Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

El objetivo de este procedimiento es generar y purificar versiones de tipo salvaje y mutantes de la subunidad múltiple en el complejo de remodelación de cromatina oh 80. Esto se logra aislando primero los núcleos de las células que expresan el epítopo bandera marcado en proteínas O 80 En el segundo paso, se preparan extractos nucleares, y luego el humano de tipo salvaje o mutante en complejos de remodelación de cromatina O 80 se purifica mediante cromatografía Anti-Flag Aros. En última instancia, las composiciones de subunidades de los complejos NO 80 purificados se pueden analizar mediante Western blot o tinción de plata.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo las subunidades de los complejos de remodelación de cromatina MultiPro contribuyen a su actividad general. Este método está diseñado específicamente para estudiar las versiones de tipo salvaje y mutantes del complejo de remodelación de cromatina NO 80, pero también se puede utilizar para estudiar otros complejos nucleares de subunidades múltiples. Como el mediador.

El paso más crítico del procedimiento es el paso de extracción nuclear. Las personas generalmente tienen problemas porque durante la etapa de extracción de sal, las personas tienden a agregar sal demasiado rápido o demasiado vigorosamente. Después del cultivo En botellas de rodillo, transfiera las celdas HEC 2 9 3 a un tubo cónico graduado de tamaño adecuado y gírelas durante 10 minutos a 1000 veces G y cuatro grados Celsius. Después de retirar el supinato, mida el volumen del pellet de celda empaquetado, luego vuelva a suspender el pellet en cinco volúmenes de celda de tampón A con un pipeteo suave e incube las celdas en hielo durante exactamente 10 minutos.

Después de girar las celdas nuevamente, mida la bolita de celda por segunda vez, debería haber aumentado hasta el doble de tamaño. Esta vez, vuelva a suspender las células en dos paquetes de volúmenes de celdas de tampón A, luego transfiera la suspensión celular a un homogeneizador de tejido de tamaño adecuado y homogeneice la suspensión celular con el mortero de vidrio suelto hasta que el 90% de las células se tiñan positivamente con centrífuga de azul trian, las células homogeneizadas en un tubo de centrífuga de alta velocidad de 45 mililitros durante 20 minutos a 25, 000 veces G y cuatro grados Celsius en un rotor de ángulo fijo. A continuación, retire el natante SUP que contiene las proteínas citosólicas del pellet nuclear para extraer los núcleos con sal.

Ahora agregue 2,5 mililitros de tampón C, pero cada tres mililitros de volumen inicial de celda empaquetada al pellet. A continuación, con una pipeta serológica, desaloje el pellet de la pared del tubo y transfiera toda la mezcla a un homogeneizador de plumón del tamaño adecuado. Homogeneice la mezcla con dos golpes de un mortero suelto para resus, suspenda los núcleos y luego transfiera la fracción nuclear resuspendida a un vaso de precipitados refrigerado de tal tamaño que la suspensión llene el vaso de precipitados hasta al menos 0,5 centímetros de profundidad.

A continuación, calcule el volumen de cloruro de sodio de cinco molares necesario para llevar la solución a una concentración final de cloruro de sodio de 0,42 molares de acuerdo con la siguiente fórmula. Ahora agregue gradualmente el volumen calculado de solución salina gota a gota mientras golpea suavemente la suspensión con una varilla de vidrio sobre hielo para aumentar la concentración de sal de la suspensión hasta que se haya agregado todo el cloruro de sodio y la solución se vuelva muy viscosa. Luego, transfiera con cuidado la suspensión viscosa a tubos de policarbonato de 70 mililitros en un rotor Tipo 45 TI con ensamblaje de tapa y use un mutador para mecer lentamente los tubos sellados a cuatro grados Celsius Después de 30 minutos, ultracentrifugar las muestras en un rotor TI 45 durante 30 minutos a 40, 000 veces G y cuatro grados Celsius, y coloque el extracto nuclear que contiene sobrenadantes en un solo recipiente de plástico.

A continuación, divida la solución de extracto nuclear en alícuotas de tamaño conveniente, congélelas en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Para preparar Anti-Flag aros para la inmunopurificación, comience utilizando una pipeta de 200 microlitros con la punta cortada para transferir 200 microlitros sobre una suspensión de perlas Anti-Flag al 50% a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Transfiera las perlas prelavadas a un tubo cónico que contenga 10 mililitros de extracto nuclear recién descongelado antes de horas de cuatro grados centígrados con rotación lenta en un rotador de laboratorio, y luego recoja los aros bandera por centrifugación durante cinco minutos de 1000 veces G y cuatro grados Celsius.

A continuación, lave el extracto de perlas P en 10 mililitros de piojos, cuatro 50 tampón durante cinco minutos de cuatro grados centígrados con un balanceo suave en un mutador. Luego, después de centrifugar la mezcla de extracto de perlas, vuelva a utilizar. Suspenda el pellet en 100 a 150 microlitros de piojos frescos cuatro 50, transfiera las perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Continúe enjuagando el tubo cónico de 15 mililitros con 100 a 150 microlitros quats de Lysol 50 hasta que todas las perlas se hayan transferido al tubo de microcentrífuga. Después de centrifugar las perlas en una microcentrífuga, lávelas tres veces con un mililitro de lys four 50 y una vez con un mililitro de EB 100.Buffer. Luego, para eluir las proteínas unidas, agregue 200 microlitros de tampón EB 100 que contenga péptido bandera e incube la muestra a cuatro grados centígrados en una nuez.

Después de media hora, pegue las perlas en la microcentrífuga que obtenga y luego transfiera el SUP natant que contiene el complejo OAC C eluido a un tubo de microcentrífuga nuevo. Después de repetir el elucian cuatro veces más, pase el eluido extraído a través de una columna de centrifugación vacía para eliminar cualquier perla aerodinámica de bandera residual de la fracción de proteína. Por último, se utiliza un dispositivo de ultrafiltración centrífuga con un límite de 50.000 pesos moleculares para concentrar la fracción de proteína aludida aproximadamente 10 veces.

Como se ilustra en esta figura, la pureza de los complejos NO 80 preparados utilizando las subunidades de etiqueta bandera indicadas, como se acaba de demostrar, puede evaluarse utilizando geles de poliacrilamida SDS teñidos de plata. Cualquier proteína que aparezca en este carril de control son contaminantes que se unen de forma no específica a los aerodinámicos de bandera. Estas etiquetas indican las prohibiciones correspondientes a las subunidades NO 80 ensayadas, y estas indican las movilidades de los marcadores de peso molecular.

La posición del tipo salvaje NO 80 se indica mediante el cuadrado negro, y las posiciones de los mutantes NO 80 se indican mediante los círculos abiertos. Los carriles separados por la línea negra son de geles separados. La composición de los complejos puede evaluarse mediante Western blott utilizando anticuerpos contra varias subunidades de NO 80.

por ejemplo. Aquí se evaluaron las subunidades del módulo de dominio terminal final, el módulo asociado al centro Helicase y el módulo SNF dos. Una vez dominada, esta técnica se puede terminar en un día, comenzando con la recolección de células y terminando con la purificación de los complejos.

Esta técnica permitirá a los investigadores purificar complejos de subunidades múltiples y subcomplejos para células de mamíferos con el fin de estudiar sus funciones. Después de ver este video, tendrá una mejor comprensión de cómo purificar la remodelación de la cromatina y otros complejos de proteínas de subunidades múltiples de células humanas u otras líneas celulares de momento.