Name: Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a aspirar médula ósea femoral en ratones vivos sin sacrificarlos. Este método permite estudios longitudinales de hematopoyesis y análisis seriados de poblaciones celulares mediante citometría de flujo.

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O.A.-W. está respaldado por un Premio al Investigador Clínico K08 de los NIH (1K08CA160647-01), un Premio de Becario Postdoctoral del Departamento de Defensa de EE. UU. en Investigación de Insuficiencia de Médula Ósea (W81XWH-12-1-0041), el Programa de Investigadores Josie Roberston y un Premio al Investigador Clínico Damon Runyon con el apoyo de la Fundación Evan.

Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de conformidad con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering. 1. Aspiración de médula ósea (MO) Las células del Fémur <ol><li> Se anestesia el ratón que se someterá a la aspiración de médula ósea femoral con isoflurano (1-4%), administrado con un vaporizador de precisión. Profundidad de la anestesia debe ser monitoreado cada 5-10 minutos durante todo el procedimiento por la observación de que no hay ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación quirúrgica y / o la oreja, dedo del pie, y de pinzamiento del rabo. La anestesia se indujo con isoflurano y también mantiene durante todo el procedimiento con isoflurano. Una dosis previa al procedimiento preventivo de la buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg por vía subcutánea cada 6-12 h se puede utilizar para prevenir el dolor asociado con el procedimiento como un adjUNCT al Carprofeno. </li><li> Aplicar pomada oftálmica a los ojos del ratón después de la inducción de la anestesia para evitar el secado de la córnea. </li><li> La piel es cuidadosamente cortados por un área de piel de aproximadamente 150% mayor que el área de la zona de la aspiración previsto. Piel floja se elimina con una gasa húmeda. Por favor, mantenga el ratón sobre un relleno aislante de agua caliente que circula u otra superficie con control termostático de seguridad para prevenir la hipotermia durante el procedimiento. </li><li> Desinfectar la pierna entera que contiene el fémur, que se someterá a la aspiración con tres conjuntos de matorrales alterna (alternando con ya sea un povidona-yodo (Betadine) o una de clorhexidina (Nolvasan) de fregado y 70% de alcohol isopropílico o 70% de etanol empapado esponjas de gasa). </li><li> Moje un 0,5 ml de tuberculina jeringa (volumen: 0,5 cc; calibre: 27,5 G) con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), antes de aspirar el BM. Llene la jeringa con 200-500 l de PBS y expulsar inmediatamente a la PBS. Repita este procedimiento 2-3 times. </li><li> Mantenga la inclinación de la tibia del fémur empujando la tibia, ya sea con el dedo anular o el dedo meñique. Confirme que un plano anestésico adecuado se ha alcanzado. La jeringa se lleva a cabo utilizando el pulgar y el dedo índice. Esto permite que los cóndilos a estar expuestos y facilita la inserción de la aguja. </li><li> Después de humedecer la jeringa, insertar la aguja a través del tendón rotuliano de manera que la aguja está alojada de forma segura entre los dos cóndilos del fémur. Por la celebración de la diáfisis cerca de la epífisis del fémur con el pulgar y el dedo índice, la aguja se inserta en el eje del fémur fácilmente. </li><li> Girar la aguja hacia fuera y hacia arriba de manera que es paralelo con el eje del fémur. Esta acción facilita la recuperación de los contenidos de la médula ósea del eje del fémur. </li><li> Gire