Transgénicos Roedor Ensayo para la cuantificación de la célula germinal masculina Mutant Frecuencia

El objetivo general de este procedimiento es medir la frecuencia de mutaciones inducidas en un gen reportero recuperado de las células germinales de ratones transgénicos machos después de la exposición a un mutágeno químico o físico. Esto se logra exponiendo primero a los ratones machos a un presunto mutágeno de células germinales. El segundo paso es recolectar las células germinales después de que hayan progresado a través de las etapas deseadas de la espermatogénesis.

A continuación, el ADN que contiene el transgén que informa de la mutación se recupera de las células germinales. El paso final es empaquetar los genes reporteros recuperados en partículas de fagos lambda. En última instancia, se utiliza un ensayo de selección positiva in vitro para medir la proporción de genes reporteros recuperados de las células germinales que han sido mutadas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la prueba de locus específico o la prueba de Domino Little, es que las mutaciones se miden directamente en las células germinales en lugar de puntuar la descendencia mutante. Se puede investigar un gran número de células germinales a partir de un solo macho, lo que mejora la sensibilidad del ensayo en comparación con los métodos tradicionales, mientras que al mismo tiempo reduce drásticamente el número de recursos y tiempo de los animales. Este método puede abordar cuestiones clave en el campo de la toxicología genética y la mutagénesis, como la identificación de agentes mutagénicos para las células germinales y la elucidación de sus modos de acción.

Aunque describimos el método para el modelo de ratón Muta, se puede aplicar fácilmente a otros sistemas de roedores transgénicos que portan vectores de notificación de mutaciones de fagos bacterianos. Además, si bien el método describe el proceso para las células germinales masculinas, tiene aplicabilidad general a los tejidos somáticos y, lo que es más importante, está cubierto por una guía de prueba armonizada internacionalmente publicada por la OCDE. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el momento de la parte in vitro del ensayo porque varios de los pasos tienen largos períodos de espera.

Los pasos deben planificarse y coordinarse cuidadosamente para completar este método de manera oportuna. John Gingrich y Linda Soper, bióloga de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento antes de comenzar el experimento. Se deben seleccionar tres variables experimentales críticas, el tiempo de administración, el tiempo de muestreo y la población de células germinales recolectadas.

Estas variables se pueden ajustar para interrogar los efectos de la exposición en varios tipos de células germinales y en diferentes fases de la espermatogénesis. Para comenzar este procedimiento, distribuya aleatoriamente ratones machos transgénicos de ocho a 12 semanas de edad en un grupo de control y grupos de tratamiento con un mínimo de cinco por grupo. A continuación, tratar a los ratones con un compuesto de ensayo y un control pertinente a través de una vía de exposición adecuada durante el tiempo de administración seleccionado.

A continuación, elija el tiempo de muestreo adecuado de acuerdo con el tipo de célula metagénica espermática de interés. Luego, después de que haya ocurrido el tiempo de muestreo, eutanasia a los ratones por dislocación cervical bajo anestesia con flúor. Para extirpar los testículos, haga una incisión en el abdomen, ubique la almohadilla de grasa epidérmica.

Tire con cuidado de la almohadilla de grasa para extraer los testículos y el epidídimo del escroto. A continuación, extirpar la cota epidídimo. Congele la Cota epididymus en nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados para su uso posterior.

Cuando esté listo para procesar el esperma de Cota, descongele el epidídimo de Cota en hielo y luego transfiera el Cota descongelado a una placa de Petri. A continuación, utilice un bisturí o una cuchilla de afeitar para picar bien la pipeta coda Epididymus 700 microlitros de DPBS a temperatura ambiente en la placa de Petri. A continuación, utilice una punta de pipeta de 1000 microlitros de diámetro ancho para liberar los espermatozoides de la coda estirando y soltando la suspensión aproximadamente 10 veces o hasta que el DPBS se enturbie de espermatozoides, filtre la suspensión de espermatozoides a través de un filtro de malla de acero inoxidable en un tubo nuevo de 1,5 mililitros y, a continuación, centrifugue el tubo a las 11, 000 veces G durante tres minutos.

Decantar cuidadosamente el sobrenadante del tubo sin alterar el pellet. A continuación, añade un mililitro de citrato de sodio frío, uno x citrato de sodio salino, y vórtea el tubo hasta que el pellet se resuspenda por completo. A continuación, agregue 15 microlitros de 10%SDS al tubo y agite vigorosamente el tubo durante 30 segundos para interrumpir las células que no son espermatozoides.

A continuación, centrifugar el tubo a 11.000 veces G durante dos minutos. Después de la centrifugación, decantar cuidadosamente el sobrenadante del tubo y agregar 940 microlitros de 0,2 x citrato de sodio salino frío, y vuelva a vórtice el tubo hasta que se vuelva a suspender el pellet. Añadir 120 microlitros A beta mer capto etanol, 100 microlitros de 10%SDS, 20 microlitros de EDTA 0,5 molar, pH ocho y 20 microlitros de 60 miligramos por mililitro.

Proteinasa K a los espermatozoides resuspendidos. Mezcle bien la solución y luego coloque el tubo en un rotador durante la noche a 37 grados centígrados para digerir después de la digestión durante la noche. Extraiga el ADN del espermatozoide de coda siguiendo los pasos descritos en el protocolo de texto para realizar una extracción de fenol cloroformo después de la extracción.

Disuelva el precipitado de ADN en 40 a 100 microlitros de tampón tris EDTA PH ocho y almacene a cuatro grados centígrados. Espere varios días para que el ADN se disuelva por completo antes de continuar con el siguiente paso del día. Antes de realizar el ensayo de la mutación LAX Z, prepare y autoclave una cantidad suficiente de barrena inferior para el número de muestras que se están procesando.

