Name: Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Aprenda a implantar injertos vasculares de ingeniería de tejidos en la vena cava inferior de ratones mediante microcirugía. Este método permite estudiar la formación de neotejido y la integración celular in vivo.

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Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del NIH (HL098228 SR1) de CKB.

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité del Hospital Institucional Cuidado de Animales y Uso de los Niños de Nationwide. 1. Injerto de fabricación <ol><li> Hacer la solución ε-caprolactona y L-lactida copolímero P (LA / CL) mediante la adición de 100 mg de P (LA / CL) en 2 ml de dioxano bajo una campana de humos. Coloque la solución en un vórtice y se mezcla continuamente durante 1 a 1,5 horas para disolver completamente. </li><li> Mientras tanto, quitar una hoja de ácido poliglicólico (PGA) se sintió desde el congelador y cortar varias secciones 5 x 8 mm. También cortar la punta de un 0,1-10 l pipeta justo por encima del filtro. </li><li> Inserte una aguja de 19 (1,5 longitud) en el extremo distal de una punta de pipeta y envolver la PGA se sintió alrededor de la aguja utilizando micro forceps. </li><li> Empuje con cuidado el fieltro en el extremo distal de la punta de la pipeta, donde el lumen es más recto que la parte proximal, utilizando una aguja roma 18 g, mientras que el G aguja 19 se inserta en él. </li><li> Pipeta40 l P (CL / LA) solución en la punta de la pipeta de la parte superior. Saturar el PGA sentía con la solución. Luego empuje las burbujas de aire utilizando un dispensador de la pipeta. Repita este proceso si es necesario. </li><li> Coloque los injertos en un tubo de 50 ml y la colocan en un congelador de -80 ° C durante 20 min. Asegúrese de que el jefe de las agujas de bruces. </li><li> Transferir el tubo en un liofilizador y aspirar durante 24 horas. Asegúrese de abrir la tapa del tubo para que el flujo de aire. </li><li> Saque los injertos y sacarlos de las agujas. Corte ambos extremos del injerto dejando una sección de ~ 5 mm y volver a ponerlos sobre las agujas para mantener su forma. Mantener los injertos en un desecador. </li><li> Coloque el andamio a la luz ultravioleta en una siembra de células bioseguridad capó O / N antes. </li></ol> 2. Mononucleares de médula ósea La recolección de la célula y aislamiento <ol><li> La eutanasia a los ratones con sobredosis de ketamina / xilazina (ketamina, 200 mg / kg y xilazina, 20 mg / kg). </li><li> Quite los huesos (fémur und tibias) de 3 ratones durante 10 implantaciones de injerto y colocar en una placa de Petri con 10 cc RPMI. Corte ambos extremos de los huesos y médula ósea ras utilizando una jeringa con una aguja de calibre 25 en una nueva placa de Petri con medio RPMI 3 cc. Recoger la médula ósea y la solución de RPMI en un tubo de 15 cc y se lava la placa de Petri con medio RPMI adicional 2 cc para recoger el resto de BM. </li><li> Toma de muestras (5-10 l) y el recuento de células utilizando un contador de células automatizado o hemocitómetro. Registre el resultado. </li><li> Ponga 5 cc de Ficoll en un tubo de centrífuga de 15 cc y añadir la médula ósea y la solución de RPMI. Añadir la solución muy suavemente para evitar que se mezcla con Ficoll. </li><li> Centrifugar a 528 xg durante 30 minutos con &quot;NO FRENO&quot; a 24 ° C. </li><li> Retire la capa rosada superior. Recoger la capa intermedia clara la Figura 1, que es la capa de MNC, y diluirla con PBS 1:01. </li><li> Centrifugar la solución MNC diluido a 528 xg durante 10 min a 24 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y dilaúd el sedimento con 5 ml de PBS. </li><li> Centrifugar la solución de pellets a 528 xg durante 10 min a 24 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Diluir el sedimento con el volumen apropiado de medio RPMI (~ 200 l). </li><li> Tomar una muestra de l 5-10 y contar las células utilizando un contador de células automatizado o hemocitómetro. Registre el resultado. Repita la célula contando una vez más y calcular el número medio de celda. </li><li> Diluir concentración de células a 1.000.000 células/10 l usando medio RPMI. </li></ol> 3. Siembra de células <ol><li> Andamio prehumedecido añadiendo 5 l RPMI luminally durante 5 minutos, luego retire RPMI. </li><li> Añadir 10 l de médula ósea procedentes de células mononucleares en RPMI del Paso 2,12 a luz andamios y esperar 10 minutos para permitir que las células se unan al andamio. </li><li> Cortar una aguja de 19 G hasta 1 cm de longitud y poner la aguja en el lumen del andamio para mantener la forma del andamio. Colocar la muestra en una placa de 24 pocillos. &lt;/ Li&gt; <li> Añadir 1000 l de RPMI a cada pocillo e incubar O / N en una incubadora. </li></ol> 4. Injerto de implantación <ol><li> Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía: 1x tijeras finas, 3x fórceps micro, pinzas vasculares micro de 2x, abrazadera 1x fórceps soliciten, sostenedor 1x micro aguja, tijeras de primavera 1x, 1x retractor. </li><li> 6-8 semanas de edad hembra C57BL / 6 se utilizan como ingeniería tisular receptores de injertos vasculares. Eliminar el ratón de su jaula y se pesa, entonces anestesiar a través de una inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen con un cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg y xilazina, 10 mg / kg). Ketoprofeno (5 mg / kg, ip) se usa como un analgésico de pre-anestesia. </li><li> Compruebe el nivel de sedación por pellizcos cuento, a continuación, cortar el pelo abdominal. Lubricar los ojos con un ungüento oftálmico estéril y colocar el ratón en una posición de decúbito dorsal sobre una almohadilla. Desinfectar el abdomen con almohadillas de betadine y alcohol. CoVer el ratón con un paño estéril y exponer sólo el área de la incisión. </li><li> Hacer una laparotomía de la línea media de la incisión por debajo de la xifoides a la región suprapúbica, e insertar un retractor de auto-retención. Envuelva los intestinos en solución salina gasa humedecida. Francamente definir la aorta infrarrenal y la vena cava. </li><li> Coloque dos pinzas vasculares micro tanto en lados proximal y distal de la aorta y la vena cava a continuación, separar sin rodeos la aorta desde la vena cava Transecta la vena cava. Si es necesario, ligar las ramas de la aorta abdominal con suturas monofilamento 10-0 sobre agujas afiladas. </li><li> Implantar una vena cava inferior con injerto de interposición extremo proximal y distal para terminar con anastomosis utilizando un 10-0 sutura estéril. Recorte el injerto, generalmente de 1-2 mm, dependiendo de la anatomía del ratón. Asegurar el injerto con una puntada en ambos extremos proximal y distal y empezar a suturar continuamente con 4-5 puntos de sutura desde el otro lado del injerto. Después de terminar la parte frontal, voltear las abrazaderas y los injertoshasta el otro lado y suturar la parte de atrás del injerto. Durante la implantación, lave el injerto con solución de heparina con frecuencia para prevenir la trombosis aguda. </li><li> Retire la abrazadera proximal y controlar la hemorragia mediante la aplicación de un agente de hemostato absorbible estéril tópica. Cuando la hemorragia se detiene por completo, retire la pinza distal y controlar la hemorragia de la misma manera. Hacer flujos sanguíneos seguros a través del injerto. </li><li> Cierre la musculatura abdominal y la piel de dos capas usando una sutura monofilamento 6-0 poliamida negro con aguja enhebrada incluido. </li><li> Inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea y colocar el ratón en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica hasta que el ratón es completamente móvil. Después de la recuperación, devuelva el ratón a una nueva jaula con ropa de cama de papel. Déle medicina para el dolor (ibuprofeno, 30 mg / kg, el agua potable) durante 48 horas. </li></ol>

