Un sistema de trabajo del corazón aislada por grandes modelos animales
11 de junio de 2014
La mayoría de los estudios que involucran el aparato de Langendorff utilizan modelos de animales pequeños debido a la mayor complejidad de los sistemas para mamíferos más grandes. Describimos un sistema de Langendorff para modelos de animales grandes que permite su uso en una amplia gama de especies, incluidos los humanos, y una adquisición de datos relativamente fácil.
El objetivo general de este procedimiento es medir la función cardíaca de animales grandes en un circuito ex vivo. Esto se logra primero ensamblando el aparato de corazón funcionando. En el segundo paso, se lava la sangre, se reconstituye con solución salina normal y se optimizan los electrolitos en el paso final.
El corazón se fija replicando parámetros hemodinámicos in vivo. En última instancia, se puede insertar un catéter de conductancia en el ventrículo para obtener mediciones cuantitativas de la función ventricular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el uso de modelos animales pequeños, es que genera datos clínicamente relevantes mientras evita los factores de confusión inmunológicos que se observan con el trasplante en animales grandes.
Para construir el aparato de Langendorff, comience conectando el depósito del corazón al depósito sanguíneo con tubo de tres octavos de pulgada, asegurándose de que el tubo pase a través de una bomba de rodillos. A continuación, conecte el depósito sanguíneo al oxigenador-calentador con más tubo de tres octavos de pulgada, y luego conecte el oxigenador-calentador a un conector en Y. Conecte uno de los brazos del conector en Y a la bomba centrífuga.
Luego, conecte la bomba centrífuga a un segundo conector en Y para crear un trampa de burbujas y un medio para insertar el transductor de presión. Sujete un trozo de tubo de tres octavos de pulgada para fijar una válvula de hemostasia al brazo orientado hacia arriba. A continuación, sujete un trozo de tubo de tres octavos de pulgada al brazo inferior y conecte el otro brazo del conector en Y a la entrada de la cámara de precarga.
Asegúrese de que este tubo pase a través de la segunda bomba de rodillos. Conecte primero la línea de precarga a la porción de salida de la cámara de precarga. Esto se conectará eventualmente a la aurícula izquierda.
Conecte el tubo excedente de tres octavos de pulgada a la salida de esta cámara, y luego conecte el tanque de oxígeno y el aparato de calentamiento al calentador-oxigenador. Finalmente, sujete con pinza la línea que va desde el conector en Y hasta la cámara de precarga, ya que esta línea no se utilizará hasta que el corazón esté en modo de funcionamiento. Ahora, encienda el aparato de calentamiento del tanque de oxígeno, la bomba de rodillos, conecte los dos reservorios y la bomba centrífuga, y lave la sangre según las instrucciones del fabricante.
A continuación, reconstituya los glóbulos rojos lavados con solución salina normal hasta alcanzar la concentración deseada de hematocrito. Añada la sangre diluida al aparato de Langendorff y verifique el hematocrito. Ajuste las velocidades de las dos bombas para iniciar el flujo sanguíneo a través del sistema, excluyendo la cámara de precarga.
Verifique el pH y los electrolitos de la mezcla sanguínea y ajústelos hasta alcanzar valores fisiológicos para la especie utilizada, para prevenir la entrada perjudicial de calcio durante la reperfusión. Mantenga inicialmente el nivel de calcio en el aparato de languor entre 0,3 y 0,5 milimoles por litro. Tras calibrar el aparato de languor, retire rápidamente un corazón adecuadamente reposado del recipiente de almacenamiento.
Vierta cualquier solución de almacenamiento de los ventrículos. Seque el tejido y péselo. Luego, devuelva el corazón al recipiente de almacenamiento y oriente el tejido de modo que la aorta quede orientada hacia arriba para ayudar a mantener una temperatura miocárdica fría.
A continuación, inserte una cánula de tres octavos de pulgada en la aorta y fíjela con una brida plástica. Reduzca la bomba centrífuga hasta obtener un goteo lento y deje que la sangre gotee dentro de la aorta hasta que esté llena y completamente desangrada. Cuando la aorta esté llena de sangre, conecte cuidadosamente la cánula aórtica al tubo aórtico en el L endorf, anotando el momento de la conexión.
