Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

El objetivo general de este procedimiento es aspirar de forma segura el contenido de las células hematopoyéticas de la médula ósea del espacio de la médula femoral de un ratón vivo. Esto se logra con la primera boda, una jeringa de tuberculina con PBS. En el segundo paso, la pata del ratón se coloca cuidadosamente en el ángulo óptimo para la extracción de la médula ósea.

A continuación, las células hematopoyéticas se aspiran desde el espacio de la médula del fémur y los glóbulos rojos se agotan. En última instancia, la aspiración exitosa del contenido de la médula ósea se puede visualizar mediante análisis citométricos y citológicos de flujo. Demostrando el procedimiento estará el joven Rock Chung, un técnico muy talentoso de nuestro laboratorio.

La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente, como la recolección convencional de médula ósea, es que esta técnica permite la recuperación de una porción de las células hematopoyéticas de la médula ósea mientras se deja al animal vivo para su observación continua y análisis en serie. F, después de confirmar la sedación por pellizco en los dedos de los pies, aplique ungüento oftálmico en los ojos del ratón anestesiado para evitar la sequedad de la córnea y afeite la pierna para exponer la piel. A continuación, se realiza una preparación quirúrgica estéril de la piel frotando la zona con desinfectante de clorhexidina, seguido de un hisopo con alcohol.

Este proceso se completa tres veces y se utiliza una jeringa y una aguja estériles nuevas y sin abrir para cada animal. Confirmar que se ha alcanzado un plano anestésico adecuado. A continuación, humedece una jeringa de tuberculina de 0,5 mililitros con PBS estéril y luego aspira e inmediatamente elimina de 200 a 500 mililitros de la solución salina dos o tres veces.

A continuación, utilice uno de los dos últimos dedos de una mano para doblar suavemente la tibia lejos del fémur para facilitar la exposición del espacio condilar del fémur y la inserción de la aguja. Ahora inserte la aguja a través del tendón rotuliano para que quede alojado de forma segura entre los dos cóndilos del fémur. Use el pulgar y el dedo índice de la otra mano para sostener la diáfisis cerca de la epífisis del fémur para permitir que la aguja se inserte fácilmente en el cuerpo del hueso.

Si no se ve sangre en la jeringa, es probable que haya un pequeño fragmento de hueso o tejido atascado en la aguja. Esto se puede quitar de la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo en PBS. Si el tejido no se puede desprender de la jeringa, use una aguja y una jeringa nuevas.

Nuevamente, humedezca la jeringa con 200 a 500 microlitros de PBS. A continuación, gire la aguja en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras la empuja contra el espacio condilar para que quede paralela a la diáfisis del fémur. Para facilitar la recuperación del contenido de la médula ósea de la diáfisis del fémur.

Gire la aguja en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras la empuja lentamente hacia la cavidad de la médula femoral. Confirme la posición correcta de la aguja moviendo suavemente la jeringa lateralmente. Luego, tire suavemente del émbolo de la aguja hacia atrás, creando una presión negativa mientras mueve la aguja hacia adelante y hacia atrás dentro de la cavidad de la médula ósea.

El éxito de la aspiración se confirmará por la aparición de sangre en la parte superior de la aguja en la base de la jeringa. Una vez que la médula ósea se haya aspirado con éxito del fémur, retire la aguja del hueso y transfiera la médula ósea aspirada a una micro fuga precargada con 500 microlitros de PBS en hielo. Después de administrar el analgésico, deje que el ratón se recupere bajo una lámpara de calor antes de devolver a los ratones a la zona de alojamiento.

Asegúrese de que puedan deambular y alcanzar la comida y el agua. Luego, regrese el ratón a su jaula y observe al animal en busca de signos de angustia o infección después del procedimiento durante las próximas 24 horas. Mientras tanto, centrifuga las células de la médula ósea, aspira el PBS con cuidado y vuelve a suspender el pellet.

En 500 microlitros de tampón de lisis de glóbulos rojos después de 10 minutos, lave las células en un mililitro de PBS. El pellet contiene médula ósea de células mononucleares que se pueden utilizar para análisis experimentales. Estas primeras figuras ilustran cómo se pueden observar tipos y proporciones similares de células a granel y células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante análisis morfológicos y de citometría de flujo utilizando la aspiración de médula ósea femoral o la recolección convencional de médula ósea.

Aquí se muestra el porcentaje de subpoblaciones de linaje negativo para SKA, una C positiva, kit positivo y progenitores mieloides como frecuencia del total de células vivas en tres aspiraciones independientes y recolección de médula convencional. Estos datos revelan una disminución de las subpoblaciones de progenitores mieloides y SKA uno negativo para el linaje, C positivo y progenitores mieloides de la médula ósea recolectada por aspiración femoral en comparación con la recolección convencional de médula. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa para la población.

Sin embargo, la clasificación de las células cki positivas para ska uno de linaje negativo, seguida de un cultivo ex vivo en metilcelulosa, da como resultado números de colonias y tipos de células similares obtenidos por aspiración de médula ósea femoral. Al igual que con la recolección convencional de médula ósea, los tipos de colonias observados y enumerados en ambos cultivos incluyen unidades formadoras de colonias de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacariocitos, unidades formadoras de colonias de granulocitos y monocitos y unidades formadoras de estallido eritroide. Esta técnica se puede realizar en 10 minutos por ratón si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la inyección intrafemoral de médula ósea, para responder a preguntas adicionales, como ¿cuál es el efecto del xenoinjerto en células hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos?