Name: Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprende a realizar ensayos reporteros masivamente paralelos en células de mamífero cultivadas mediante secuenciación profunda y análisis computacional. Este método permite evaluar miles de secuencias reguladoras simultáneamente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número Premio R01HG006785.

1. Secuencia Diseño y Síntesis <ol><li> Comience MPRA con el diseño y la síntesis de secuencias a ensayar para la actividad reguladora. Para la compatibilidad con la serie de vectores pMPRA, diseñar cada secuencia utilizando la siguiente plantilla: 5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- etiqueta -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 &#39;, donde var indica la secuencia a ensayar y la etiqueta indica una o más etiquetas de identificación. </li><li> Las dos regiones variables (var) y la etiqueta están separadas por un par de KpnI (GGTACC) y XbaI (TCTAGA) sitios de restricción para facilitar la ligadura direccional de un fragmento de gen reportero entre ellos. Además, dos sitios distintos SfiI (GGCCNNNNNGGCC) se añadirán por PCR para permitir la ligación direccional en la columna vertebral pMPRA. Las regiones variables no deben contener copias adicionales de cualquiera de estos sitios de restricción. Si es necesario, uno o más de estas enzimas de restricción se pueden sustituir, Siempre y cuando las sustituciones 1) permitir un corte eficaz cerca de los extremos de moléculas de ADN, y 2) no corte en otra parte de la secuencia del vector. Ver discusión para más detalles. </li><li> Obtener los cebadores necesarios listados en la Tabla 1 de un proveedor comercial. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [índice] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Primer secuencias. [Indice] denota una secuencia de índice de 6 a 8 nt utilizado para la secuenciación de multiplexado. Obtener al menos 8 cebadores TagSeq-P2 con diferentes índices. Todosde los cebadores debe ser purificado por HPLC o PAGE. <ol start="4"><li> Bibliotecas de oligonucleótidos pueden obtenerse a partir de una instalación de proveedor o núcleo comercial, o se generan utilizando un microarray basado programable sintetizador de oligonucleótidos como se describe por el fabricante. Resuspender los productos MCO en 100 l de tampón TE 0,1. </li><li> Ejecute las bibliotecas de oligonucleótidos en un 10% TBE-Urea desnaturalización gel de poliacrilamida. Cargar aproximadamente 1 pmol por carril y tinción con colorante fluorescente sensible a ssDNA para evaluar su calidad (Figura 2A). </li><li> Si una banda discreta correspondiente a los oligonucleótidos de longitud completa se puede visualizar (Figura 2A, carriles 1 y 2), escindir el correspondiente trozo de gel de acrilamida y se eluye oligonucleótidos en 100 l TE 0,1 durante la noche a temperatura ambiente con agitación. De lo contrario, continúe con el OLS suspensión cruda. </li><li> Potenciar y colas SfiI a la biblioteca de oligonucleótidos utilizando emulsión PCR 9 </<html> sup&gt;. </li><li> Establecer 50 l mezclas de reacción PCR como se describe en la Tabla 2. Luego combine con 300 l de aceite y surfactante mezcla desde el Micellula ADN Emulsión y kit de purificación y agitar durante 5 min a 4 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> Herculase II Fusión ADN polimerasa </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Reaction Buffer 5x Herculase II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM cada uno) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA (20 mg / ml) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_F Primer (25 mM) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R Primer (25 mM) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Plantilla OLS (1-10 attomol) </td><td> varía </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> a 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; Cuadro 2 mezcla de reacción de PCR de emulsión (fase acuosa). <ol start="9"><li> Utilizar la concentración que da el máximo rendimiento de los productos de amplificación sin la aparición de artefactos (véase la sección 1.12). </li><li> Prescindir de la emulsión resultante en tubos de PCR y realice 20 ciclos de PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 segundos a 95 ° C, 20 segundos a 55 ° C, 30 segundos a 72 ° C], 3 min a 95 ° C). </li><li> Piscina y romper cada 350 l de reacción de PCR en emulsión mediante la adición de 1 ml de isobutanol y brevemente vórtex, y luego purificar el producto de amplificación usando una columna de purificación de ADN. </li><li> Ejecutar una alícuota en un gel de agarosa al 2% o 4% para verificar la amplificación libre de artefactos (Figura 2B). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> Figura 2 Preparación de bibliotecas de síntesis de oligonucleótidos. A) </strong&gt; Tres bibliotecas de síntesis de oligonucleótidos primas diferentes (MCO) se ejecutan en la desnaturalización de 10% TBE-urea geles de poliacrilamida. Las bandas correspondientes a los oligonucleótidos de longitud completa (*) se pueden visualizar y extirpados de bibliotecas 1 y 2 Biblioteca 3 contiene contaminantes que interfieren con la purificación PAGE. Si este es el caso, proceder directamente a la PCR de amplificación. B) los productos de amplificación por PCR abierto y emulsión de la misma corrida biblioteca de oligonucleótidos en un gel de agarosa. La amplificación por PCR de las bibliotecas de oligonucleótidos complejos con frecuencia crea productos quiméricos y otros artefactos que pueden aparecer como bandas superiores e inferiores. Emulsión PCR puede minimizar estos artefactos. 2. Construcción de la Biblioteca <ol><li> Preparar un plásmido linealizado por digestión de columna vertebral pMPRA1 vector con SfiI a 50 ° C durante 2 horas, se ejecutan en un gel de agarosa al 1%, escindir la banda columna vertebral (en este caso, 2,5 kb) y purificar usando una columna de centrifugación purificación en gel. </li><li> Recopilaciónlos productos de la PCR de emulsión de la etapa 1.4 con SfiI a 50 ° C durante 2 horas y purifican utilizando columnas de purificación de ADN. </li><li> Para ligar la biblioteca promotor-tag en el esqueleto del vector linealizado, configurar las reacciones que contenían 100 ng del producto de PCR digerido, 50 ng de esqueleto del vector linealizado y ADN ligasa de T4. Incubar toda la noche a 16 ° C y luego se calienta a 65 ° C durante 20 min para inactivar la ligasa. </li><li> Transformar E. coli con la reacción de ligación. Para preservar la complejidad de la biblioteca, el objetivo de obtener al menos 10 veces más ufc que hay combinaciones de promotor-etiquetas distintas en la biblioteca diseñada. </li><li> Cuando el número total de etiquetas es de aproximadamente 100.000, el ufc objetivo típicamente se puede lograr mediante la realización de 6-8 transformaciones paralelas por biblioteca. </li><li> Para cada transformación, se combinan 50 l electrocompetentes E. células de E. coli con 2 l de mezcla de ligación en hielo. Transformar mediante electroporación, recuperar las células en 800 l SOCmedio por agitación a 37 ° C durante 1 h, y luego se combinan células de las transformaciones paralelas. </li><li> Para evaluar la eficiencia de transformación, placa diluciones seriadas de un alinquot de células recuperadas en placas de agar LB con 50 a 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba durante la noche a 37 ° C. Estimar ufc total, (cfu observado) x (factor de dilución) x (V - V) / V, donde V es el volumen total de células recuperadas y V es el volumen de la alícuota tomada para las diluciones en serie. </li><li> Al mismo tiempo, utilizar el resto de las células recuperadas para inocular 200 ml de LB suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina. Se cultivan las células a 37 ° C durante la noche en una incubadora con agitador y luego aislar el ADN plásmido siguiendo los procedimientos estándar. </li><li> Digerir una alícuota de la biblioteca de plásmido aislado con SfiI a 50 ° C durante 2 horas y correr en un gel de agarosa al 1% para confirmar la presencia de insertos. </li><li> Linealizar el plásmido biblioteca por cutting entre las variantes promotoras y etiquetas utilizando KpnI y XbaI. Para maximizar la eficiencia de la digestión, realizar digestiones de serie: </li><li> En primer lugar, digerir con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y purificar usando perlas magnéticas. En segundo lugar, digerir con XbaI con la adición de 1 U de fosfatasa alcalina de camarón a 37 ° C durante 2 h, el calor inactiva a 65 ° C durante 5 min, y luego se purifica usando perlas magnéticas. </li><li> Ejecutar una alícuota en un gel de agarosa al 1% para verificar la linealización completa. Si plásmido sin cortar es visible, el fragmento linealizado se purificó en gel debe ser. </li><li> Para generar una biblioteca de MPRA adecuados para la transfección en células de mamífero, ligar un ORF con KpnI / XbaI extremos -Compatible en la biblioteca intermedia linealizado. </li><li> Para preparar un fragmento ORF luc2 compatible desde pMPRAdonor1, digerir este plásmido con KpnI y XbaI a 37 ° C durante 1 hora y se ejecutan en un gel de agarosa al 1%. Cortar el fragmento ORF (1,7 kb en este caso) y se purifican usando una columna de gel de purificación de giro. </li><li> Clonar el fragmento ORF en la biblioteca intermedio linealizado como se describe en los pasos 2.3 a 2.8. </li><li> Digerir una parte alícuota (correspondiente a 1-2 g) de la biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y correr en un gel de agarosa al 1%. Si la biblioteca digerido se ejecuta como una sola banda, pase a la sección 3 Si se observan bandas adicionales (por lo general corresponde a remanente de construcciones intermedias), la biblioteca puede ser purificado de la siguiente manera: </li><li> Digerir 3-5 g de la biblioteca contaminada con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y correr en un gel de agarosa al 0,8% durante la noche a 4 ° C. </li><li> Escindir la banda biblioteca correcta, purificar el ADN usando una columna de centrifugación purificación en gel y llevar a cabo la auto-ligación utilizando alta concentración de ADN ligasa de T4 a 37 ° C durante 1 hr. A continuación, repita la transformación y la biblioteca definitiva de aislamiento de ADN como se describe en el paso 2.8. </li></ol> 3. Transfection, Perturbación, y Aislamiento de ARN <ol><li> Para cada transfección independiente, la cultura el número requerido de células (como se determina por la complejidad de la biblioteca MPRA, ver Discusión) en un medio apropiado. Por ejemplo, cultivo