Luego, inserte el transductor de presión calibrado a través de la válvula de hemostasia en la aorta nativa. Comience las mediciones de presión y ajuste la velocidad de la bomba centrífuga hasta alcanzar la presión de reperfusión deseada. Supervise de cerca la presión aórtica, especialmente durante la reperfusión inicial, y aumente progresivamente la temperatura en la unidad de calentamiento hasta que la temperatura intramiocárdica alcance 37 grados Celsius.
Obtenga una muestra de referencia en el tiempo cero a partir del reservorio de sangre venosa para medir el pH, los electrolitos y otras mediciones bioquímicas. Luego, inserte una sonda de temperatura en el septo y monitoree la temperatura miocárdica. Tome muestras de sangre cada 15 minutos, ajustando los parámetros fisiológicos según sea necesario para el experimento, y agregue aproximadamente un milimol de calcio a la solución sanguínea cada cinco minutos.
Asegurarse de que el calcio iónico sea mayor de 0,8 milimoles por litro antes de iniciar el modo de trabajo. Después de colocar el corazón en modo de trabajo, utilice un hilo de sutura de polipropileno tres ceros para colocar una sutura en bolsa de tabaco en el ápice del ventrículo izquierdo. Luego use una aguja de calibre 16 para hacer una incisión punzante dentro de la sutura en bolsa de tabaco.
Introduzca el catéter de conductancia de volumen y presión a través de la incisión apical. Observe la salida de datos para determinar cuántos segmentos de volumen están activos. Si no están activos todos los segmentos, ajuste la posición del catéter hasta que lo estén; puede ser necesario un ligero giro del catéter para optimizar la morfología del bucle.
Luego, utilizando un catéter debidamente calibrado, obtenga al menos 30 segundos de datos de volumen y presión basales para determinar las mediciones del funcionamiento cardíaco dependientes del volumen. Una vez obtenidos suficientes bucles, utilice una pinza para tubos para ocluir lentamente el tubo de precarga. Los bucles de presión-volumen deben comenzar a reducirse y desplazarse hacia abajo y hacia la izquierda.
Esto se denomina descenso progresivo. Después de obtener entre 10 y 15 segundos de datos del descenso progresivo, libere la pinza del tubo para permitir que la precarga regrese a la aurícula izquierda y obtener mediciones independientes del volumen de la función cardíaca. Finalmente, haga clic en el botón de detención para finalizar la recopilación de datos y obtener mediciones replicadas.
Después de cinco minutos, repita el procedimiento. A partir del paso de oclusión, los cambios en la resistencia coronaria pueden provocar fluctuaciones en la presión de perfusión. Estas variaciones pueden ser leves y corregirse gradualmente con el tiempo.
Sin embargo, en algunos casos, estas variaciones pueden ser abruptas y requerir un ajuste del flujo a través de la bomba centrífuga para mantener la presión de reperfusión deseada. En este experimento, tras la introducción inicial del catéter de volumen-presión en un corazón porcino que había sido almacenado a cuatro grados Celsius durante dos horas, los lazos presentaban baja calidad, con múltiples áreas de superposición y sin componentes discernibles del ciclo cardíaco. No obstante, con una manipulación mínima del catéter dentro del ventrículo, la morfología del lazo mejoró notablemente, permitiendo obtener mediciones a pesar de la optimización de la posición del catéter.
Los bucles obtenidos en el circuito ex vivo pueden tener una morfología diferente a la de los bucles in vivo, probablemente debido a la distinta orientación del corazón en el circuito en comparación con la de un animal en posición supina, así como a la ausencia de las fijaciones anatómicas presentes en un animal vivo. Además, el uso de cables de estimulación para ayudar a regular la frecuencia cardíaca introduce una corriente eléctrica externa que provoca el pico observado en la parte inferior derecha de los bucles ex vivo. Sin embargo, mientras estos bucles aún presenten los componentes del ciclo cardíaco, aún pueden proporcionar datos interpretables.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el electrocardiograma y la ecocardiografía para examinar otras propiedades físicas del corazón, incluida la conducción.
Descripción general
Este artículo describe un sistema Langendorff diseñado para modelos de animales grandes, que permite la medición de la función cardíaca ex vivo. El método posibilita la adquisición de datos en diversas especies, incluidos los seres humanos, evitando al mismo tiempo factores de confusión inmunológicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología cardíaca
- Medición de la función cardíaca ex vivo
- Diseño del aparato de Langendorff
Antecedentes
- Los estudios tradicionales suelen utilizar modelos de animales pequeños.
