Name: En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Aprende a rastrear clones hematopoyéticos marcados con cinco proteínas fluorescentes en tejidos vivos mediante microscopía confocal y multifotónica. Este método permite visualizar la evolución clonal y la arquitectura de la médula ósea durante la regeneración.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a Boris Fehse (Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemania) por proporcionar los cinco plásmidos vectoriales LeGO; Christian A. Combs y Neal S. Young (NHLBI, NIH) por sus conversaciones, apoyo y aliento a lo largo de este estudio, y Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) por su ayuda con las inyecciones en las venas de cola.

Todos los ratones fueron alojados y manipulen de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y se inscribió en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales NHLBI. Mujer B6.SJL-PTPRC (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) y ratones C57BL / 6, 6-12 semanas de edad, fueron utilizados como donante y receptor, respectivamente. Una lista de materiales, reactivos y equipo se proporciona en la Tabla 1. 1. LEGO Transducción de Ratón HSPCs y Trasplante de Médula Ósea Lleve a cabo los procedimientos descritos a continuación en un nivel de bioseguridad certificada 2 (BSL-2) gabinete (campana de cultivo de tejidos). <ol><li> Producción de LEGO vectores que codifican 5 fps <ol><li> Utilice la lentiviral &quot;Gene Ontología&quot; (LEGO) plásmidos vectores, cada uno codifica una FP diferente de un fuerte promotor SFFV constitutiva, incluyendo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), y Lego-C2 (mCherry) amablemente proporcionados por el Dr. Boris Fehse (Centro Médico Universitario Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemania); ahora también disponible en Addgene 5-7. </li><li> Para producir vectores de LEGO, semilla de 5 x 10 6 células 293T en placas de 10 cm (12 utilizar platos para cada vector) 24 h antes de la transfección en 8 ml de medio de I10 (IMDM suplementado con 10% de FCS y glutamina / penicilina / estreptomicina). </li><li> Transfectar las células con fosfato de calcio utilizando las recomendaciones del kit CAPHOS ligeramente modificados: <ol><li> Para cada mezcla de la placa 15 mg vector de Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT y 1 mg plásmidos pMD2.G-VSV-G en presencia de 50 l de 2,5 M CaCl 2, y añadir agua para proporcionar un volumen total de 500 l. </li><li> Plásmidos de ADN precipitado con 500 l de 2x HeBS (solución salina tamponada con HEPES) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente antes de añadir a cada placa de células 293T. </li><li> Se incuban las células para6 horas en un 37 ° C 5% de CO2; eliminar el medio y añadir nueva cultura mediática 6 h después de la transfección. </li></ol></li><li> Recoger los sobrenadantes del cultivo que contiene partículas lentivirales de cada placa, a diario, durante 3 días. Cada colección sobrenadante día siguiente añadir medios I10 fresca a cada placa. <ol><li> Se filtra a través de 0,22 micras poros, piscina y concentrarse sobrenadantes por ultracentrifugación en un rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg y 4 ° C. </li><li> Resuspender los sobrenadantes en 1 ml de medio StemSpan. Alícuota de los stocks de lentivirus en 200 l y se almacenan a -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> La titulación de Lentiviral Particles Determinar el título de partículas de vector de Lego en sobrenadantes recogidos a través de la cuantificación de la transducción de unidades / ml utilizando células NIH3T3. Los títulos permiten el cálculo del volumen de cada sobrenadante del vector necesaria para dar lugar a la multiplicidad relativa deseada de infección (MOI) de objetivo experimentalcélulas. <ol><li> Plate 5 x 10 4 NIH3T3 células por pocillo (placa de 12 pocillos) en 2 ml de medio I10 un día antes de la valoración. </li><li> Preparar diluciones en serie de 5 veces de sobrenadantes de vectores en medios I10 suplementado con sulfato de protamina (4 mg / ml 1,000x es). </li><li> Retire el papel de las células, y reemplazar con 500 l de diluciones de sobrenadante que contiene el equivalente a 2, 0.8, 0.32, y 0.128 l de virus concentrado. </li><li> Determinar el número (n) de células presentes por pocillo en el momento de la transducción, contando así un control. </li><li> 6 horas después de la transducción, añadir 2 ml de medio I10 e incubar durante 3 días a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Recoger las células de cada pocillo usando Tripsina-EDTA, y determinar el porcentaje de células fluorescentes (% FP) a través de citometría de flujo. </li><li> Calcular el título de la siguiente manera, el promedio de los títulos obtenidos para cada pocillo (dilución) resultantes en un FP% entre 1 y 50%: de títulos (partículas de vector / ml) = nx% FP / volumen de sobrenadante de vector (ml). La media de los títulos obtenidos para cada dilución si el FP% está entre 1 y 50%. </li></ol></li><li> Ratón Colección celular, purificación, Transducción y Trasplante (que se muestra esquemáticamente en la Figura 1A adaptado de Malide et al. 4). <ol><li> Sacrificar los ratones donantes mediante un procedimiento