de células HEK293T 17 / en DMEM suplementado con 10% de FBS y L-glutamina / penicilina / estreptomicina. Células de cultivo de al menos dos transfecciones independientes para cada biblioteca y condición experimental. </li><li> Transfectar las células cultivadas con plásmidos MPRA. El método y las condiciones de transfección debe ser optimizado para cada tipo de célula. Para cada muestra transfectadas, retener una parte alícuota (50-100 ng) de ADN plásmido como control emparejado. </li><li> Por ejemplo, transfectar 0,5 x 10 7 HEK293T / 17 células cultivadas a ~ 50% de confluencia en una placa de cultivo de 10 cm con el plásmido de ADN 10 mg en 1 ml de Opti-MEM I medio de suero reducido utilizando 30 l Lipofectamine LTX y 10 l de reactivo Plus. Retire la mezcla de transfección después de 5 horas y permitir lalas células se recuperen durante 24-48 h. </li><li> Opcionalmente, realice cualquier perturbación necesaria para activar secuencias reguladoras al contexto o dependientes de señales en la biblioteca diseñada. </li><li> Recoger las células y aislar poli (A) + mRNA utilizando columnas estándar oligo (dT) celulosa o perlas usando las instrucciones de su fabricante. </li><li> Asegúrese de que la capacidad máxima de unión de las columnas o los granos supere el importe total de ARNm que se espera de las células recogidas. Por ejemplo, el rendimiento esperado de la sección 3.3 es de aproximadamente 0,5-2,5 mg ARNm. </li></ol> 4. Tag-Seq <ol><li> Para eliminar el arrastre de ADN del vector de los lisados ​​de células transfectadas, tratar a cada muestra de ARNm 20 l con 1 l Turbo DNasa (2 U) y 2,3 l de tampón 10x Turbo DNasa a 37 ° C durante 1 hora, añadir 2,4 l Turbo DNasa inactivación reactivo en RT durante 5 min con mezcla, centrifugar a 10.000 g durante 90 seg, y luego transferir la solución a un tubo nuevo. </li><li> Compruebe<html> pureza mediante la realización de PCR como se describe en la sección 4.6 de 60-100 ng de cada muestra de ARNm, y luego ejecutar los productos en un gel de agarosa. Si amplicones específicos son visibles (0,25 kb si usa pMPRA1 con luc2), la columna de purificar el mRNA tratado y luego repetir el tratamiento DNasa. </li><li> Para generar bibliotecas de secuenciación-Tag Seq, convertir reportero ARNm en ADNc y añadir adaptadores de secuenciación por PCR. </li><li> Configurar mezclas de cebadores ARNm / RT como se describe en la Tabla 3. Incubar a 65 ° C durante 5 min, luego colocar en hielo. En paralelo, configurar las reacciones de síntesis de ADNc como se describe en la Tabla 4. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> muestra de ARNm (400-700 ng total) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Oligo-0DT (50 M) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM cada uno) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;&gt; Cuadro 3 ARN mezcla de cebadores / transcripción inversa para la síntesis de ADNc. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> 10x superíndice III RT Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Superíndice III (200 U / l) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla ADNc 4. mezcla de reacción de síntesis. <ol start="5"><li> Combinan suavemente imprimación mRNA / RT mezcla con mezclas de síntesis de ADNc. Incubar a 50 ° C durante 50 min, 85 ° C durante 5 min y luego se coloca en hielo. Finalmente, se incuba con 2 U de ribonucleasa H a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Configurar las reacciones de PCR como se describe en la Tabla 5 con 4-6 lcDNA mezcla de reacción o 50 ng de plásmido reportero como plantillas. A continuación, realizar la amplificación por PCR (95 ° C durante 2 min, 26 x [95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 seg], 72 ° C durante 3 min). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix </td><td> 25 </td></tr><tr><td> TagSeq_P1 Primer (25 mM) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> TagSeq_P2 Primer (25 mM) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Plantilla (ARNm, ADNc o ADN plásmido mix) </td><td> varía </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> a 50 </td></tr></tbody></table> Tabla 5. mezcla de reacción de PCR Tag-Seq. <ol start="7"><li> Ejecutar los productos de PCR en un gel de agarosa al 2%, bandas especiales correspondientes a los amplicones biblioteca-Tag Sec (0,25 kb si se utilizapMPRA1 con luc2) y purificar estas utilizando columnas giratorias de purificación de gel. </li><li> Piscina, desnaturalizar y secuenciar los amplicones-Tag Sec purificados directamente con un instrumento de secuenciación de Illumina. </li><li> Filtro de baja calidad se lee mediante la eliminación de todo lo que a) contener una o más posiciones con una calidad Phred puntuación de menos de 30 dentro de la etiqueta secuenciado o b) que no coincide exactamente una etiqueta diseñada. Cuente el número de veces que cada etiqueta restante aparece en cada biblioteca. Normalizar la etiqueta cuenta con TPM (etiquetas por millón de etiquetas secuenciados) y luego calcular la relación de etiqueta cuenta derivados de ARNm más de etiqueta cuenta plásmido derivado para cada par de bibliotecas de secuenciación. Si varias etiquetas diferentes estaban vinculados a cada variante de secuencia, utilice sus ratios de la mediana para el análisis de aguas abajo. </li></ol>

