Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

El objetivo del siguiente procedimiento es medir las diversas actividades bioquímicas de complejos de remodelación de cromatina dependientes de TP. Esto se logra midiendo el desplazamiento dependiente de TP de un nucleosoma posicionado desde un extremo de una molécula de ADN hacia una posición más central en el ADN, mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética o EMSA. Un método basado en EMSA similar puede utilizarse para monitorear la formación de mononucleosomas unidos a complejos de remodelación, a fin de evaluar la actividad de unión a nucleosomas de los complejos de remodelación de cromatina.

Además, la cromatografía en capa fina puede utilizarse para medir la actividad de las APA en complejos de remodelación de la cromatina dependientes de TP. En última instancia, estos métodos pueden emplearse para medir la remodelación de la cromatina dependiente de TP en complejos humanos de O 80. En este video, demostraremos ensayos bioquímicos para estudiar los complejos de remodelación de la cromatina de NO 80.

Un método similar también puede aplicarse para estudiar otros complejos de remodelación de la cromatina, así como para realizar un ensayo de remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Primero, prepare sustratos de nucleosomas tras configurar una reacción de PCR de 100 microlitros según se indica en la tabla. Realice las reacciones de PCR en un termociclador y luego pase los productos de la reacción dos veces a través de columnas giratorias libres de nucleasas para eliminar cualquier nucleótido no incorporado.

A continuación, mezcle dos ole de fragmentos de ADN 6 0 1 marcados con P 32 con seis microgramos de nucleosomas hilar en 50 microlitros de tampón, e incube la mezcla a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, diluya secuencialmente la mezcla a 0,8 molar, 0,6 molar y 0,4 molar de cloruro de sodio mediante la adición de 12,5 microlitros, 20,8 microlitros y 41,6 microlitros, respectivamente, de solución tampón de tris HCL suplementada con E-D-T-A-P-M-S-F y DTT, incubando durante 30 minutos a 30 grados Celsius tras cada adición, después de la última incubación agregue 125 y luego 250 microlitros del tampón de clorhidrato de tris. Suplemente adicionalmente con P 40 no indebt, glicerol y PSA en otras dos diluciones de 30 minutos a 30 grados Celsius, hasta alcanzar 0,2 molar y 0,1 molar de cloruro de sodio, respectivamente.

Luego, almacene el sustrato de mononucleosoma a cuatro grados Celsius durante hasta tres meses antes de preparar los ensayos con geles nativos de poliacrilamida. A continuación, para cada reacción que se vaya a realizar, combine alrededor de 20 nanomolares en oh 80 con la cantidad adecuada de tampón EB 100 suficiente para obtener un volumen de 4,75 microlitros en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros siliconizado y previamente enfriado. Congele inmediatamente cualquier fracción restante que contenga NO 80, utilizando hielo seco en polvo.

A continuación, distribuya 5,25 µL de la mezcla maestra recién preparada en cada tubo de reacción, mezclando bien mediante pipeteo arriba y abajo. Luego, incube las reacciones en un bloque térmico a 30 °C. Al final de la incubación, agregue 1,5 µL de la mezcla removedora recién preparada a cada tubo para detener las reacciones y, a continuación, mezcle cada tubo de reacción.

Centrifugue bien y luego incube a 30 grados Celsius durante otros 30 minutos. Mientras tanto, pre-corra el gel nativo de poliacrilamida en una unidad de electroforesis vertical a 100 voltios durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, utilizando TBE 0,5X como tampón de corrida y una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener una circulación constante del tampón. Al final de la incubación, retire la mezcla, agregue 2,5 microlitros de colorante de carga a cada reacción. Después de una breve centrifugación, utilice puntas de carga para aplicar las muestras en el gel.

Corra el gel a 200 voltios durante 4,5 horas a cuatro grados Celsius con circulación de tampón. Luego, transfiera el gel a una pila de dos hojas de papel filtro y coloque los filtros con el gel encima utilizando una envoltura de plástico transparente para detectar la señal. Exponga el gel a una pantalla de fósforo de almacenamiento a cuatro grados Celsius durante el tiempo deseado, y luego escanee la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analice los datos utilizando el software adecuado para realizar los ensayos de APAs dependientes de ADN y nucleosomas.