<ol><li>Heart Association, A. merican <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics%E2%80%942012+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update.</a> Circulation. 125, (2012).</li>
<li>Shinoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+Of+Viable+Pulmonary+Artery+Autografts+Through+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-term+results+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).</li>
<li>Shin'oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midterm+clinical+result+of+tissue-engineered+vascular+autografts+seeded+with+autologous+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).</li>
<li>Brennan, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+demonstrate+evidence+of+growth+and+development+when+implanted+in+a+juvenile+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model.</a> Ann Surg. 248, 370-377 (2008).</li>
<li>Roh, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+autologous+tissue-engineered+venous+conduit+from+bone+marrow-derived+vascular+cells%3A+optimization+of+cell+harvest+and+seeding+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques.</a> Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+form+neovessels+that+arise+from+regeneration+of+the+adjacent+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel.</a> The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+in+neovessel+formation+and+the+development+of+stenosis+in+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts.</a> The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Natural+History+of+Extracellular+Matrix+Production+in+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+during+Neovessel+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation.</a> Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Burst+Pressure%3A+Initial+Evaluation+of+the+Natural+History+of+the+Biaxial+Mechanical+Properties+of+Tissue+Engineered+Vascular+Grafts+in+the+Venous+Circulation+Using+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model.</a> Tissue Eng. Part A. 20, (2013).</li>
<li>Mirensky, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts%3A+does+cell+seeding+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).</li>
<li>Roh, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+transform+into+mature+blood+vessels+via+an+inflammation-mediated+process+of+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).</li>
<li>Mirensky, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+arterial+grafts%3A+long-term+results+after+implantation+in+a+small+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).</li>
<li>Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biaxial+mechanical+properties+of+the+inferior+vena+cava+in+C57BL%2F6+and+CB-17+SCID%2Fbg+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice.</a> Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de ratón de TEVG es una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido y el desarrollo de la estenosis. La cabeza de serie BM-MNC se muestra en ambas imágenes histológicas y de SEM de las células sembradas sobre el injerto 11. La eficiencia de la siembra de células también se demostró usando un ensayo de ADN 7. El uso de este sistema modelo se demostró que la siembra de células reduce la incidencia del desarrollo de la estenosis TEVG, qu...