<ol><li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe’er, D., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+DNA+regulatory+elements+by+synthetic+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis.</a> Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Boryń, ŁM., Rath, M., Stark, A. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnold%2C+CD+%22Science+%28New+York%2C+N.+Y.%29%22">Science (New York, N. Y.)</a>. 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li>
<li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li>
<li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li>
<li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li>
<li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

MPRA es una herramienta flexible y poderosa para la disección de las relaciones secuencia-actividad en elementos reguladores de genes. El éxito de los experimentos MPRA depende de al menos tres factores: 1) diseño cuidadoso de la biblioteca de secuencias, 2) minimización de artefactos durante la amplificación y clonación, y 3) alta eficiencia de transfección. 
Las posibles longitudes de las regiones variables en las construcciones de reporteros están determinadas en gran medida por la tecnología de síntesis o clonación utilizada. El OLS estándar generalmente está limitado a unos 200 nt, pero este protocolo es compatible con insertos de hasta al menos 1.000 nt. Tenga en cuenta que las regiones variables que son altamente repetitivas o contienen estructuras secundarias fuertes pueden terminar subrepresentadas debido a los sesgos de PCR y clonación. La longitud de las etiquetas que identifican cada una de las regiones variables debe ser de 10-20 nt y la colección de etiquetas idealmente debe diseñarse de tal manera que haya al menos dos diferencias de nucleótidos entre cualquier par. Las etiquetas que contienen las secuencias de semillas de microARN conocido u otros factores que podrían influir en la estabilidad del ARNm también deben evitarse cuando sea posible.
Un parámetro clave en el diseño de experimentos MPRA es el número total de construcciones reporteras distintas que se incluirán en la biblioteca (la complejidad del diseño, denotada CD). En la práctica, la C D está limitada por el número de células cultivadas que se pueden transfectar. Como regla general, el número total de células transfectadas debe ser al menos 50-100 veces mayor que CD. Por ejemplo, si se pueden transfectar 20 millones de células con una eficiencia de transfección del 50%, entonces CD no debería ser más de ~ 200,000. Tenga en cuenta que CD es igual al número de variantes de secuencia reguladora distintas multiplicado por el número de etiquetas distintas por secuencia. Cuantas más etiquetas distintas estén vinculadas a cada secuencia reguladora, más precisa será la estimación de la actividad de esa secuencia (porque se pueden promediar las mediciones de etiquetas distintas), pero menos variantes distintas se pueden analizar en un experimento. La elección óptima depende del diseño experimental. En un experimento simple de "ataque al promotor", donde se ajustará un modelo matemático a las mediciones agregadas, una sola etiqueta por variante suele ser suficiente. En una detección de polimorfismos de un solo nucleótido que causan cambios en las actividades reguladoras, puede ser necesario usar 20 o más etiquetas por alelo para obtener resultados estadísticamente sólidos, porque la comparación de cada par de alelos requiere una prueba de hipótesis separada.
Si no se espera que las secuencias a ensayar contengan sitios de inicio de transcripción, también se puede agregar un promotor constante en el mismo fragmento. Por ejemplo, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) incluye un promotor TATA-box mínimo que es útil cuando se espera que la región variable aguas arriba tenga una actividad potenciadora significativa, mientras que pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) incluye un promotor viral SV40 fuerte y modificado que es útil cuando se espera que la región variable contenga actividad silenciadora u otros elementos reguladores negativos. 
Los productos OLS crudos a menudo contienen una fracción significativa de oligonucleótidos truncados. Estos pueden interferir con la amplificación precisa por PCR de las secuencias diseñadas, particularmente cuando existe una homología significativa entre ellas. El uso de la purificación PAGE para eliminar los productos de síntesis truncados y la PCR en emulsión para minimizar los artefactos de amplificación son técnicas eficaces para garantizar una alta calidad de la biblioteca. Si cualquiera de los pasos no es práctico, es imperativo minimizar el número de ciclos de PCR utilizados en cada paso de amplificación. La selección y expansión de la biblioteca clonada en cultivo líquido es generalmente suficiente para mantener la complejidad del diseño, pero si se van a utilizar vectores propensos a la recombinación o se observa un sesgo de representación significativo, las células recuperadas pueden sembrarse directamente en grandes placas de agar LB, expandirse como colonias individuales y luego rasparse para aislar el ADN. También es importante considerar el impacto potencial de los errores de síntesis, que generalmente se encuentran a una velocidad de 1: 100-500 en OLS. Se recomienda la secuenciación completa de las construcciones reporteras antes de la transfección para identificar y corregir dichos errores.
No es necesario introducir construcciones indicadoras en cada célula del cultivo transfectado, pero las eficiencias de transfección por debajo de ~ 50% pueden conducir a una mala relación señal/ruido. Es aconsejable optimizar las condiciones de transfección antes de realizar experimentos MPRA en un nuevo tipo de célula. Cuando se trabaja con tipos de células difíciles de transfectar, las señales MPRA se pueden aumentar mediante la preselección de células transfectadas. La serie de vectores pMPRA incluye variantes que expresan constitutivamente un marcador de superficie celular truncada que se puede usar para enriquecer físicamente las células transfectadas antes del aislamiento de ARN (por ejemplo, Addgene ID 49350 y 49351).