Comience combinando de 10 a 50 nanomolares de los subcomplejos inmuno purificados con una cantidad suficiente de tampón eeb 100 para obtener un volumen de 2,2 microlitros en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros preenfriado y lubricado por cada reacción, y luego congele inmediatamente cualquier fracción que contenga NO 80 en hielo seco pulverizado. A continuación, mezcle suavemente 2,8 microlitros del cóctel sub recién preparado que contiene nucleosomas de ADN o ninguno de los dos, en los tubos de reacción que contienen la enzima, mediante pipeteo ascendente y descendente, y transfiera los tubos a un bloque térmico a 30 grados Celsius. A continuación, utilice un lápiz para trazar una línea muy tenue a al menos 1,5 centímetros del borde inferior de un polietileno de 20 por 10.

Me refiero a una placa de cromatografía en capa fina o placa TLC. Luego, aplique 0,5 microlitros de cada mezcla de reacción sobre la línea a los 5, 15, 30 y 60 minutos posteriores a la incubación, devolviendo inmediatamente cada muestra al bloque térmico, de modo que se puedan obtener múltiples puntos temporales a partir de un solo tubo. Después de aplicar la última muestra, use un secador de pelo para secar la placa y luego transfiera la placa a una cámara de vidrio que contenga suficiente.

Fosfato de potasio 0,375 molar para permitir que el extremo inferior de 0,5 centímetros de la placa de TLC quede sumergido en la solución. Tape la cámara y desarrolle la reacción hasta que el frente de la fase líquida alcance la parte superior de la placa de TLC, momento en el cual la placa debe secarse inmediatamente con aire y exponerse a una pantalla fosfoimagen a temperatura ambiente. Finalmente, escanee la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos para determinar la cantidad de sustrato radiactivo a TP y producto a DP.

Este primer experimento demuestra que el complejo purificado mediante la etiqueta IES dos banderas, N-O-A-T-E y la bandera NO 80 delta N, presenta actividades de deslizamiento de nucleosomas similares, lo que indica que el extremo N-terminal de NO 80 y/o sus subunidades asociadas son prescindibles para la remodelación de nucleosomas por el complejo NO 80. En contraste, el complejo purificado mediante la etiqueta NO 80 delta n delta HSA es inactivo en este ensayo, lo que indica que la actividad de remodelación depende del dominio HSA de las APAs de NO 80 y/o sus subunidades asociadas. Mediante una modificación del procedimiento del ensayo de deslizamiento de NUCLEOSOMA, se puede medir la actividad de unión a nucleosomas de los complejos de remodelación de cromatina.

En este experimento, la incubación de los nucleosomas con cantidades crecientes de complejos NO 80 intactos purificados mediante la subunidad NO 80 E provocó la desaparición dependiente de la dosis de la banda correspondiente a los mononucleosomas libres y la aparición de una nueva especie desplazada que migró cerca de la parte superior del gel. En contraste, cuando los nucleosomas se incubaron con complejos más pequeños purificados mediante NO 80 delta N y que carecían de un subconjunto de subunidades de NO 80, la especie desplazada migró más rápidamente, lo que sugiere que la movilidad relativa de la banda sobredesplazada está determinada por el tamaño de los complejos en el ensayo. En este último experimento, se muestran los resultados de un ensayo que compara las actividades de APA activadas por ADN y por nucleosomas de dos subcomplejos diferentes de NO 80.

Los puntos que migran más lentamente corresponden al TP-alfa marcado con 32P que sirve como punto de partida, y las especies que migran más rápidamente son los productos de la reacción ADP, con áreas que indican la dirección de la migración del disolvente. Al utilizar estos procedimientos, es importante recordar realizar ensayos que varíen en la duración y que contengan diferentes concentraciones de enzima. Esto garantizará que las mediciones se realicen cuando las curvas de respuesta del producto frente al tiempo y a la dosis sean lineales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las actividades de unión a nucleosomas y deslizamiento de nucleosomas de complejos purificados de remodelación de cromatina. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser peligroso. Se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio y protección ocular, monitorear la contaminación radiactiva y desechar adecuadamente los desechos radiactivos.