La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de Escherichia coli

El objetivo general de este procedimiento es purificar polipéptidos similares a la elastina recombinante de E. coli mediante un ciclo de transición inversa. Esto se logra recolectando primero el lisado de células de E. coli que han expresado elastina recombinante como polipéptido, y eliminando los desechos celulares insolubles por centrifugación. El segundo paso es eliminar los contaminantes solubles induciendo la transición de polipéptidos similares a la elastina con la adición de sal o calor.

A continuación, se recoge la elastina como un polipéptido por centrifugación y se desecha el sobrenadante. Este paso se denomina giro en caliente. A continuación, la solución polipeptídica similar a la elastina resuspendida se centrifuga para eliminar los contaminantes insolubles.

El polipéptido soluble similar a la elastina en el sobrenadante se retiene y el pellet se desecha. Este paso se denomina centrifugado en frío, ciclos repetidos de espines en caliente y en frío hasta que se logra una pureza satisfactoria del polipéptido similar a la elastina. En última instancia, el ciclo de transición inversa produce productos polipeptídicos similares a la elastina pura que se pueden caracterizar para su uso en una variedad de aplicaciones biomédicas.

Los polipéptidos similares a la elastina purificados por esta técnica tienen una serie de aplicaciones útiles, como la biodetección, la ingeniería de tejidos y la administración de fármacos, donde la temperatura de transición y la arquitectura del biopolímero del polipéptido similar a la elastina se pueden ajustar específicamente para cada aplicación. Para comenzar, exprese el plásmido codificante ELP deseado en E. coli utilizando las condiciones descritas en el protocolo de texto adjunto. Después de agitar un cultivo de un litro en una incubadora durante 24 horas a 37 grados centígrados, transfiera el cultivo a una botella centrífuga de un litro y luego centrifugue la botella a 2000 Gs durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, deseche el sobrenadante y resus. Suspenda el pellet en agua PBS u otro tampón deseado hasta un volumen total de 45 mililitros. Luego transfirió la suspensión de la celda a un tubo cónico de 50 mililitros.

Coloque la suspensión de celdas sobre hielo y, una vez enfriada, sonique durante un total de nueve minutos en ciclos de 10 segundos de encendido y 20 segundos de apagado. Con una potencia de salida de 85 vatios. Deje que la muestra se enfríe en hielo durante aproximadamente 10 minutos después de la primera ronda de sonicación, y luego repita el ciclo de sonicación de nueve minutos.

Transfiera el lisado a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 mililitros. Luego agregue dos mililitros de polietileno al 10% de peso por volumen por cada litro de cultivo, y agite el tubo para mezclar a continuación, centrifugue el tubo a 16, 000 GS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de fondo redondo limpio de 50 mililitros y deseche el pellet.

Agregue cloruro de sodio cristalino a la muestra para inducir la transición ELP. Una vez que la sal se haya disuelto, la solución se volverá turbia, lo que indica la separación de fases del ELP de la solución. A continuación, granule el ELP centrifugando la muestra a 16.000 GS durante 10 minutos.

A temperatura ambiente, el pellet de ELP puede parecer opaco al principio, desechar el sobrenadante y luego agregar de uno a cinco mililitros del tampón deseado después de enfriarse. El pellet ELP puede parecer translúcido y de color marrón. Resus suspende el pellet pipeteando o girando el tubo a cuatro grados centígrados.

A continuación, pipetee alícuotas de un mililitro de la solución ELP resuspendida en tubos de microcentrífuga limpios de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 16.000 GS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo limpio y deseche los gránulos.

Inducir la transición ELP con la adición de cloruro de sodio. Si el ELP tiene una temperatura de transición alta que no se puede inducir solo con sal, incube la muestra en un bloque de calor durante 15 minutos a una temperatura superior a la temperatura de transición del ELP. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 GS durante 10 minutos a una temperatura superior a la utilizada para el paso de transición ELP.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de ELP en 500 a 750 microlitros del tampón deseado pipeteando o girando el tubo a cuatro grados Celsius hasta que el pellet esté resoluble. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 GS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular cualquier contaminante insoluble. A continuación, transfiera el snat a un tubo limpio y deseche el pellet Repita el ciclo de transición inversa hasta que no se observe ningún pellet contaminante.

Por lo general, esto requiere de dos a cinco ciclos. Prepare una serie de dilución de soluciones de ELP en PBS u otro tampón deseado. A continuación, utilice un espectrofotómetro UV v con control de temperatura para medir la densidad óptica a 350 nanómetros en un rango de temperaturas mientras calienta la muestra a una velocidad de un grado Celsius por minuto.

Si no se observa un aumento en la densidad óptica, entonces la temperatura de transición puede exceder el límite superior de temperatura. A continuación, mida la disminución de la densidad óptica en el mismo rango de temperaturas a una velocidad de enfriamiento de un grado Celsius por minuto. Para verificar la reversibilidad del gráfico de transición ELP, la densidad óptica frente a la temperatura, luego determine la temperatura de transición del ELP de homopolímero.

Al identificar el punto de inflexión en este perfil de turbidez, la purificación exitosa de los LP se confirma mediante la página SDS, como se puede ver aquí. El número de contaminantes es mucho mayor en el lisado inicial de E. coli en comparación con la muestra después de una ronda de ciclo de transición inversa. La temperatura de transición ELP se caracteriza por una turbidez programada a la temperatura para un homopolímero ELP.

El perfil de turbidez exhibe un solo aumento brusco en la densidad óptica, que define la temperatura de transición a una concentración dada. La naturaleza reversible de la transición ELP se confirma con un escaneo de turbidez de enfriamiento. Los copolímeros de bloque de matriz ELP exhiben un perfil de turbidez más complejo que los LP de polímero homo.

A continuación, se pueden tomar mediciones dinámicas de dispersión de la luz para confirmar el comportamiento de estos LP que se infiere del archivo del perfil de turbidez. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar los polipéptidos recombinantes similares a la elastina de E. coli utilizando el ciclo de transición inversa. No, no, no, no, no.