adecuado. Cosecha de médula ósea de las extremidades anteriores y posteriores: diseccionar húmeros, fémures y tibias, eliminar completamente todo músculo, ligamentos y el exceso de tejido de los huesos, corte a través del extremo de cada hueso lo más cerca posible a la articulación, y lavar la médula ósea de el hueso usando una aguja de 27-0 en una jeringa que contiene medios I10. </li><li> Pellet enteras las células de la médula ósea durante 10 min a 500 xg, 4 ° C y lisar glóbulos rojos dos veces con 50 ml de tampón ACK. Resuspender las células en 10 ml de medio I10. </li><li> Purificar células progenitoras (Lin-) linaje negativas con el kit de agotamiento MACS linaje de acuerdo con un protoco kit modificadol: <ol><li> Utilice 30 l de microperlas anti-biotina en lugar de 10 l / 10 7 células; completar las etapas de lavado con los medios de comunicación I2 (IMDM suplementado con FCS al 2%) en lugar de tampón. </li><li> Inserte una etapa de lavado entre la incubación con Cocktail biotina-anticuerpo y la incubación con anti-biotina microperlas; y equilibrar la columna con tampón en lugar de I10. </li></ol></li><li> Cultura células Lin-durante 48 horas a una densidad inicial de 5 x 10 5 células / ml en medio StemSpan suplementado con 10 ng / IL-3 murina ml, 100 ng / ml de IL-11 murina, 100 ng / ml Flt-3 humana ligando, y 50 ng / factor de células madre murina ml. </li><li> Transferencia de 1 a 4 x 10 5 células a 12-así placas revestidas con RetroNectin y transducir con sobrenadantes de Lego, cada uno a una multiplicidad de infección (MOI) de 6-7 para lograr la eficiencia de expresión del 50% para cada FP, en presencia de StemSpan medios de comunicación y citoquinas detallan arriba y 4 mg / ml de sulfato de protamina. </li><li> Transducir célulascon cada vector de Lego de forma individual como se describe en el paso 1.3.5 y mezclar las células después de la transducción (llamado Mix) o co-transducir células con todos los sobrenadantes 5 LEGO vector simultáneamente (denominado Co). Retire las células 24 horas más tarde, lavar una vez con medio StemSpan sin citoquinas, y volver a suspender en medios StemSpan sin citoquinas para el trasplante, o transferirlos a medio fresco con citoquinas, y la cultura durante 96 horas adicionales antes de la microscopía confocal y citometría de flujo. <ol><li> Lleve a cabo el trasplante de médula ósea mediante la infusión de transducidas Lin- HSPCs mediante inyección en la vena de la cola en los destinatarios previamente irradiados 11 Gy dosis única (6-18 hr antes del trasplante) los destinatarios, en un volumen de 100 l, a una dosis de células por ratón correspondiente a 1 células -4 x 10 5 Lin- originalmente plateado para la transducción. En cada experimento, trasplantar toda una cohorte de animales con la misma población de células transducidas BM donantes. </li><li> Para la caracterización in vitro de H transducidasSPC, cultivar las células durante otros 4-5 días en StemSpan suplementado con las citoquinas y analizar por citometría de flujo para la eficacia de transducción, y por microscopía a la diversidad de colores. <ol><li> Sacrificar los ratones individuales y recuperar los tejidos y órganos para formación de imágenes, en varios puntos de tiempo de hasta 120 días post-trasplante. <ol><li> Rociar con etanol la piel del ratón y incisión de la piel en el lado ventral evitar la difusión del cabello. </li><li> Diseccionar y los impuestos especiales de acuerdo con los procedimientos estándar del bazo, los ganglios linfáticos poplíteos, pulmones, el corazón, la piel, el tejido adiposo, el músculo esquelético, el riñón, el hígado, así como la cabeza para el acceso a la bóveda craneal. </li><li> Como alternativa, utilice bóveda craneal o la creación de una ventana ósea para imágenes en vivo en varias ocasiones con el tiempo 2,8,9 u órganos superficiales de la imagen tales como los nodos de la piel y de los ganglios en el animal vivo. </li></ol></li><li> Coloca los órganos individuales en 35 mm cultura platos número 0 cubierta de cristal en 50-10056; l PBS para obtener imágenes de ellos intactos sin seccionar, fijación o procesamiento adicional como se describe en el paso 2.5. </li><li> Para imagen volumétrica, mantener los órganos en PBS en frío hasta su uso. Para time-lapse de proceder de inmediato a la formación de imágenes órganos en DMEM, 10% FBS que contenía HEPES 20 a 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. confocal y microscopía de dos fotones y Análisis de Imágenes <ol><li> Realizar imágenes de microscopía utilizando un sistema de cinco canales y confocal Leica SP5 multifotón equipado con varias líneas de argón, diodo de 561 nm, 594 nm HeNe, y HeNe 633 nm láseres visibles. El uso en modo 2-fotón, un femtosegundo pulsada Ti: Zafiro (Ti-Sa) láser, sintonizable para la excitación de 680 a 1080 nm con corrección de dispersión. Uso en experimentos que implican los MF desplazada al rojo (tdTomato y mCherry), un oscilador paramétrico óptico (OPO) de láser para ampliar el rango de longitud de onda de salida en cuanto a 1,030-1,300 nm, secuencialmente o simultáneamente con tque Ti-Sa láser. </li><li> Image diversos tejidos usando un HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objetivo de inmersión de agua (WD = 2,5 mm), una PLAPO-CS-HC 20x / 0,70 NA objetivo seco (WD = 0,6 mm), o HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetivo de inmersión en agua (WD = 0,6 mm). </li><li> Obtener espectros de fluorescencia confocal de recogida pilas lambda (xyλ) de luz emitida en 5 nm-anchos de banda del espectro visible a partir de células BM transducidas con un vector único FP LEGO, así como de control, no trasplantados BM. <ol><li> Procesar imágenes con el software v2.4.1 Leica LAS-AF para crear espectros de referencia de los 5 programas marco, así como de autofluorescencia (Figura 2A). El uso de los espectros individuales FP y la diferencia de brillo de fluorescencia (expresado en% de EGFP) de Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) y mCherry (47%) establece 5 canales de imágenes secuenciales de la siguiente manera: Cerulean (458/468 a 482 nm), EGFP (488/496 a 514 nm), Venus (514/523 a 558 nm), tdTomato (561/579 a 597 nm), y mCherry (594/618 a 670 nm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li><li> Validar la separación los MF precisa, como las células transducidas con cada FP individuo sólo son visibles en el canal correspondiente y ausente del resto (Figura 2C). Además, este enfoque multi-canal definido crea un único 5-canales &quot;Colorprint&quot; que permite el análisis posterior de color y de seguimiento clonal y tiene la ventaja de reducir los tiempos de adquisición en comparación con la imagen espectral. </li></ol></li><li> Separada de emisión de fluorescencia, en el modo de 2 fotones, por alta eficiencia espejos dicroicos de encargo y recoger con un detector de cuatro canales no descanned (NDD) como sigue: un espejo dicroico a 568 nm seguido de un espejo dicroico a 465 nm, seguido por un 452/45 nm filtro de emisión de SHG o autofluorescencia y Cerulean, un filtro de 525/40 nm de emisión para EGFP o Venus, y un espejo dicroico 648 nm y 620/60 nm filtro de emisión para tdTomato o mCherry. <ol><li> Revelar información estructural mediante microscopía de dos fotones iimágenes de contraste ntrinsic (como se describió anteriormente) de la autofluorescencia del tejido de la elastina, NADH, (emocionado a 780 nm), y segundo armónico de la señal (SHG) de colágeno óseo y fibrilar (emocionado en 920 nm o 860 nm recogido en un dispersada-generados dirección) 10,11. </li></ol></li><li> Para la interpretación del volumen 3D, recoger serie de imágenes xyz (típicamente 1 x 1 x 4 m 3 tamaño voxel) a lo largo del eje z en 5 micras intervalos en un rango de profundidades (150-300 m) a lo largo de la médula ósea y otros tejidos, en grandes regiones utilizando la función de baldosas del software para generar automáticamente los volúmenes cosidos que comprenden una fosas toda esternón, aproximadamente 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) y 300 m (z) (Figuras 2D-2E) y de la película 1. <ol><li> Imagen de calota ósea directamente a través del cráneo sin seccionar 2, 8. </li><li> Sección esternón a lo largo del plano sagital (bisección) y luegotransversalmente en la unión entre 2 esternal foso y la imagen a través de la cara de corte 3,4,12 (descripción general en la Figura 1B adaptado de Takaku et al 3). </li></ol></li><li> Para time-lapse de 4D, coloque recién extirpado poplítea ganglios linfáticos, el bazo, pulmón, o muestras de hueso de calota sin cortar en 35 mm cultura platos número 0 cubreobjetos, en 50-100 l DMEM, FBS al 10% que contenía HEPES 20 a 37 ° C y el uso de 2 fotones Ti-Sa excitación (860 nm), combinada con la excitación confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) y un escáner de resonancia Leica (8000 Hz / seg), tomando z-pilas (~ 80 micras) a intervalos de 20 segundos hasta 1 hr. <ol><li> Para tricolor uso de imágenes 2P simultánea Ti-Sa sintonizado a 860 nm simultáneamente con el láser OPO (sintonizado en 1130 nm para tdTomato, o 1140 nm mCherry) (Movie 2). </li></ol></li><li> Reconstrucción y Análisis de volúmenes en 3D y secuencias de tiempo 4D <ol><li> Utilice Imaris x64 softwson la versión 7.6, o paquetes de programas alternativos para transformar las-pilas de baldosas de imágenes en bruto en volumen-renderizados (3D) de datos de células fluorescentes dentro de la médula ósea y los diferentes tejidos y para exportarlas como películas 3D de rotación, como se describió previamente 3,4 (Película 1) paso a paso ejemplo: <ol><li> En Imaris, Abra la imagen z-stack; Seleccione &quot;Supera&quot; con el fin de mostrar la visualización de volumen 3D. </li><li> Utilice &quot;navegar&quot; para subir el volumen alrededor de 360 ​​°. </li><li> Seleccione &quot;Animación&quot; para crear una animación; utilizar fotogramas clave para agregar vistas seleccionadas, zoom, rotaciones del volumen; Vista previa de la película, editar según sea necesario y guarde el archivo en un formato de vídeo que desee (por ejemplo: avi, mov). </li></ol></li><li> Para la evaluación cuantitativa de la frecuencia celular y clon 3D, posiciones, tamaños y distribución, más proceso de los z-pilas que utilizan los módulos Imaris XT que integran aplicaciones de MATLAB escénicas meas distanciamedi- (utilizando un algoritmo de transformación distancia) y grupos de análisis, como se ha descrito previamente 3,4. Transformar las secuencias de