Luego, vierta asépticamente la barrena en placas de Petri de 90 milímetros y deje que la barrena se solidifique en un tubo de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de caldo LB, 100 microlitros de solución de maltosa al 20%, 25 microlitros de 20 miligramos por mililitro de ampicilina y 20 microlitros de cinco miligramos por mililitro. A continuación, la micina puede inocular el tubo con LAX Z GAL negativo e e e coli negativa, y crecer durante la noche a 37 grados centígrados mientras se agita a 240 RPM el primer día del subcultivo del ensayo preparando una dilución de uno a 100 del cultivo nocturno en LB fresco sin antibióticos.

Incubar el cultivo a 37 grados centígrados agitando a 240 RPM durante unas tres horas o hasta que el diámetro exterior de 600 sea igual a uno. Una vez que el diámetro exterior 600 alcance uno, divida la suspensión celular uniformemente en tubos de 50 mililitros y centrifugue a 1, 300 veces G a 15 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células a la mitad del volumen original de LB que contiene 10 milimolares de sulfato de magnesio.

Deje las células a un lado mientras se preparan los demás reactivos. Empaquetar el ADN en partículas de fagos Lambda mediante un primer pipeteo. Cuatro microlitros de ADN extraídos de los espermatozoides de la coda utilizando una pipeta de diámetro ancho en un tubo de 1,5 mililitros.

Descongele el primer tubo de un kit de extracto de envase de fagos a temperatura ambiente y, a continuación, pipetee 4,8 microlitros del extracto de envase en el tubo que contiene el ADN. A continuación, agite suavemente la solución con la punta de la pipeta y, a continuación, incube el tubo en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 1,5 horas. A continuación, descongele el segundo tubo de extracción del envase y, de nuevo, pipetee 4,8 microlitros en el tubo que contiene el ADN.

Agite suavemente la solución con la punta de la pipeta y, a continuación, incube el tubo en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 1,5 horas. Vuelva a suspender las partículas de fagos empaquetadas en 500 microlitros de tampón salino y magnesio y coloque los tubos en un rotador durante 30 minutos a 20 RPM. Después de rotar, agite brevemente las muestras y luego centrifugue a 11,000 veces G durante 30 segundos para recolectar las muestras en el fondo del tubo.

Las partículas del fago ya están listas para la infección. A continuación, prepare ocho mililitros de barrena superior para cada título y placa mutante. Mantenga los sinfines superiores a 50 grados centígrados antes de agregar sulfato de magnesio a 10 milimolares y agregue tres gramos por litro del agente selectivo PGAL a la selección mutante.

Barrena superior solo antes de la infección de las células. Etiquete dos tubos de 50 mililitros por muestra, etiquete un mutante y un título. A continuación, etiquete ocho placas de barrena por muestra, cuatro mutantes y cuatro titulaciones.

A continuación, pipetee dos mililitros de células resuspendidas en cada tubo de 50 mililitros. Agregue 500 microlitros de partículas de fagos empaquetadas en un tubo de 50 mililitros etiquetado como mutante. Mezcle suavemente el tubo y deje que las partículas de fagos infecten las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación de 30 minutos, vórtice brevemente las células infectadas y luego transfiera 15 microlitros de las células infectadas al tubo de título de 50 mililitros correspondiente. Agregue 30 mililitros de barrena superior de título de 50 grados Celsius al tubo de título de 50 mililitros. Distribuya inmediatamente la mezcla de tornillo sinfín y celda entre las cuatro placas de titulación.

Asegúrese de que se hayan agregado tres gramos por litro de P gal a la barrena de selección de mutantes de 50 grados Celsius. A continuación, agregue 30 mililitros del sinfín de selección mutante que contiene PGAL al tubo mutante de 50 mililitros. A continuación, distribuya inmediatamente la cantidad de mezcla de barrena y células a las cuatro placas mutantes.

Deje que las placas se solidifiquen y luego invierta las placas e incube a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación durante la noche, cuente el número de placas en las placas mutantes y tituladas. A continuación, calcule la frecuencia mutante dividiendo el número total de placas mutantes contadas, contadas en las cuatro placas mutantes por el número total estimado de unidades formadoras de placas en el volumen total de células infectadas determinado a partir de las placas de título.

Un ensayo típico de mutación de células germinales de roedores transgénicos da como resultado muy pocas placas en las placas de barrena mutantes, especialmente en los grupos de dosis de control. Mientras que, por otro lado, se detectan cientos de placas en las placas de titulación. La exposición de machos de ratón mestizo a una dosis oral aguda única de 0, 25, 50 y 100 miligramos por kilogramo de ENU, seguida de un tiempo de muestreo de 70 días, permitió medir los eventos mutacionales en las células madre de espermatogonia.

La dosis baja de ENU indujo un aumento de 2,6 veces en la frecuencia de mutantes por encima de los controles, y la dosis máxima provocó un aumento de 4,4 veces. Al diseñar experimentos que utilicen este procedimiento, es importante tener siempre en cuenta el momento en que se realiza. El ciclo metagénico de los espermatozoides, el tiempo de administración, el tiempo de muestreo y el tipo de célula recolectada deben seleccionarse cuidadosamente para observar los efectos que se originan en el tipo de célula metagénica de los espermatozoides deseado.

Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la secuenciación del ADN en las placas mutantes para caracterizar las mutaciones e identificar los mutantes que pueden derivarse de eventos de expansión clonal. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la toxicología genética identifiquen mutágenos que pueden dirigirse a la línea germinal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la frecuencia de mutantes inducidos en las células germinales o ratones machos transgénicos expuestos a un mutágeno.

Este ensayo tiene aplicaciones potenciales en pruebas regulatorias para mutágenos de células gema y en investigaciones mecanicistas más específicas.