la aguja hacia la derecha y hacia la izquierda mientras empuja lentamente en la cavidad medular femoral. Confirmar la colocación correcta de la aguja moviendo suavemente el SYRinge lateralmente. </li><li> Tire suavemente el émbolo de la aguja hacia atrás, creando una presión negativa, mientras se mueve la aguja de un lado a otro dentro de la cavidad del BM. Nota: El volumen de aspirado de BM será de aproximadamente 5 l que típicamente corresponde a 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares. El éxito de aspiración será confirmada visualmente por la aparición de sangre en la parte superior de la aguja en la base de la jeringa. Si no hay sangre se ve en la jeringa es probable que un fragmento de hueso o tejido pequeña se ha quedado atascado en la aguja. Esto puede ser retirado de la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo en PBS (esta es una razón por la jeringa debe ser previamente llenada con PBS antes de aspirar el BM). Si el tejido no puede ser desalojado de la jeringa, use una nueva aguja y jeringa (de nuevo mojar la jeringa con 200-500 l de PBS). </li><li> Una vez que BM se aspira con éxito del fémur, retire la aguja y la jeringa del fémur y el ratón. </li><li> Mueva aspirado BM a un pr tubo de microcentrífugaefilled con 500 l de PBS. Para la mayoría de las aplicaciones, las células de la MO entonces deben mantenerse en hielo hasta su procesamiento posterior, si es posible. </li><li> Tras la finalización del procedimiento, administrar analgésico con carprofeno 5 mg / kg por vía subcutánea. A continuación, retire del ratón de la anestesia y colocar en un cojín calentado hasta que se recupere completamente. NOTA: No debe haber ninguna complicación o sufrimiento experimentado tras el procedimiento de aspiración si se hace correctamente. </li><li> Antes de devolver los ratones con el área de vivienda, aseguran que son capaces de deambular y llegar a los alimentos y el agua. Observar los ratones en busca de signos de malestar o procedimiento después de la infección en la siguiente 24 horas. Las señales incluyen: sangrado constante, anemia, letargo. Si alguno de estos síntomas son vistos después del procedimiento, el animal (s) debe ser sacrificado. Nota: la aspiración BM / muestreo se puede repetir, pero la repetición del procedimiento se debe realizar en el fémur opuesto para evitar traumatismos repetidos en la misma pierna. Hay poca información disponible sobre la frequency que la aspiración BM se puede realizar. Aspiración de médula ósea femoral generalmente se repite con más frecuencia de cada 2 semanas. </li></ol> 2. Evaluación del contenido celular en células de aspirado BM <ol><li> Precipitar las células recuperadas de BM aspiración y colocar en un tubo de microcentrífuga por centrifugación a 300 g durante 5 min a 4 ° C o RT. </li><li> Aspirar el sobrenadante y luego resuspender el sedimento en 500 l de ACK sangre roja tampón de lisis celular (&quot;amonio-cloruro de potasio&quot; tampón de lisis). </li><li> Se incuban las células en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 10 min y a continuación, añadir 1 ml de PBS y centrifugar la mezcla de nuevo a 300 xg durante 5 min a 4 º C o temperatura ambiente. Nota: El pellet lisado de glóbulos rojos ahora consiste en células mononucleares de BM. Estos pueden ser resuspendidas para la tinción de FACS, el recuento de células, trasplante, análisis de citospina y / o cualquier otro uso (tal como se utilizarían las células BM recogidas de ratones sacrificados). </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