pilas de imágenes a través del tiempo en cuatro dimensiones (4D) películas de volumen-renderizados con software x64 Imaris y utilice punto y análisis de superficie para el seguimiento semiautomatizado de la motilidad celular en tres dimensiones usando algoritmos de movimiento autorregresivos. </li><li> Realizar análisis multiespectral de las células de la siguiente manera: extraer el color de múltiples puntos marcados por la adición de los 5 canales a través de la aritmética canal de Imaris XT en un nuevo canal; determinar, para todos los puntos (células) de la intensidad media de fluorescencia en cada uno de los canales de componentes 5. Exportar los valores en el software Excel para trazar gráficos que muestran el &quot;Colorprint&quot; única es decir, el% relativo de cada FP en celda individual (Figura 2E gráfico). Corrija el conjunto de datos de la deriva del tejido, y calcular la velocidad de células y el desplazamiento en el tiempo, longitudes de pista, caminos y distancias; los valores de exportación en Excel software para trazar gráficos. Ensamble figuras compuestas con el software Adobe Photoshop CSS 5. </li></ol></li></ol>

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<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Se describen aquí los detalles de una metodología poderosa recientemente ideado para el seguimiento celular clonal, la combinación de la gran diversidad generada por el marcado con vectores que codifican LEGO 5PM-y de formación de imágenes confocal con tándem y microscopía de 2 fotones para lograr volumétrica y la imagen dinámica en los tejidos vivos combinatoria. Esto se extendió el uso del color basados ​​en FP marcado por la grabación de la identidad espectral confocal en 5 &quot;distintos&quot; canales de 8 bits. As...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

La producción de células sanguíneas, denominado hematopoyesis, es mantenida por una pequeña población de células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs). Estas células residen dentro de la médula ósea (BM) en un complejo que consiste nicho microambientales de los osteoblastos, células del estroma, tejido adiposo, y las estructuras vasculares, todos implicados en el control de la auto-renovación y diferenciación 1,2. Como BM intacto ha sido tradicionalmente inaccesibles a la observación directa, las interacciones entre HSPC y su microambiente sigue siendo en gran medida sin caracterizar in vivo. Anteriormente, hemos establecido una metodología para visualizar la arquitectura 3D de BM intacta utilizando fluorescencia confocal y microscopía de reflexión 3. Nos caracteriza expansión de HSPCs EGFP marcados en la BM, pero el uso de sólo una única FP impidió el análisis de la regeneración en un nivel clonal. Muy recientemente nos aprovechamos de la Ontología de Lentiviral Génica (LEGO) vectores que expresan constitutivamente flproteínas fluorescentes (FPS) para marcar eficazmente células 4,5. Co-transducción de HSPC con 3 o 5 vectores genera una paleta diversa de colores combinatorias, lo que permite el seguimiento de los múltiples clones individuales HSPC. Marcado HSPC combina con la nueva tecnología de imagen permitido trazar homing individuo HSPC y el injerto en el BM de ratones irradiados. LEGO vectores se utilizaron para marcar HSPC con 3 o 5 MF diferentes (desde Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato, y mCherry) y seguir su injerto en el tiempo en el BM por microscopía confocal y 2-fotón, lo que permite una visualización clara de los huesos y otra estructuras de matriz, y la relación de clones HSPC a los componentes de su microambiente. HSPC se purificaron como las células negativas de linaje de ratones C57BL / 6 ratones BM, transducidas con vectores LEGO, y vuelve a infundir por inyección en la vena de la cola en ratones congenic mielo-ablación. Mediante el control de grandes volúmenes de tejido BM esternón visualizamos injerto endosteal ocurren temprano enRegeneración BM. Grupos de células con diversos espectros de color aparecieron inicialmente en estrecha proximidad con el hueso y progresaron de forma centralizada a través del tiempo. Curiosamente, después de más de 3 semanas, la médula ósea consiste en agrupaciones clónicas macroscópicas, que indica diseminación de la hematopoyesis derivada de HSPCs individuales de forma contigua en la médula, en lugar de amplia difusión de HSPCs través del torrente sanguíneo. Hubo menos diversidad de color en los puntos finales de tiempo, lo que sugiere la dificultad en la transducción a largo plazo repoblar células con múltiples vectores. Además, HSPCs formado grupos en el bazo, un órgano también responsable de la hematopoyesis en ratones. Células individuales HPSC derivados podrían resolverse en el timo, los ganglios linfáticos, el bazo, el hígado, los pulmones, el corazón, la piel, el músculo esquelético, tejido adiposo y los riñones también. Las imágenes en 3D pueden ser evaluados cualitativamente y cuantitativamente a apreciar la distribución de células con perturbaciones mínimas de los tejidos. Finalmente, ilustramosd la viabilidad de los estudios dinámicos vivos en 4D combinando multifotón escaneo de resonancia y time-lapse confocal. Esta metodología permite una alta resolución no invasiva, multidimensional celda de destino trazado de las poblaciones de células espectralmente marcados en su arquitectura intacta 3D, proporcionando una poderosa herramienta en el estudio de la regeneración de tejidos y la patología.