Las cardiopatías congénitas son enfermedades graves que afectan a casi el 8% de los nacimientos vivos en los Estados Unidos. Aproximadamente el 25% de los recién nacidos con defectos congénitos del corazón o de 2,4 por 1.000 nacidos vivos, requieren tratamiento invasivo en el primer año de su vida 1. El tratamiento más efectivo para la enfermedad cardiaca congénita es la cirugía reconstructiva. Por desgracia, las complicaciones derivadas de la utilización de conductos vasculares actualmente disponibles son la causa más importante de morbilidad y mortalidad postoperatorias. Para solucionar este problema, hemos desarrollado los primeros ingeniería tisular injertos vasculares (TEVGs) para uso clínico 2. TEVGs se construyeron a partir de tubos de poliéster biodegradables sembradas con médula ósea autóloga células mononucleares derivadas (CMN-MO) y implantados como conductos venosos para la cirugía cardíaca congénita. Los resultados mostraron excelentes tasas de permeabilidad a 1-3 años de seguimiento, pero con incidencia significativa de la estenosis <shasta&gt; 3,4. Estaba claro que era necesaria una mejor comprensión de la formación neotejido vascular y el mecanismo subyacente a la aparición de estenosis TEVG. Con el fin de comprender mejor el desarrollo de TEVGs y el mecanismo de desarrollo de la estenosis, un modelo ovino se ha creado 5,6. En este modelo, los TEVGs transformaron con éxito en los vasos que viven y fueron similares tanto en la morfología y la función de las venas nativas. Este uso de un modelo animal de gran tamaño era un buen primer paso para proporcionar información importante sobre la pre-clínico que ayudó el uso clínico de TEVGs. Sin embargo, la plena comprensión de los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido vascular en TEVGs utilizando modelos animales grandes es limitada, debido a las limitaciones en la caracterización molecular de fenotipos de células vasculares debido a la falta de especies de herramientas moleculares específicas. Para superar estas deficiencias, un modelo murino de TEVGs fue desarrollado por razón del rápido avance de la genética del ratón y su extensa moleculacaracterización r con la ventaja añadida de una escala de tiempo más corta. El modelo murino interposición IVC recapitula fielmente el proceso de formación de neovasos que se produce en grandes animales y los seres humanos, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto 6-9. Aquí, un protocolo detallado para la fabricación del injerto a pequeña escala usando andamios biodegradables, se describe BM MNC-recolección y el aislamiento, la BM MNC-siembra en andamio, y la implantación del injerto en un modelo murino.