- Los modelos de animales grandes proporcionan datos más relevantes clínicamente.
- Los factores de confusión inmunológicos complican los estudios de trasplante en animales grandes.
- El aparato de Langendorff puede adaptarse para especies más grandes.
Objetivo del estudio
- Medir la función cardíaca en animales grandes utilizando un circuito ex vivo.
- Proporcionar un método confiable para la adquisición de datos entre especies.
- Optimizar los parámetros fisiológicos para mediciones precisas.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje del aparato de corazón funcional.
- Lavado y reconstitución de la sangre con solución salina normal.
- Calibración del aparato de Langendorff para especies específicas.
- Inserción de un catéter de conductancia para mediciones cuantitativas.
Resultados principales
- Medición exitosa de la función ventricular en modelos de animales grandes.
- Establecimiento de condiciones fisiológicas para prevenir problemas de entrada de calcio.
- La recolección de datos proporcionó información clínicamente relevante sobre el rendimiento cardíaco.
- Se demostró la viabilidad de utilizar el aparato de Langendorff en especies más grandes.
Conclusiones
- El sistema Langendorff puede medir eficazmente la función cardíaca en animales grandes.
- Este método proporciona datos valiosos mientras minimiza los efectos inmunológicos.
- Estudios futuros pueden aprovechar este enfoque para investigaciones cardíacas adicionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este sistema de corazón aislado permite la medición ex vivo de la función cardíaca en modelos de animales grandes, proporcionando datos clínicamente relevantes mientras evita los factores de confusión inmunológicos inherentes a los estudios de trasplante. El sistema permite aplicabilidad entre especies mediante la regulación ajustable de la presión de perfusión, facilitando la investigación cardiovascular traslacional. Al generar datos cuantitativos de presión-volumen, mejora la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases preclínicas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición directa de la función ventricular en modelos animales grandes fisiológicamente relevantes.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al proporcionar datos sobre el rendimiento cardíaco relevantes para el ser humano, sin interferencias inmunológicas.
- Valor predictivo: Genera bucles cuantitativos de presión-volumen que aumentan la confianza en las evaluaciones de la interacción con el objetivo y la modulación de las vías.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce mediciones estandarizadas y reproducibles de presión-volumen ventricular adecuadas para campañas de cribado de compuestos.
- Salida cuantitativa: Proporciona lecturas hemodinámicas continuas en tiempo real que permiten el análisis de respuesta a la dosis y el perfil de eficacia.
- Escalabilidad: El sistema de perfusión adaptable permite una ejecución del ensayo consistente en corazones de diferentes tamaños y especies.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Mantiene parámetros hemodinámicos que replican condiciones in vivo, lo que respalda la validez del modelo preclínico.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica mediante puntos finales funcionales medibles.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona datos para orientar la progresión o interrupción basada en señales de seguridad cardíaca y eficacia.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la evaluación preclínica, proporcionando datos cardíacos funcionales que orientan la optimización del fármaco líder y la evaluación de seguridad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante mediciones directas de la función ventricular en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la recopilación estandarizada y reproducible de datos de presión-volumen bajo condiciones de perfusión controladas.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (por ejemplo, presión al final de la sístole, trabajo sistólico) que permiten la comparación entre diferentes condiciones y la clasificación de compuestos.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al ofrecer resultados funcionales relevantes para el ser humano que se alinean con evaluaciones de biomarcadores y de seguridad.
- Reutilización Empresarial: El aparato configurable sirve como una plataforma reutilizable para múltiples objetivos y especies cardiovasculares, reduciendo el desarrollo redundante de modelos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos cardíacos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante un control estricto de la presión de perfusión coronaria y el mantenimiento fisiológico de los electrolitos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la identificación temprana de toxicidades cardíacas, reduciendo el abandono en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de compuestos según umbrales cuantitativos de rendimiento cardíaco.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fisiología cardiovascular y técnicas de perfusión ex vivo.
- Depende de bombas centrífugas, transductores de presión y catéteres de conductancia para un control y medición hemodinámicos precisos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de sangre, regulación de temperatura y adquisición de datos.
- Implica consideraciones de adaptación para tamaños cardíacos variables, requerimientos iónicos específicos de cada especie y optimización del posicionamiento del catéter.
- Limitado por el diseño de sistema abierto, que complica la regulación de temperatura a largo plazo, a pesar de permitir la recolección de datos de efluente y de presión-volumen.