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Producción de virus</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td> Expresión de LeGO-G2 <td>cerúleo</td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>Expresión de eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Expresión de Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>Expresión de tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Expresión de mCherry Kit de</td></tr><tr><td>transfección de fosfato de calcio</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor Sigma</td><td></td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Estreptococo Glutamina</td><td>Gibco, Vida Tecnología</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Jeringa Accionada por Filtro Unite (0.22 &micro; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation</td></tr><tr><td>ACK lysing</td> buffer <td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit de depleción de células de linaje (ratón)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. EE. UU.</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS columnas + tubos</td><td>Miltenyi Biotec Inc. EE. UU.</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de preseparación (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medio libre de suero para el cultivo y la expansión de células hematopoyéticas (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-11 CF</td><td>R & D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 y micro; g/ml es 1.000 veces</td></tr><tr><td>SCF murino recombinante</td><td>División RDI de Fitzgerald Industries Intl&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 y micro; g/ml es 2.000x</td></tr><tr><td>IL-3 murino recombinante</td><td>R & D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &micro; g/ml es 2.000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligando</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &micro; g/ml son 1.000</td></tr><tr><td>placas de 12 pocillos, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Resuspender a 50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Sulfato de Protamina</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 &micro; g/ml es 1,000x</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopía confocal y de dos fotones</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo con fondo de vidrio P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo con fondo de vidrio P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara #1 Cubreobjetos de borosilicato;</td> cubreobjetos <td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td>de 4 pocillos</tr><tr><td>22 mm Nº 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal y multifotónico Leica TCS SP5 AOBS de cinco canales</td> Alcance láser Chameleon Vision II -TiSaph de <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>680-1.080 nm</td><td>Camaleón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coherente Gama de láser OPO compacta 1.030-1.350 nm</td> Objetivo <td>de</td> inmersión en agua HCX-IRAPO-L 25X<td></td><td></td></tr><tr><td>/0,95 NA coherente (WD=2,5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo seco HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA (WD=0.6 mm)</td>Objetivo de inmersión en agua <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA (WD=0.6 mm)</td><td>Software Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris versión 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en tracking clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y microscopía multifotónica

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Hemos desarrollado y validado un marcador fluorescente metodología para el seguimiento clonal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs) con alta resolución espacial y temporal para estudiar en la hematopoyesis in vivo usando el trasplante de médula ósea modelo experimental murino. Combinatoria genética marcado utilizando vectores lentivirales que codifican proteínas fluorescentes (FPS) permitió la cartografía destino celular a través de imágenes de microscopía avanzada. Vectores que codifican cinco programas marco diferentes: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato y mCherry se utilizaron para transducir simultáneamente HSPCs, creando una paleta diversa de células de color marcado. Imaging utilizando microscopía confocal híbrido / dos fotones permite la evaluación de alta resolución simultánea de las células marcadas de forma única y su progenie en conjunción con componentes estructurales de los tejidos. Volumétrica analiza en grandes áreas revelan que las células derivadas de HSPC espectralmente codificados se pueden detectar de forma no invasiva en diversos tejidos intactos, incluyendo la médula ósea (BM), Durante largos períodos de tiempo después del trasplante. Los estudios en vivo que combinan multifotón-velocidad de vídeo y time-lapse confocal en 4D demuestran la posibilidad de rastreo celular y clonal dinámico de una manera cuantitativa.