De serie aspiración BM es un procedimiento de rutina crítica para investigación clínica de los trastornos hematológicos en seres humanos. La capacidad de realizar un muestreo en serie análoga de BM en ratones para la caracterización de la composición celular y componentes de la BM a lo largo de largos experimentos es también muy valiosa. Este procedimiento es útil para la caracterización de HSPC de sin sacrificar el ratón, sino también para detectar la presencia de tipos de células adicionales en el BM en casos en los q...

Todas las células sanguíneas se derivan de células madre hematopoyéticas (HSC). Los procedimientos que permiten el acceso a la médula ósea (MO), el sitio de la gran mayoría de las HSC en ratones y hombres, sin requerir el sacrificio de animales, proporcionan un recurso para monitorear el origen de la hematopoyesis en serie. El objetivo general del procedimiento descrito aquí es proporcionar un protocolo detallado para el muestreo de células BM del fémur de ratones vivos que proporcione material representativo de las células que se recuperarían mediante la recolección convencional de células BM mediante el sacrificio de los ratones. La ventaja de este procedimiento sobre la recolección convencional de células BM es que este procedimiento no requiere el sacrificio de ratones y, por lo tanto, permite el estudio longitudinal del compartimento de la médula ósea de los ratones a lo largo del tiempo. 
Aunque este procedimiento de aspiración de médula ósea murina se ha utilizado en varios estudios y se ha descrito anteriormente (véase Sundberg et al. Para una revisión histórica1), no se han publicado previamente procedimientos formales paso a paso que ilustren esta técnica. Este protocolo permite la toma de muestras seriadas rutinarias de la MO con fines tales como la evaluación del injerto en la MO de las células introducidas exógenamente en el ratón (como se haría en los estudios de xenoinjertos, por ejemplo2,3), el análisis del quimerismo en la MO para su comparación con el de la sangre periférica (donde los resultados no son necesariamente congruentes), el seguimiento de la abundancia de tipos celulares específicos normalmente enriquecidos en la médula, como las células madre hematopoyéticas y progenitoras, y recuperación de células BM para cultivo ex vivo y/o trasplante. Además, la evaluación del contenido de médula puede ser muy útil en modelos murinos de enfermedad hematológica, ya que la aspiración es útil para evaluar la carga de enfermedad hematológica en momentos en que la enfermedad puede no ser evidente en la sangre periférica3-5. Además, esta técnica puede utilizarse para evaluar la respuesta de la enfermedad hematológica en la médula ósea a los fármacos administrados en estudios terapéuticos. Por lo tanto, el procedimiento descrito aquí es ideal para los investigadores que desean obtener acceso a las células hematopoyéticas de la médula ósea de ratones para análisis citológicos, análisis de citometría de flujo, cultivo in vitro y/o estudios de trasplante in vivo sin requerir sacrificio o daño a los ratones. 
El protocolo para la toma de muestras de BM descrito aquí es bastante similar a la técnica utilizada para la inyección intrafemoral de material directamente en la cavidad medular3,6. La diferencia clave es que este protocolo detalla el procedimiento para la extracción de células de la médula ósea en lugar de instilar material directamente en el espacio de la cavidad de la médula, como se hace con la inyección intrafemoral.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón de lisis</td><td>Hecho</td><td></td><td>en casa en 1 L. Ajuste el pH 7.2 ~ 7.4 y filtre estéril con 0.22 &mu; m Filtro de vacío.</td></tr><tr><td>8,3 g Cloruro de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g Bicarbonato de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0,5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Jeringa de tuberculina 27,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células estériles 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Aguja roma</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Aguja PrecisionGlide 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Jeringa Luer-Lok</td> punta <td>Becton Dickinson 309657</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa tratada sin cultivo de tejidos, 6 pocillos</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml tubos&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>Tinción FACS</td></tr><tr><td>12 x 75 mm Tubos de 5 ml con tapón de filtro de células</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>Tinción FACS</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Para el cultivo de metocelulosa</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Crescent Chemical Compañía</td><td>C11045850</td><td>1 dosis (5 mg/kg) &nbsp;</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada veterinaria Puralube (pomada oftálmica estéril de vaselina)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

femoral aspiración de médula ósea en ratones vivos

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

La toma de muestras seriadas de la composición celular de la médula ósea (BM) es un procedimiento de rutina crítico para la hematología clínica. Este protocolo describe un procedimiento técnico detallado paso a paso para un procedimiento análogo en ratones vivos que permite la caracterización en serie de las células presentes en el BM. Este procedimiento facilita los estudios dirigidos a detectar la presencia de células administradas exógenamente dentro de la BM de ratones, como se haría en estudios de xenoinjertos, por ejemplo. Además, este procedimiento permite la recuperación y caracterización de células enriquecidas en el BM, como las células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) sin sacrificar ratones. Dado que la composición celular de la sangre periférica no refleja necesariamente las proporciones y los tipos de células madre y progenitoras presentes en la médula, los procedimientos que proporcionan acceso a este compartimento sin requerir la terminación de los ratones son muy útiles. Aquí se ilustra el uso de la aspiración de médula ósea femoral para el análisis citológico de las células de la médula, la caracterización citométrica de flujo del compartimento hematopoyético/progenitor y el cultivo de HSPC clasificadas obtenidas por aspiración de MO femoral en comparación con la recolección convencional de médula.