<table><tbody><tr><td>Fieltro de ácido poliglicólico (PGA)</td><td>Biomedical Structures</td><td></td><td>Custome pedido</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, 0.1-10 &mu; l&nbsp;</td><td>Fisher Sientific</td><td>02-707-456</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador&nbsp;</td><td>Labconco</td><td>7070020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1604</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>BD 353003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>15 cc tubo&nbsp;</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100ml</td><td>También llamado 'Histopaque'DPBS</td></tr> <tr><td></td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Littauer cortador de huesos 4.5" Recto</td><td>Roboz</td><td>RS-8480</td><td>para la cosecha de BM</td></tr><tr><td>Pinzas 4.5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>para la cosecha</td></tr><tr><td>de BM Tijeras 4.5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Para</td></tr><tr><td>microscopio</td> de cosecha BM <td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (H-2b), Female</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>8-12 semanas</td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de ketamina</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Solución estéril de xilacina</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA # 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofeno</td><td>Fort Dodge Salud Animal</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofeno</td><td>PrecisionDose</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Sagent Pharmaceticals</td><td>NDC 25021-400</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina (cloruro de sodio estéril al 0.9%)</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de cloruro de sodio al 0,9%</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica de vaselina</td><td>Productos veterinarios Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de yodo</td><td>Triad Disposables, Inc.</td><td>NDC 50730-3201-1</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación para bebidas alcohólicas</td><td>McKesson Corp.</td><td>NDC 68599-5805-1</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Tijera</td><td>fina FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de micro-adson</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de aplicación de pinza</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>S& T Pinza vascular</td><td>FST</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de muelle</td><td>FST</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Retractores Colibrí FST</td><td></td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - pinza</td><td>fina FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5/45 FST</td><td></td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Tish/ pinza</td><td>Micrinas</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Sutura monofilamento de poliamida negra, 10-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>TI638402</td><td>Para suturar el injerto</td></tr><tr><td>Sutura monofilamento de poliamida negra, 6-0</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>SN-1956</td><td>Para la musculatura y el cierre de la piel</td></tr><tr><td>Esponjas no tejidas</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático reabsorbible</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1,5 pulgadas, Aguja</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>25 G 1 pulgadas, Aguja</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1 pulgadas, Aguja</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Recirculador de agua caliente</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla calentadora</td><td>Gaymar</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr></tbody></table>

implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Andamios biodegradables sembrados con células mononucleares de médula ósea (BMC) se utilizan a menudo para la cirugía reconstructiva para tratar las anomalías cardíacas congénitas. Los resultados clínicos a largo plazo mostraron excelentes tasas de permeabilidad, sin embargo, con una incidencia significativa de la estenosis. Para investigar los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido vascular y prevenir el desarrollo de estenosis en la ingeniería tisular injertos vasculares (TEVGs), hemos desarrollado un modelo de ratón del injerto con aproximadamente 1 mm de diámetro interno. En primer lugar, los TEVGs fueron ensambladas a partir de los andamios tubulares biodegradables fabricadas a partir de un material no tejido de ácido poliglicólico sintieron malla recubierta con copolímero de ε-caprolactona y L-lactida. Los andamios se colocaron entonces en un liofilizador, la aspiradora durante 24 horas, y se almacenaron en un desecador hasta la siembra de células. En segundo lugar, la médula ósea se obtuvieron de ratones donantes y las células mononucleares se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad. En tercer lugar, aproximadamente un millón de células fueronsembradas en un andamio y se incubaron O / N. Por último, las células sembradas se implantan a continuación como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Los injertos implantados demostraron excelente permeabilidad (&gt; 90%) sin evidencia de complicaciones tromboembólicas o formación de aneurisma. Este modelo murino nos ayudará en la comprensión y la cuantificación de los mecanismos celulares y moleculares de la formación de neotejido en el TEVG.

Un diagrama esquemático de la implantación TEVG se muestra en la Figura 1. La médula ósea fue cosechada de un ratón donante y mono células nucleares se aislaron mediante centrifugación de densidad y luego sembró en un andamio biodegradable. Las células sembradas se incubaron O / N y se implantaron a un ratón receptor como una vena cava interposición de injerto inferior. La Figura 2 ilustra la microscopía electrónica de barrido del andamio PGA-P (CL / LA). El...

Para mejorar nuestro conocimiento de la formación de neotejido celular y molecular, un modelo murino de la TEVG fue desarrollado recientemente. Los injertos fueron implantados como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Este modelo logra resultados similares a los obtenidos en nuestra investigación clínica, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto.

Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar los mecanismos celulares y moleculares de la formación de nuevo tejido y el desarrollo de estenosis en injertos vasculares de ingeniería tisular. Primero, se ensamblan andamios tubulares biodegradables mediante el recubrimiento de una malla de fieltro no tejido de ácido poliglicólico con un copolímero de épsilon-caprolactona y L-lactida. Los siguientes pasos consisten en obtener médula ósea y aislar las células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad.Luego, aproximadamente un millón de células se siembran sobre el andamio y se incuban durante la noche. El paso final consiste en implantar el andamio sembrado como un injerto de interposición en la vena cava inferior. En última instancia, los resultados pueden mostrar la infiltración celular y el depósito de matriz extracelular en el injerto vascular diseñado mediante ingeniería tisular a través de inmunohistoquímica.Las implicaciones de esta técnica consisten en comprender mejor qué provoca la formación de estenosis en los injertos vasculares de tejido ingenieril y, a continuación, utilizar esta información para diseñar un injerto vascular de tejido ingenieril mejorado. A partir de nuestro estudio clínico, descubrimos que casi una cuarta parte de los pacientes que recibieron el conducto de tejido ingenieril desarrollaron un estrechamiento. Nuestro objetivo es eliminar este problema.Aunque este método puede aplicarse a la cardiopatía congénita, también puede utilizarse en la cirugía de derivación del colon o en el conducto para la alteración de la característica venosa. En general, las personas nuevas en este método han tenido dificultades debido a las delicadas técnicas de microcirugía requeridas durante la ósmosis venosa. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando buscábamos una forma mejor de caracterizar la formación de nuevo tejido y de prevenir el desarrollo de estenosis en los injertos vasculares de ingeniería tisular utilizados en nuestro ensayo clínico humano.Primero, comience a mezclar el copolímero de épsilon-caprolactona y L-lactida. Esto tarda entre 60 y 90 minutos en disolverse completamente. Mientras tanto, tome una lámina de ácido poliglicólico del congelador y corte varias secciones de cinco por ocho milímetros de ella.A continuación, corte el filtro de la punta de pipeta de 10 microlitros e inserte una aguja de 19 en la punta distal. Con pinzas, envuelva un trozo de fieltro de ácido poliglicólico alrededor de la aguja. Luego, utilizando una aguja rombada de 18, empuje cuidadosamente el fieltro hacia el extremo distal de la punta de pipeta alrededor de la aguja de 19.Cuando la solución del copolímero esté lista, cargue 40 microlitros en la parte superior de la punta de pipeta para saturar la felpa de ácido poliglicólico con la solución. Exprese las burbujas de aire con la pipeta hasta eliminar todas las burbujas. Transfiera todos los injertos preparados a un tubo de 50 mililitros con las cabezas de las agujas hacia abajo y colóquelo a menos 80 grados Celsius durante 20 minutos.Luego liofilice los injertos bajo vacío durante 24 horas. Al día siguiente, con la tapa de los tubos abierta, aísle los injertos de las agujas. Corte ambos extremos del injerto para obtener una sección limpia de cuatro a cinco milímetros.Luego deslice esos injertos nuevamente alrededor de sus agujas para que mantengan su forma. Almacene el injerto en un desecador y la noche anterior a que sean sembrados con células. Almacénelos bajo luz UV en una cabina de seguridad biológica proveniente de un ratón sacrificado.Recolecte todos los fémures y tibias en una placa con 10 mililitros de RPMI y corte ambos extremos de cada hueso. Y en una segunda placa, elimine la médula mediante lavado, inyectando RPMI con una aguja de calibre 25 a través de todos los huesos. Utilice un volumen total de tres mililitros de RPMI.Reúno toda la médula ósea en RPMI en un solo tubo de 15 mililitros y enjuago completamente la placa con dos mililitros adicionales de RPMI para obtener un volumen total de cinco mililitros. Cuente las células en esta muestra. A continuación, cargue cinco mililitros de fial en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y llénelo lentamente con cinco mililitros de médula ósea.Con RPMI, centrifugar el tubo durante 30 minutos a 528 G sin freno y a 24 grados Celsius. Recoger la capa intermedia del tubo, que contiene las células mononucleares. Diluir esta capa en una proporción uno a uno en PBS.Centrifugar la solución celular y resuspender el precipitado en cinco mililitros de PBS. Luego repetir la centrifugación. Diluir el precipitado celular en aproximadamente 200 microlitros de RPMI y contar las células dos veces.Utilice el valor promedio para concentrarlas a 1 millón de células por 10 microlitros de RPMI para el injerto. Utilice una hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad. Pese el ratón y aplique ketoprofeno como analgésico previo a la