Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

El objetivo de este procedimiento es generar y purificar versiones de tipo silvestre y mutantes del complejo remodelador de cromatina multi-subunidad en oh 80. Esto se logra primero aislado los núcleos de células que expresan proteínas en O 80 marcadas con un epítopo flag. En un segundo paso, se preparan extractos nucleares, y luego se purifican los complejos remodeladores de cromatina humanos en O 80 de tipo silvestre o mutantes mediante cromatografía de afinidad con anticuerpo anti-flag. Finalmente, las composiciones de subunidades de los complejos NO 80 purificados pueden analizarse mediante inmunotransferencia (western blot) o tinción con plata.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo las subunidades de los complejos remodeladores de cromatina MultiPro contribuyen a su actividad general. Este método está diseñado específicamente para estudiar versiones de tipo silvestre y mutantes del complejo remodelador de cromatina NO 80, pero también puede utilizarse para estudiar otros complejos nucleares multienzimáticos, como el mediador.

El paso más crítico del procedimiento es el paso de extracción nuclear. Las personas suelen tener problemas porque, durante el paso de extracción con sal, tienden a agregar la sal demasiado rápido o de forma demasiado vigorosa. Tras el cultivo en botellas rotatorias, transfiera las células HEC 2 9 3 a un tubo cónico graduado de tamaño adecuado y centrifúguelas durante 10 minutos a 1000 veces G y cuatro grados Celsius. Tras eliminar el sobrenadante, mida el volumen del botón celular compactado, luego resuspenda el botón en cinco volúmenes de células compactadas del tampón A mediante pipeteo suave e incube las células en hielo durante exactamente 10 minutos.

Después de centrifugar las células nuevamente, mida el sedimento celular por segunda vez; este debería haber aumentado hasta el doble de su tamaño. Esta vez, re suspenda las células en dos volúmenes de células empaquetadas del tampón A, luego transfiera la suspensión celular a un homogenizador de tejidos de tamaño adecuado y homogenice la suspensión celular con el pistilo de vidrio suelto hasta que el 90 % de las células se tiñan positivamente con azul de tripano. Centrifugue las células homogenizadas en un tubo de centrifugación de alta velocidad de 45 mililitros durante 20 minutos a 25.000 × g y 4 grados Celsius en un rotor de ángulo fijo. Luego, retire el sobrenadante que contiene las proteínas citosólicas del sedimento nuclear para extraer los núcleos con sal.

Ahora agregue 2,5 mililitros del tampón C por cada tres mililitros de volumen celular empaquetado inicial al precipitado. Luego, utilizando una pipeta serológica, desprenda el precipitado de la pared del tubo y transfiera toda la mezcla a un homogenizador Dounce de tamaño adecuado. Homogenice la mezcla con dos movimientos de un pistilo suelto para resuspender los núcleos y, a continuación, transfiera la fracción nuclear resuspendida a un vaso de precipitados enfriado del tamaño adecuado para que la suspensión llene el vaso hasta una profundidad de al menos 0,5 centímetros.

A continuación, calcule el volumen de cloruro de sodio cinco molar necesario para llevar la solución a una concentración final de cloruro de sodio 0,42 molar según la siguiente fórmula. Ahora agregue gradualmente la solución salina calculada gota a gota mientras agita suavemente la suspensión con una varilla de vidrio sobre hielo para aumentar la concentración de sal en la suspensión hasta que todo el cloruro de sodio se haya añadido y la solución se vuelva muy viscosa. Luego, transfiera cuidadosamente la suspensión viscosa a tubos de policarbonato de 70 mililitros en un rotor tipo 45 TI con ensamblaje de tapa y use un agitador para mecer lentamente los tubos sellados a cuatro grados Celsius. Después de 30 minutos, ultracentrifugue las muestras en un rotor TI 45 durante 30 minutos a 40.000 veces G y cuatro grados Celsius, y recoja los sobrenadantes que contienen el extracto nuclear en un solo recipiente de plástico.

Luego, divida la solución de extracto nuclear en alícuotas de tamaño conveniente, congélelas rápidamente en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados Celsius. Para preparar las perlas Anti-Flag aros para inmuno purificación, comience utilizando una pipeta de 200 microlitros con la punta cortada para transferir 200 microlitros de una suspensión al 50 % de perlas Anti-Flag aros a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Transfiera las perlas prelavadas a un tubo cónico que contenga 10 mililitros de extracto nuclear recién descongelado y incube durante horas a 4 grados Celsius con rotación lenta en un rotador de laboratorio, y luego recopile las perlas Flag aros mediante centrifugación durante cinco minutos a 1000 veces G y 4 grados Celsius.

A continuación, lave el extracto de perlas P con 10 mililitros de tampón lisis cuatro 50 durante cinco minutos a cuatro grados Celsius con agitación suave en un agitador. Luego, después de centrifugar la mezcla de extracto de perlas, reutilice nuevamente. Suspenda el sedimento en 100 a 150 microlitros de tampón lisis cuatro 50 fresco y transfiera las perlas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Continúe enjuagando el tubo cónico de 15 mililitros con cuartas partes de 100 a 150 microlitros de Lysol 50 hasta que todas las perlas se hayan transferido al tubo de microcentrífuga. Después de centrifugar las perlas en una microcentrífuga, lávelas tres veces con un mililitro de lys four 50 y una vez con un mililitro de EB 100.Buffer. Luego, para eluir las proteínas unidas, agregue 200 microlitros de tampón EB 100 que contenga péptido flag y incube la muestra a cuatro grados Celsius en un agitador rotatorio.

Después de media hora, centrifugue las perlas en la microcentrífuga para obtener un pellet y luego transfiera el sobrenadante que contiene el complejo OAC C eluido a un tubo nuevo de microcentrífuga. Después de repetir la elución otras cuatro veces, pase el eluido recolectado a través de una columna de centrifugación vacía para eliminar cualquier resto de perlas Flag del fraccionamiento proteico. Finalmente, utilice un dispositivo de ultrafiltración centrífuga con un límite de peso molecular de 50.000 para concentrar aproximadamente 10 veces la fracción proteica eluida.

Como se ilustra en esta figura, la pureza de los complejos NO 80 preparados utilizando las subunidades con etiqueta flag indicadas, tal como se acaba de demostrar, puede evaluarse mediante geles de poliacrilamida SDS teñidos con plata. Cualquier proteína que aparezca en esta banda de control corresponde a contaminantes que se unen de forma no específica a las resinas flag. Estas etiquetas indican las bandas correspondientes a las subunidades del complejo NO 80 analizadas, y estas otras indican las movilidades de los marcadores de peso molecular.

La posición del tipo silvestre NO 80 se indica mediante el cuadrado negro, y las posiciones de los mutantes NO 80 se indican mediante círculos abiertos. Las bandas separadas por la línea negra provienen de geles distintos. La composición de los complejos puede evaluarse mediante inmunotransferencia con anticuerpos contra diversas subunidades de NO 80.

Por ejemplo, se evaluaron las subunidades del módulo del dominio terminal final, el módulo asociado al centro de helicasa y el módulo SNF2. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en un día, comenzando con la recolección de células y terminando con la purificación de los complejos.

Esta técnica permitirá a los investigadores purificar complejos con múltiples subunidades y subcomplejos de células de mamíferos para estudiar sus funciones. Después de ver este video, tendrá una mejor comprensión de cómo purificar complejos de proteínas remodeladoras de la cromatina y otros complejos proteicos con múltiples subunidades a partir de líneas celulares humanas u otras líneas celulares de mamíferos.