Todo el montaje 3D confocal / 2 fotones microscopía reconstrucciones del curso esternal tiempo médula ósea reveló el injerto y la expansión de los compañeros de 5fps trasplantadas en un modelo con características notables: clones aparecieron claramente delimitada, homogénea marcados con amplia paleta de colores inicialmente y el progreso con el tiempo para contener preferentemente a las células de la mayoría de un solo color. La microscopía confocal de configuración y ejemplos representativos de formación de imágenes 5f...

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

El objetivo general de este procedimiento es rastrear clones hematopoyéticos marcados con fluorescencia en tejidos vivos, incluyendo la médula ósea, mediante una estrategia novedosa de microscopía confocal y de dos fotones. Para ello, se aíslan células progenitoras y madre hematopoyéticas de ratón y se transducen simultáneamente con vectores lentivirales de ontología génica o vectores Lego que codifican cinco proteínas fluorescentes: Ian, EGFP, Venus, TD tomato y mCherry. Las células transducidas se trasplantan luego en ratones receptores mieloablatados y, tras períodos de tiempo de hasta 120 días, se extraen la médula ósea y órganos de los ratones receptores, y se realiza microscopía confocal combinada con microscopía de dos fotones.Las imágenes resultantes se reconstruyen en 3D para rastrear la ubicación de los clones trasplantados y las células marcadas con fluorescencia a lo largo del tiempo. Esto facilita el estudio de la evolución clonal durante la hematopoyesis y el destino de las células derivadas de la médula ósea en otros órganos. La principal ventaja de esta técnica frente al corte físico de tejidos es que combina los beneficios del microscopio de alta resolución con seccionado óptico mediante microscopía confocal y la visualización de componentes estructurales mediante doble microscopía.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematología, como el análisis clonal espacial y temporal de la hematopoyesis durante la regeneración de la médula ósea desde el inicio del injerto, con el mantenimiento geográfico de los clones en expansión a lo largo del tiempo. Se pueden examinar volúmenes muy grandes de tejido denso intacto. Por ejemplo, aproximadamente 3000 imágenes fueron reconstruidas computacionalmente para visualizar clones marcados por color en un fragmento esternal. Aunque este método puede proporcionar información sobre la arquitectura clonal en hematopoyesis normales y alteradas, también puede aplicarse al estudio de la regeneración de órganos, las respuestas inmunitarias o los patrones de metástasis tumoral.En este procedimiento, los vectores lentivirales de ontogenia génica o vectores Lego codifican cinco proteínas fluorescentes: Ian EGFP, Venus, TD Tomato y M Cherry. Cada proteína fluorescente se expresa a partir de un promotor fuerte y constitutivo del virus formador de focos en bazo o promotor SFFV. Después de producir los vectores Lego que codifican las proteínas fluorescentes y titular las partículas virales, se cosecha la médula ósea de las extremidades anterior y posterior de ratones donantes sacrificados mediante la disección de fémures y tibias.Utilice un escalpelo para eliminar completamente todos los ligamentos musculares y los tejidos excesivos de los huesos. A continuación, corte el extremo de cada hueso lo más cerca posible de la articulación. Usando una aguja de calibre 27 en una jeringa que contiene medio I 10, lave la médula ósea hacia un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros y centrifugue a 500 G y cuatro grados Celsius para obtener un sedimento celular.Después de desechar el sobrenadante para lisisar los glóbulos rojos, agregue 50 mililitros de un tampón CK, centrifugue como antes, luego deseche el sobrenadante y repita tras desechar el segundo sobrenadante. Re_suspenda las células en 10 mililitros de medio I 10. A continuación, utilice un kit de agotamiento de linaje máximo para purificar las células progenitoras negativas para linaje según el protocolo modificado del kit detallado en el documento adjunto.Una vez que se hayan purificado las células negativas para la linaje, siémbrelas en un matraz T75 a una densidad de cinco veces 10 a la quinta células por mililitro en medio StemSpan suplementado con IL-3 murina, IL-11 murina, ligando FL humano y factor de células madre murino; incube a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante 48 horas. Después de dos días, use un raspador celular para resuspender las células y transfiera de una a cuatro veces 10 a la quinta células por pocillo a una placa de 12 pocillos; agregue vectores