anestesia.Luego, anestesíelo mediante una inyección en el cuadrante inferior. Tras confirmar la anestesia con una compresión en el dedo del pie, corte el vello abdominal, lubrique los ojos y coloque al ratón en posición para la cirugía sobre una almohadilla envuelta con una toalla estéril forrada con polietileno. Limpie el área quirúrgica con tres frotaciones alternadas de betadine y alcohol.Luego, cubra al ratón, dejando expuesta solo la región abdominal. Comience la cirugía con una laparotomía de línea media. Realice una incisión desde debajo del apéndice xifoides hasta la región suprapúbica.A continuación, desplace y envuelva los intestinos con una gasa humedecida con solución salina. Luego, realice una disección roma del tejido claro de la aorta infrarrenal y la vena cava. Coloque pinzas en los extremos distales y en los extremos proximales de la aorta y la vena cava.Una vez fijados bruscamente, separe los dos vasos. Ahora continúe con el implante. A continuación, seccione la vena cava y, si es necesario, ligue las ramas aórticas abdominales con monofilamento de 10 nudos.Suture con agujas cónicas antes del cruce durante todo el proceso de implante. Lave frecuentemente el injerto con solución de heparina para prevenir la trombosis. Los primeros dos puntos de sutura en ambos lados del injerto son los pasos más importantes de todo el procedimiento.Cuando no se colocan con cuidado, es difícil separar las capas frontal y posterior de la vena cava inferior. Si las capas no se identifican claramente, existe una mayor probabilidad de suturarlas accidentalmente juntas. Recorte el material del injerto sobrante y asegure el injerto con puntos en ambos extremos.Agregue cuatro o cinco puntadas utilizando 10 t. Suture a lo largo del lado frontal del injerto. Déltele la vuelta y haga lo mismo a lo largo del lado posterior hasta completar la implantación.Retire el clamp proximal y controle la hemorragia con un agente hemostático absorbible. Cuando la hemorragia haya terminado por completo, retire el clamp distal y repita el control de la hemorragia. Asegúrese de que la sangre fluya a través del injerto antes de despertar al animal.Utilizando seis suturas de monofilamento de poliacrilamida negra de 6 puntos. Cierre la piel en dos capas. Ahora inyecte medio mililitro de suero salino por vía subcutánea para prevenir la deshidratación.Luego, transfiera el ratón a una jaula de recuperación con una almohadilla tibia. Cuando el ratón pueda caminar, transféralo a su jaula de origen y suministre ibuprofeno durante 48 horas. Un MEB del andamiaje muestra que el diámetro interno es de aproximadamente un milímetro y el espesor de la pared es de aproximadamente 0,17 milímetros. La porosidad del andamiaje fue del 78,5 % con un tamaño promedio de poro de 45 micrones.Inmediatamente después del implante, el injerto vascular diseñado mediante ingeniería tisular se observó bajo un microscopio. Dos semanas después, se volvió a observar. Aún mantenía su forma.Es evidente que el injerto se estaba degradando y siendo reemplazado gradualmente por nuevo tejido. De hecho, durante las dos semanas, la siembra celular mejoró la pervia del injerto en un 25 %; luego, el injerto fue extraído para su análisis histológico. La tinción con hematoxilina y eosina reveló tejido neoformado a lo largo del andamio, con tinciones positivas para tricrómica de Masson y hematoxilina.El tricrómico mostró elastina en las capas íntimas y colágeno en las capas mediales. La tinción con CD31 reveló un revestimiento de células endoteliales en la capa íntima. La tinción con alfa SMA mostró que el injerto también estaba poblado con músculo liso confluyente.Incluso la infiltración de macrófagos fue evidente, como se observa mediante la tinción con F four 80. Al final de este video, debería tener una mejor comprensión de cómo fabricar un injerto vascular tisular a pequeña escala, incluyendo los métodos para la fabricación de un andamio biodegradable a pequeña escala, los métodos para aislar células mononucleares derivadas de médula ósea y sembrarlas sobre el andamio. Y finalmente, deberíamos demostrarle los métodos para utilizar técnicas de microcirugía con el fin de implantar el injerto vascular tisular en el modelo murino.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 a 45 minutos. Otros métodos, como la implantación de injertos con interpretación aórtica, pueden realizarse posteriormente para investigar el desarrollo de injertos vasculares tisulares para la cirugía de derivación de la arteria coronaria. Durante el procedimiento, es importante recordar mantener la zona quirúrgica hidratada y lavar frecuentemente el injerto para prevenir la trombosis aguda. Estas técnicas allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran la formación de tejido vascular y la prevención de la estenosis en injertos vasculares tisulares.

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Investigación

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