Femoral BM aspiración de un ratón C57/B6 vivo se utilizó para obtener células mononucleares de BM seguido de la cosecha BM convencional del mismo ratón después del sacrificio. Células mononucleares BM obtenidos por los dos métodos fueron analizadas mediante (1) el análisis citológico de células de la MO, (2) determinar la frecuencia relativa de células madre / progenitoras hematopoyéticas (HSPCs), y (3) el cultivo ex vivo de HSPCs ordenados. En el experimento, Sca1 de linaje negativo última + c-KIT + c...

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

El objetivo general de este procedimiento consiste en aspirar de forma segura el contenido de células hematopoyéticas de la médula ósea desde el espacio medular del fémur de un ratón vivo. Esto se logra primero acoplando una jeringa de tuberculina con PBS. En el segundo paso, la pata del ratón se coloca cuidadosamente en el ángulo óptimo para la recuperación de la médula ósea.Las células hematopoyéticas se aspiran luego del espacio medular del fémur y se agotan los glóbulos rojos. En última instancia, la aspiración exitosa del contenido de la médula ósea puede visualizarse mediante análisis citométricos y citológicos. El procedimiento será demostrado por el joven Rock Chung, un técnico muy talentoso de nuestro laboratorio.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la extracción convencional de médula ósea, es que permite recuperar una fracción de las células hematopoyéticas de la médula ósea dejando vivo al animal para observación continua y análisis seriados. A continuación, tras confirmar la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, aplique una pomada oftálmica en los ojos del ratón anestesiado para prevenir el secado corneal y afeite la pata para exponer la piel. Luego se realiza la preparación quirúrgica estéril de la piel frotando la zona con desinfectante de clorhexidina, seguido de una toallita con alcohol.Este proceso se completa tres veces y se utiliza una jeringa estéril nueva y sin abrir, junto con una aguja, para cada animal. Confirme que se ha alcanzado un plano anestésico adecuado. A continuación, humedezca una jeringa de tuberculina de 0,5 mililitros con PBS estéril y luego aspire y expulse inmediatamente entre 200 y 500 mililitros de la solución salina dos o tres veces.Luego, utilice uno de los dos últimos dedos de una mano para doblar suavemente la tibia alejándola del fémur, facilitando así la exposición del espacio condíleo del fémur y la inserción de la aguja. A continuación, inserte la aguja a través del tendón patelar de manera que quede firmemente colocada entre los dos cóndilos del fémur. Utilice el pulgar y el índice de la otra mano para sostener la diáfisis cerca de la epífisis del fémur, permitiendo que la aguja se inserte fácilmente en el cuerpo del hueso.Si no se observa sangre en la jeringa, es probable que un pequeño fragmento óseo o de tejido esté obstruyendo la aguja. Este fragmento puede eliminarse moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo en PBS. Si el tejido no puede desalojarse de la jeringa, utilice una aguja y jeringa nuevas.Nuevamente, humedezca la jeringa con 200 a 500 microlitros de PBS. Luego gire la aguja en sentido horario y antihorario mientras la empuja contra el espacio condilar para que quede paralela al eje del fémur. Para facilitar la recuperación del contenido de la médula ósea del eje del fémur.Gire la aguja en sentido horario y antihorario mientras la introduce lentamente en la cavidad medular del fémur. Confirme la posición correcta de la aguja moviendo suavemente la jeringa lateralmente. Luego, tire suavemente del émbolo de la aguja hacia atrás, creando una presión negativa mientras mueve la aguja hacia adelante y hacia atrás dentro de la cavidad de la médula ósea.La aspiración exitosa se confirmará por la aparición de sangre en la parte superior de la aguja, en la base de la jeringa. Una vez que se haya aspirado con éxito la médula ósea del fémur, retire la aguja del hueso y transfiera la médula ósea aspirada a un tubo microcentrífugo previamente llenado con 500 microlitros de PBS sobre hielo. Después de administrar el analgésico, permita que el ratón se recupere bajo una lámpara de calor antes de devolverlo al área de alojamiento.Asegúrese de que puedan desplazarse y alcanzar el alimento y el agua. Luego, devuelva el ratón a su jaula y observe al animal en busca de signos de malestar o infección tras el procedimiento durante las próximas 24 horas. Mientras tanto, centrifugue las células de médula ósea, aspire cuidadosamente el PBS y re suspenda el precipitado.En 500 microlitros de tampón de lisis de glóbulos rojos después de 10 minutos, lave las células con un mililitro de PBS. El precipitado contiene médula ósea de células mononucleares que pueden utilizarse para análisis experimentales. Estas primeras figuras ilustran cómo se pueden observar tipos y proporciones similares de células totales y de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante análisis morfológicos y citométricos de flujo, ya sea mediante aspiración de médula ósea femoral o mediante extracción convencional de médula ósea.Aquí se muestra el porcentaje de subpoblaciones de progenitores mieloides negativas para linaje, positivas para SKA uno, positivas para C kit, como frecuencia de células vivas totales en tres aspiraciones independientes y en la recolección convencional de médula. Estos datos revelan una disminución en las subpoblaciones de progenitores negativos para linaje, positivos para SKA uno, positivos para C kit y progenitores mieloides en la médula ósea recolectada mediante aspiración femoral en comparación con la recolección convencional de médula. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa para la población.Sin embargo, la clasificación de células negativas para linaje, positivas para ska uno y positivas para cki, seguida de cultivo ex vivo en metilcelulosa, produce un número similar de colonias y tipos celulares obtenidos mediante aspiración de médula ósea femoral. Al igual que con la extracción convencional de médula ósea, los tipos de colonias observados y enumerados en ambos cultivos incluyen unidades formadoras de colonias de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacariocitos, unidades formadoras de colonias de granulocitos y monocitos, y unidades formadoras de brotes eritroides Un maestro. Esta técnica puede realizarse en 10 minutos por ratón si se lleva a cabo adecuadamente siguiendo este procedimiento.Otros métodos como la inyección intraósea de médula ósea se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como cuál es el efecto del xenoinjerto de células hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Los modelos animales se utilizan con frecuencia para estudiar la metástasis del cáncer de hueso. En este protocolo vamos a describir dos métodos comunes de la inoculación del tumor para los estudios de metástasis óseas y describir brevemente algunos de los análisis utilizados para supervisar y cuantificar estos modelos.