A correction to the author list has been made for article <a href="http://www.jove.com/video/51719">Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells</a>.

Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Ensayos Reporteros Massively Parallel (MPRA) permiten medir multiplexado de las actividades reguladoras de la transcripción de miles a cientos de miles de secuencias de ADN 1-7. En su aplicación más común, la multiplexación se logra mediante el acoplamiento de cada secuencia de interés a un gen indicador sintético que contiene una identificación de etiqueta de secuencia aguas abajo de un marco de lectura abierto (ORF; Figura 1). Después de la transfección, el aislamiento de ARN y secuenciación profunda de los extremos 3 &#39;de los transcritos del gen reportero, las actividades relativas de las secuencias unidas se pueden deducir de la abundancia relativa de sus etiquetas de identificación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> Figura 1 Descripción general de MPRA. Una biblioteca de reportero MPRA construcciones se construye acoplando secuencias reguladoras putativas a sintéticogenes indicadores que consisten en un &quot;inerte&quot; ORF (como GFP o luciferasa), seguido de una identificación de marcadores de secuencias. La biblioteca es transfectada en masa en una población de células cultivadas y ARNm transcrito reportero se recupera posteriormente. Secuenciación de profundidad se utiliza para contar el número de ocurrencias de cada etiqueta entre los mRNAs reportero y los plásmidos transfectados. La proporción de mRNA cuenta sobre los recuentos de plásmido puede utilizarse para inferir la actividad de la secuencia reguladora correspondiente. Adaptado con permiso de Melnikov, et al 2. MPRA se puede adaptar a una amplia variedad de diseños experimentales, incluyendo 1) la mutagénesis integral de elementos reguladores de genes individuales, 2) la exploración de nuevos elementos reguladores a través de un locus de interés, 3) probar el efecto de la variación genética natural en un conjunto de putativo promotores, potenciadores o silenciadores, y 4) ingeniería semi-racional de los elementos reguladores sintéticos. Libraries de variantes de secuencia pueden generarse usando una variedad de métodos, incluyendo la síntesis de la biblioteca de oligonucleótidos (OLS) en microarrays programables 2,3,6,7, conjunto de oligonucleótidos degenerados, 1,4 ligadura 8 combinatoria y la fragmentación de ADN genómico 5. Este protocolo describe la construcción de una biblioteca de variantes de promotor usando OLS y los vectores de pMPRA1 y pMPRAdonor1 (Addgene IDs 49349 y 49352, respectivamente; http://www.addgene.org), la transfección transitoria de esta biblioteca en células de mamífero cultivadas y la posterior cuantificación de las actividades promotoras de secuenciación profunda de sus etiquetas asociadas (Tag-Seq). Las versiones anteriores de este protocolo se utilizaron en la investigación publicada en Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) y en Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