a una MOI de seis a siete, cada uno en medio StemSpan con citocinas y cuatro microgramos por mililitro de sulfato de protamina, a las células.Para llevar el volumen total en cada pocillo a un mililitro, asegúrese de preparar un control de color único para cada proteína fluorescente. Después de 24 horas, resuspenda las células utilizando un raspador y transfiéralas a un tubo de centrífuga de cinco mililitros. Luego, centrifugue y resuspenda las células en medio stem span sin citoquinas, centrifugue nuevamente y resuspenda las células en 100 microlitros de medio stem span sin citoquinas por inyección o para microscopía confocal o citometría de flujo.Trasférjalos a placas de 12 pocillos que contengan medio fresco con citocinas y cultive durante 96 horas adicionales. En preparación para el trasplante de médula ósea, coloque ratones receptores irradiados en una jaula bajo una luz cálida mientras se calientan. Prepare jeringas para inyección con uno a cuatro veces 10 a la quinta células negativas para la línea en 100 microlitros de medio de células madre por ratón.Prepare una jeringa para cada ratón. Cuando las venas de la cola estén dilatadas, los ratones estarán listos para ser inyectados. Coloque el ratón que va a ser inyectado en un sujetador para ratones y desinfecte la cola con una gasa empapada en etanol al 70%.Este paso también permite una mejor visualización de la vena caudal. A continuación, inyecte las células en la vena caudal. Transplante un grupo completo de animales con la misma población de células de médula ósea donante transducidas en diversos momentos hasta 120 días posteriores al trasplante.Recupere los tejidos y órganos para obtener imágenes completas sin seccionar. Coloque órganos individuales en placas de cultivo de vidrio cubreobjetos de 35 milímetros número cero con 50 a 100 microlitros de PBS frío para la obtención de imágenes de lapso de tiempo.Coloque los órganos en DMEM con 10 % FBS que contenga 20 milimolares de heaps a 37 grados Celsius e image inmediatamente. Aquí, la microscopía se realiza utilizando un sistema confocal invertido Leica SP cinco de cinco canales y un sistema de múltiples fotones equipado con láseres visibles de argón multilínea, diodo 561 nanómetros, helio neón 594 nanómetros y helio neón 633 nanómetros. Coloque una de las muestras individuales transducidas con Lego sobre la platina del microscopio y enfoque.Recopile pilas de imágenes lambda en intervalos de banda de cinco nanómetros que abarquen todo el espectro luminoso. A continuación, utilice el software para seleccionar una región de interés en la imagen y visualice el histograma del espectro de referencia. Guarde estos datos.Luego repita este proceso para cada proteína fluorescente en el experimento. A continuación, utilice los espectros recopilados de las proteínas fluorescentes individuales para establecer los anchos de banda en el modo de canal. Para hacer esto en cada canal, haga clic en el control deslizante negro e inserte el ancho de banda que se utilizará.El ancho de banda elegido debe abarcar la región pico de cada espectro de excitación de las proteínas fluorescentes, asegurando al mismo tiempo que no haya superposición entre los canales fluorescentes. Ajuste la ganancia y el desplazamiento para cada detector de manera que el rango dinámico de la señal de la muestra se encuentre a un nivel detectable, similar entre las proteínas fluorescentes y sin saturación. Por ejemplo, la proteína mCherry tiene aproximadamente la mitad de brillo que la EGFP, por lo que la ganancia y el desplazamiento deben ajustarse para obtener un rango dinámico similar en ambas.Finalmente, en el modo de canal, capture una imagen de cada muestra control de color individual con los cinco canales y verifique que cada proteína fluorescente sea visible únicamente en el canal correspondiente y ausente en los demás. Una vez que los espectros de todos los canales hayan sido validados, guarde la configuración. Esta puede importarse y utilizarse en experimentos futuros que empleen las mismas proteínas fluorescentes y tejido de muestra.Aquí se demuestra la combinación de microscopía confocal y de dos fotones utilizando médula ósea de esternón, obtenida con bisturí y pinzas mediante el corte del esternón a lo largo del plano sagital. Luego, realice un corte transversal en la articulación entre dos fosas esternales. Coloque los huesos con la cara cortada hacia abajo en una placa de cultivo de 35 milímetros con cubreobjetos número cero que contenga de 50 a 100 microlitros de PBS frío; la imagen se obtendrá a través de la cara cortada.Verifique la posición de los huesos en un microscopio estereoscópico. Coloque