Los modelos de metástasis en los huesos

Este video describe un protocolo detallado para aislar médula ósea entera fresca de las extremidades traseras del ratón para investigar defectos completos de la MO en pacientes con trastornos sanguíneos como la leucemia.

Cosecha de médula ósea de la extremidad trasera del ratón

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Se presenta una estrategia para analizar cuantitativamente los datos histológicos en la médula ósea. La microscopía confocal de células marcadas con fluorescencia en secciones de tejido da como resultado imágenes bidimensionales, que se analizan automáticamente. Los análisis de colocalización de diferentes tipos de células se comparan con los datos de imágenes simuladas, lo que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones celulares.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

El modelo murino fractura cerrada de fémur es una poderosa plataforma para el estudio de fracturas y nuevas estrategias terapéuticas para acelerar la regeneración ósea. El objetivo de este protocolo quirúrgico es generar fracturas femorales cerradas unilaterales en ratones con una varilla intramedular de acero para estabilizar el fémur.

La generación de fracturas femorales cerradas en ratones: un modelo para el estudio del hueso curativo

Aquí, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea fresca (BM) aislada del ratón o humana para el análisis de citometría de masa de alta dimensión (citometría por tiempo de vuelo, CyTOF) de células de linaje neutrófilo.

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.

Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

Aprende a aspirar médula ósea femoral en ratones vivos sin sacrificarlos. Este método permite estudios longitudinales de hematopoyesis y análisis seriados de poblaciones celulares mediante citometría de flujo.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

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