Cuando el animal haya recuperado la conciencia completamente, se pueden teñir inmunohistoquímicamente secciones congeladas de biopsias pulmonares transbronquiales. Para visualizar el patógeno inoculado, observe las inclusiones marrones de clamidia en el pulmón de este animal, que fue inoculado con clamidia C cuatro días antes de la toma de la muestra. La tinción inmunohistoquímica de las células del lavado permite la visualización de patógenos intracelulares.

Por ejemplo, en esta imagen, se observan inclusiones clamidiales en los macrófagos alveolares obtenidos de un ternero. Nueve días después de la inoculación intrabronquial con clamidia, se puede observar CTAC. Las células del lavado broncoalveolar pueden diferenciarse mediante tinción citológica.

Los macrófagos alveolares son el tipo celular predominante en el líquido de lavado. Sin embargo, el número de granulocitos neutrófilos aumenta cuando están presentes procesos inflamatorios. Una vez dominada, la inoculación puede realizarse en 10 a 15 minutos y la toma de muestras puede completarse en 20 a 30 minutos si se realiza adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar la inoculación intrabronquial en terneros y cómo obtener muestras de líquido alveolar bronquial, cepillados bronquiales y biopsias pulmonares transbronquiales en el animal anestesiado.