la muestra sobre la platina del microscopio. Luego configure el software de imagen para capturar secuencialmente la señal de dos fotones con el segundo armónico generado.Luego, excitación confocal con cinco colores. Establezca los límites del área de recolección de Zack con un tamaño de paso de cinco micrómetros sobre una distancia de 150 a 300 micrómetros. Utilice la función de mosaico para indicar al software que genere automáticamente volúmenes unidos que comprendan todo el esternón Fosse, aproximadamente 2,5 por 1,2 milímetros cuadrados en la dirección XY.Inicie la captura para recopilar secuencialmente imágenes X, Y, Z en los cinco canales más microscopía de dos fotones con señal de armónico segundo generado a partir del hueso y del colágeno fibrilar, para obtener imágenes de lapso de tiempo 4D. Coloque muestras recién extirpadas y sin corte de ganglio linfático poplíteo, bazo, pulmón o hueso calvarial sobre placas de cultivo de vidrio cubreobjetos de 35 milímetros número cero. Cubra con 50 a 100 microlitros de DMEM con 10% de FBS y 20 milimolar de HEPES a 37 grados Celsius.Coloque la muestra sobre la platina del microscopio calentada. Luego, en el software, cambie los parámetros de captura para utilizar la excitación de dos fotones con titanio zafiro a 860 nanómetros combinada con la excitación confocal y el escáner resonante de Leica a 8.000 hercios por segundo. Para obtener series Z de 80 micrones con intervalos de 22º durante hasta una hora para imágenes simultáneas de tres colores mediante dos fotones, instruya al software para que utilice el titanio zafiro ajustado a 860 nanómetros simultáneamente con el láser OPO ajustado a 1.130 nanómetros para TD tomate o a 1.140 nanómetros para M cereza.Finalmente, inicie la captura para recopilar cuatro imágenes D. Como antes, una vez que se hayan recopilado todas las imágenes, realice la reconstrucción y análisis tridimensional y tetradimensional utilizando la versión de 64 bits de Amer o un software similar en el software. Abra la imagen Zack, seleccione surpass para mostrar el visualizador de volumen 3D.Luego, utilice Navegar para rotar el volumen 360 grados. A continuación, seleccione animación. Use fotogramas clave para agregar vistas seleccionadas, zoom y rotaciones del volumen.Previsualice la película y edite según sea necesario. Finalmente, guarde el archivo en un formato de película deseado para rastrear la historia clonal de células madre y progenitoras hematopoyéticas marcadas con fluorescencia. Las células donantes transducidas simultáneamente con cinco vectores Lego diferentes se trasplantaron en un ratón receptor y se obtuvieron imágenes y analizó la médula ósea esternal como se describe en este video.A los cuatro días posteriores al trasplante, se observaron agrupaciones de células marcadas con una amplia variedad de colores en estrecha proximidad al borde óseo, que aparece en blanco. Al día 31, un gran clon de color verde amarillento único se había expandido para ocupar toda la fosa, tal como se ilustra en las imágenes fusionadas y en las imágenes de canal individual. El análisis del contenido de FPS mostró un marcado homogéneo mediante dos variantes de FPS: EGFP y Venus.Este video de reconstrucción 3D demuestra la arquitectura espacial de los clones marcados incluidos en el hueso esternal. Esta imagen muestra un ejemplo de células derivadas de la médula ósea en el ganglio linfático poplíteo 120 días después del trasplante. Las células dispersas están mayormente marcadas en amarillo y rojo y están rodeadas periféricamente por fibras de colágeno mostradas en blanco en el corazón visto desde el lado epicárdico.Se observan numerosas células individuales dispersas entre los cardiomiocitos mostrados en blanco, visualizados mediante su autofluorescencia de dos fotones a 780 nanómetros una vez dominada. Esta técnica puede realizarse en varios días si se lleva a cabo adecuadamente tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración y el desarrollo de órganos, así como en biología más amplia, exploraran las disposiciones espaciotemporales de elementos celulares y estructurales clonalmente complejos mediante etiquetado multicolor e imágenes confocales y de dos fotones.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar una metodología de marcado por fluorescencia para rastrear el marcado clonal de células madre y progenitoras hematopoyéticas en órganos vivos.

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En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica (Video) | JoVE Journal

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

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