<table><tbody><tr><td>Síntesis de bibliotecas de oligonucleótidos</td><td>Agilent, CustomArray u otros proveedores de OLS</td><td>personalizado</td><td>Si se utiliza el método de construcción OLS</td></tr><tr><td>pMPRA1</td><td>Addgene</td><td>49349</td><td>MPRA plásmido backbone</td></tr><tr><td>pMPRAdonor1</td><td>Addgene</td><td>49352</td><td>luc2 Plásmido donante de ORF Tampón</td></tr><tr><td>TE 0.1 (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td><td>Genérico</td><td>n/a</td><td>Tampón OLS</td></tr><tr><td>Novex TBE-Geles de urea, 10%</td><td>Life Technologies</td><td>EC6875BOX</td><td>PAGE purificación de productos OLS</td></tr><tr><td>Novex TBA-Urea Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6876</td><td>PAGE purificación de productos OLS</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td>PAGE purificación de productos OLS</td></tr><tr><td>Emulsión de ADN de micelula & Kit de purificación</td><td>EURx/CHIMERx</td><td>3600-01</td><td>Amplificación de bibliotecas por emulsión PCR</td></tr><tr><td>Herculasa II ADN polimerasa de fusión</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>Polimerasa para emulsión PCR</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0123S</td><td>Clonación de bibliotecas con vectores pMPRA</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142S</td><td>Clonación de bibliotecas con vectores pMPRA</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Nuevo Clonación de</td> bibliotecas <td>R0145S</td> de England Biolabs <td>con vectores pMPRA</td></tr> ADN <tr><td>ligasa T4 (2.000.000 de unidades/ml)</td>Clonación de bibliotecas <td>M0202T</td> de <td>New England Biolabs</td><td>con vectores pMPRA</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C4040-50</td><td>Clonación de bibliotecas con vectores pMPRA</td></tr><tr><td>Agar LB y medios líquidos con carbeniclina</td><td>Genérico</td><td>n/a</td><td>Medios de crecimiento para clonación</td></tr><tr><td>E-Gel EX Geles 1%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-01</td><td>Verificación y purificación de bibliotecas</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels, 2%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-02</td><td>Verificación y purificación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel MinElute Qiagen</td><td></td><td>28604</td><td>Purificación de bibliotecas y columna vertebral</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Biblioteca Aislamiento de ADN</td></tr><tr><td>Medios de cultivo celular</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Reactivos de</td></tr><tr><td>transfección</td> específicos del experimento <td>n/a</td><td>n/a</td><td>MicroPoly</td></tr><tr><td>(A)Purist</td> específicos del experimento <td>Kit Life Technologies</td><td>AM1919</td><td>Aislamiento de ARNm</td></tr><tr><td>TURBO Kit libre de ADN Life</td><td>Technologies</td><td>AM1907</td><td>Eliminación de ADN plasmídico</td></tr><tr><td>SuperScript III Sistema de síntesis de primera cadena</td><td>Life Tecnologías</td><td>18080-051 síntesis de</td><td>ADNc</td></tr><tr><td>PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600850</td><td>Polymerase para cebadores de PCR Tag-Seq</td></tr><tr><td>(ver texto)Imprimadores</td> <td>personalizados IDT</td><td></td><td>PAGE purify Tag-Seq</td></tr></tbody></table>

ensayos reporteros massively parallel en células de mamífero cultivadas

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

El ensayo del reportero genético es una herramienta bien establecida y poderosa para diseccionar la relación entre las secuencias de ADN y sus actividades reguladoras de genes. Sin embargo, el rendimiento potencial de este ensayo se ha visto limitado por la necesidad de clonar y ensayar individualmente la actividad de cada secuencia en interés utilizando la fluorescencia de proteínas o la actividad enzimática como proxy de la actividad reguladora. Los avances en las tecnologías de secuenciación y síntesis de ADN de alto rendimiento han permitido recientemente superar estas limitaciones mediante la multiplexación de la construcción y la interrogación de grandes bibliotecas de constructos de reporteros. Este protocolo describe la implementación de un ensayo reportero masivamente paralelo (MPRA) que permite la comparación directa de cientos de miles de secuencias reguladoras putativas en una sola placa de cultivo celular.

MPRA facilita de alta resolución, la disección cuantitativa de las relaciones de secuencia de la actividad de elementos reguladores transcripcionales. Un experimento exitoso MPRA típicamente producirá mediciones altamente reproducibles para la mayoría de las secuencias en la biblioteca transfectadas (Figura 3A). Si se observa una mala reproducibilidad (Figura 3B), esto es indicativo de una concentración demasiado baja de mRNAs reportero en las muestras de ARN recuperado, ya sea debido a 1) una baja actividad absoluta entre las secuencias ensayadas, o 2) la baja eficiencia de transfección. La figura 4 muestra un representante &quot;información de la huella&quot; 1,2 generada por el ensayo de ~ 37.000 variantes aleatorias de una secuencia de 145 pb aguas arriba del gen IFNB humano en células HEK293 con o sin exposición al virus Sendai. El promotor TATA-box y conocido promotor de proximal 10 pueden ser claramente identificados como regi rico en informacióncomplementos de una manera dependiente de virus. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> Figura 3.-Tag Sec reproducibilidad diagramas de dispersión que muestran ejemplos de datos de la etiqueta de la Seq dos transfecciones independientes replicadas con alta (A) y baja (B) la reproducibilidad.. Este último gráfico muestra muchas etiquetas de valores atípicos con recuentos de alta mRNA en sólo una de las dos repeticiones. Tales artefactos típicamente indican que las concentraciones de ARNm reportero eran demasiado bajos para la amplificación de PCR cuantitativa, ya sea debido a las actividades absolutas bajas entre los constructos informadores, o bajas eficiencias de transfección. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> Figura 4. Información footprinting del sitio de inicio de transcripción IFNB humano y potenciador proximal. </strong&gt; Aproximadamente 37.000 variantes aleatorias de un (nt) región de 145 nucleótidos aguas arriba del gen IFNB humano se analizaron utilizando MPRA en células HEK293 con (A) y sin (B) la exposición al virus Sendai. Las barras azules muestran la información mutua entre la salida reportero y el nucleótido en cada posición. El potenciador proximal y la caja TATA se destacan como las regiones de alto contenido de información a la infección viral.

El ensayo del reportero genético es una herramienta bien establecida y poderosa para diseccionar la relación entre las secuencias de ADN y sus actividades reguladoras de genes. El acoplamiento de los elementos reguladores candidatos a genes reporteros que llevan etiquetas de secuencia identificativa permite la paralelización masiva de estos ensayos.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar las actividades reguladoras de genes de miles de secuencias de ADN en paralelo. Esto se logra construyendo primero una biblioteca reportera donde las secuencias de ADN de interés están vinculadas a genes reporteros con una o más etiquetas de secuencia de identificación en sus tres principales. El segundo paso del procedimiento es transfectar esta biblioteca reportera en una población de células.El paso final es contar el número de ocurrencias de cada una de las etiquetas de secuencia identificativa en los ARNm reporteros y la biblioteca reportera correspondiente mediante secuenciación profunda. En última instancia, los resultados se pueden utilizar para inferir la relación entre la secuencia de ADN y las actividades de los elementos reguladores de genes a través del análisis computacional de los recuentos de etiquetas de secuencia. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la luciferasa o los ensayos reporteros basados en GFP, es que permite analizar miles de secuencias reguladoras en una sola placa de células cultivadas.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación génica, como qué nucleótidos dentro del promotor o potenciador tienen una actividad basada en lo esencial. Este método se puede utilizar para una amplia variedad de otros diseños de experimentos, como el cribado de una gran biblioteca de elementos reguladores putativos para la actividad en un estado celular específico. La demostración del procedimiento de construcción de la biblioteca reportera estará a cargo de Peter Rugo, un investigador asociado senior de los laboratorios de biotecnología, demostrando la biblioteca reportera TRANSFECT y la recuperación de ARN será Lee Wang, un investigador asociado senior de mi grupo, Los ensayos reporteros masivamente paralelos en lo sucesivo se denominarán NPRA, comenzarán con el diseño y la síntesis de las secuencias que se ensayarán para la actividad regulatoria.Y etiqueta denota una o más etiquetas de identificación. Los sitios de restricción de KPN one y XBA one se encuentran en el medio. Re suspender la biblioteca de oligonucleótidos sintetizados en 100 microlitros de tampón TE 0.1.Ejecute la biblioteca de oligonucleótidos en un gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea al 10% TBE. Cargue aproximadamente un ole en cada carril y analice el gel con una tinción fluorescente sensible al ADN de una sola cadena. Si hay una prohibición discreta correspondiente a los oligonucleótidos de longitud completa, córtela y eluya los oligonucleótidos en 100 microlitros de TE 0,1 durante la noche a temperatura ambiente y agitando utilizando la biblioteca de oligonucleótidos purificada en gel o cruda.Configure una emulsión PCR para amplificar la biblioteca y agregue SI one tails. Configure reacciones de 50 microlitros como se describe en la tabla dos. A continuación, combine la mezcla de reacción de 50 microlitros con 300 microlitros de aceite y la mezcla de tensioactivo del kit de emulsión y purificación my DNA durante cinco minutos a cuatro grados centígrados de mezcla de vórtices en una emulsión.A continuación, distribuya la emulsión en tubos o placas de PCR como reacciones de 50 microlitros y realice 20 ciclos de PCR después de la PCR. Vuelve a juntar las emulsiones de 350 microlitros. Luego agregue un mililitro de Isobutanol y vórtice a la mezcla.Purifique brevemente el producto de amplificación utilizando una columna de purificación de ADN y ejecute un Eloqua en un gel de 2% o 4% de agros para evaluar su calidad. La amplificación del suero de una biblioteca de aceite compleja puede introducir sesgos de representación, aplicación RIC y otros artefactos. Es esencial minimizar el número de ciclos de PCR utilizados para el control de calidad adicional.Se recomienda realizar una biblioteca de secuenciación completa antes de continuar con los siguientes pasos para preparar la columna vertebral del plásmido linealizado. Primer P pra digestivo un vector con SFI uno a 50 grados centígrados durante dos horas. A continuación, ejecute los productos digeridos en un gel al 1% y recoja el ADN de la banda de columna vertebral de 2,5 KILOBASE utilizando una columna de centrifugación de purificación de gel.A continuación, digiera los productos de PCR en emulsión de la misma manera y recoja también los productos con la columna de purificación de ADN. Ahora configure una reacción de ligadura con 100 nanogramos de PCR digerida y 50 nanogramos de plásmido linealizado. Use T four ligasa y ejecute la reacción durante la noche a 16 grados centígrados al día siguiente.Inactive la reacción de ligadura calentándola a 65 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, transforme dos alícuotas de microlitros de los productos de reacción de ligadura en alícuotas de 50 microlitros de equivalentes electrocompetentes. Recuperar las células en 800 microlitros de medio SOC a 37 grados centígrados con agitación durante una hora.A continuación, agrupe todas las transformaciones paralelas y evalúelas mediante la siembra de diluciones en serie en agar LB con 50 a cien microgramos de penicilina de carbono por mililitro. Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados y estimar la UFC total al día siguiente. Inmediatamente después de la transformación, use el resto de las células transformadas para inocular 200 mililitros de LB suplementado con 100 microgramos de carbono por mililitro.Cultive las células a 37 grados centígrados durante la noche y agitándolas al día siguiente, aísle el ADN plasmático siguiendo los procedimientos estándar para confirmar la presencia de insertos. Digiera una alícuota de la biblioteca aislada con SFI one y agote los productos en un gel de 1%aros, linealice la biblioteca de plásmidos con digestiones en serie usando KPN one y XBA uno, haga la primera digestión con KPN one a 37 grados Celsius durante una hora y purifique los productos con perlas magnéticas. En segundo lugar, digerir un producto con XBA uno más una unidad de fosfatasa alcalina de camarón a 37 grados centígrados durante dos horas después.Inactive la reacción a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego purifique los productos con perlas magnéticas. Ejecute una alícuota en un 1%gel, y si se ve algún plásmido sin cortar, purifique el fragmento linealizado ahora para generar una biblioteca NPRA adecuada para la transfección en células de mamíferos. Primero, prepare un trozo de marco de lectura compatible para abrir el fragmento de marco de lectura de P-M-P-R-A donante.Digiera este plásmido con KPN one y XBA one a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, aplique los productos en un gel 1%AGROS. Extraiga el fragmento de marco de lectura abierto, en este caso a 1,7 kilobases, y purifique con una columna de centrifugación de purificación de gel.A continuación, ligar el marco de lectura abierto linealizado en la biblioteca intermedia linealizada como se describe para la ligadura anterior. Transforme los productos de ligadura en células de E. coli y aísle la biblioteca final de plásmidos NPRA como se describió anteriormente. Si no tienes cuidado, llévalo adelante.Los plásmidos ajustados y los productos subplateados pueden reducir en gran medida la proporción de construcciones correctas en el grupo final de plásmidos. Asegúrese de aislar la banda correcta y comprobar si hay antecedentes antes de continuar con los siguientes pasos. Como cheque, digiera un Eloqua de uno o dos microgramos de la biblioteca NPRA con uno de KPN.Ejecute esto en un gel 1% y si se ejecuta como una sola banda, continúe. De lo contrario, consulte el protocolo de texto sobre cómo tratar la contaminación para transfectar células cultivadas. Con la NPRA.Las condiciones de los plásmidos deben optimizarse para cada tipo de célula. Por ejemplo, 5 millones de células HK 2 93 T 17 cultivadas hasta aproximadamente el 50% de confluencia en una placa de cultivo de 10 centímetros se pueden transfectar con 10 microgramos de ADN plasmídico en un mililitro de ofm, un medio sérico reducido usando 30 microlitros de lipo LTX y 10 microlitros de reactivo plus. En este caso, retire la mezcla de transfección unas cinco horas y deje que las células se recuperen durante uno o dos días después, recoja las células y use un kit para aislar el ARNm polipositivo.A continuación, haga una etiqueta, busque la biblioteca de secuenciación y analice los resultados. NPRA facilita la disección cuantitativa de alta resolución de las relaciones de actividad de secuencia de los elementos reguladores transcripcionales. Un experimento NPRA exitoso generalmente produce mediciones altamente reproducibles para la mayoría de las secuencias en la biblioteca Transfected.Si la reproducibilidad es pobre, es probable que la concentración de ARNm reporteros en el ARN recuperado sea demasiado baja. Esto puede suceder debido a una baja actividad absoluta entre las secuencias de ensayo o debido a la baja eficiencia de la transfección. En estos exitosos n PRAs, se analizaron 37.000 variantes de una secuencia de 1 45 pares de bases aguas arriba del gen del interferón beta humano con o sin exposición al virus sendi.El promotor Tata box y el potenciador proximal conocido pueden identificarse claramente como regiones ricas en información de una manera dependiente del virus. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una semana si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como EMCE y la captura de afinidad de ADN de proteínas, para responder a preguntas adicionales, como qué factor de transcripción se une a nucleótidos críticos dentro de una secuencia de ADN activa.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas reporteras para analizar las actividades reguladoras de genes de miles de secuencias de ADN en paralelo.

massively-parallel-reporter-assays-in-cultured-mammalian-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método de observación de moléculas individuales de ADN en células vivas se describe. La técnica se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia represor lac a sitios de unión ingeniería genética en el ADN de interés. Este método puede ser adaptado para seguir muchos ADNs recombinantes en células vivas en el tiempo.

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados ​​de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

Las células de mamífero que expresan el casete del gen bioluminiscencia bacteriana...

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.

Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Aprende a realizar ensayos reporteros masivamente paralelos en células de mamífero cultivadas mediante secuenciación profunda y análisis computacional. Este método permite evaluar miles de secuencias reguladoras simultáneamente.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

Explorar más videos