Name: Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende ensayos bioquímicos para analizar enzimas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP usando EMSA y cromatografía en capa fina. Estos métodos permiten medir deslizamiento de nucleosomas e hidrólisis de ATP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo en el laboratorio de los autores está respaldado por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM41628) y por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson en la Fundación Comunitaria del Gran Kansas City.

1. ATP-dependientes Nucleosome Remodelación ensayos Para medir las actividades de remodelación nucleosoma dependiente de ATP, inmunopurificado INO80 o subcomplexes INO80 se incuban con ATP y un sustrato mononucleosomal, que contiene un único nucleosoma posicionado en un extremo de un fragmento de ADN de 216 pb, marcado con P 32. Los productos de reacción se someten después a electroforesis en geles de poli-acrilamida nativos. <ol><li> Para generar el fragmento de ADN marcado con 32P &#39;601&#39;, amplificar de pGEM-3Z-601 4 un fragmento de ADN de 216 pb que contiene una secuencia de 601 el posicionamiento de nucleosomas final ubicado, utilizando los oligonucleótidos 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG y 5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG como adelante y atrás primers. <ol><li> Configurar una reacción de PCR 100 l como se describe en la Tabla 1. </li><li> Lleve a cabo las reacciones de PCR en un termociclador con el siguiente programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando con 7 min a 72 ° C. </li><li> Después de que se terminó la reacción de PCR, eliminar los nucleótidos no incorporados haciendo pasar los productos de reacción dos veces a través de columnas de centrifugado sin nucleasa. </li><li> Ejecutar 5 l de producto de PCR purificado en un gel de agarosa al 1,2% para confirmar que la reacción de PCR generó el fragmento de ADN de ~ 216 pb deseado. </li><li> Diluir 5 l de producto de PCR purificado de 20 veces, y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. El rendimiento promedio es de ~ 40 ng / l. </li><li> Medir la radiactividad de 1 l de producto de PCR purificado en un contador de centelleo. Estimar el etiquetado de eficiencia mediante el cálculo de la cpm / ng. Se espera una reacción de marcado con éxito para producir ~ 15.000 cpm / ng de fragmento de ADN de 601. </li></ol></li><li> Transferencia de células HeLa nucleosomas en el ADN marcado 601 utilizando un método de dilución en serie 5. <ol><li> Mezclar 2 pmol de32 P-etiquetados 601 fragmento de ADN con 6 g de nucleosomas Hela (preparado como se describe 5) en 50 l de un tampón que contenía NaCl 1,0 M, Tris-HCl 10, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y 1 mM TDT y se incuba a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Secuencialmente se diluye la mezcla a 0,8 M, 0,6 M y NaCl 0,4 M por dilución con 12,5 l, 20,8 l, y 41,6 l, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y DTT 1 mM, con una incubación de 30 min a 30 ° C después de cada dilución. </li><li> Además se diluye la mezcla a 0,2 M y luego a NaCl 0,1 M mediante la adición de 125 l y luego 250 l de la misma solución tampón que contiene 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, y 200 mg / ml de BSA, con una incubación de 30 min a 30 ° C entre las dos últimas diluciones. Almacenar el sustrato mononucleosome a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol></li><li> Realizar reacciones nucleosoma deslizamiento dependientes de ATP en un volumen total de 10 l. El reaction componentes se enumeran en la Tabla 2. Puesto que la concentración de NaCl óptima para INO80 actividad de remodelación nucleosoma es de ~ 50 mM de NaCl (resultados no publicados), ajustar la concentración total de NaCl en cada reacción a 50 mM, teniendo en cuenta la cantidad de contenido en NaCl preparaciones de nucleosomas y enzima. <ol><li> Antes de comenzar a configurar los ensayos, emitidos geles poli-acrilamida nativos (18 x 16 cm). Para preparar un solo gel que contiene 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida 37.5: 1), TBE 0,5 x (Tris 45 mM borato, EDTA 1 mM), persulfato de amonio 0,01% (APS), y 0,001% de N, N, N &#39;, N &#39;tetrametiletilendiamina (TEMED), mezclar los ingredientes enumerados en la Tabla 3. Deje que el gel se polimerice por lo menos durante 2 horas a RT. </li><li> Mientras tanto, para que se realice cada reacción, se combinan en un tubo de 1.5 ml con silicona previamente enfriado ~ 20 nM INO80 o subcomplejo INO80 (preparada como se describe 3) con una cantidad de tampón EB100 ( <strong&gt; Tabla 4) suficiente para dar un volumen de 4,75 l. Inmediatamente vuelva a congelar las fracciones que contiene INO80-que quedan en hielo seco en polvo o nitrógeno líquido. </li><li> Establecer un cóctel principal con el resto de los ingredientes, la ampliación por un factor de &#39;X&#39; (donde X = número total de reacciones 3). La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción de 10 l se enumera en la Tabla 5; la receta debe ampliarse de acuerdo con el número de reacciones a realizar. Mezclar bien tocando el tubo o pipeta hacia arriba y hacia abajo con un Pipetman y hacer girar el tubo durante unos segundos en una microcentrífuga de sobremesa. </li><li> Dispensar 5,25 l de cóctel de maestro a cada uno de los tubos de reacción preparada en el paso 1.3.2. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Iniciar las reacciones mediante la transferencia de los tubos de reacción a un baño de 30 ° C o bloque de calor de agua y se incuba durante 2 hr. </li><li> Mientras tanto, preparar &#39;la eliminación de mezcla&#39; cóctel que contiene ADN competidory nucleosomas, la ampliación por un factor de X (X = número total de reacciones + 4). La cantidad de cada ingrediente necesario para preparar 1,5 l de la mezcla para la eliminación de una sola reacción se enumera en la Tabla 6; la receta debe ser ampliado en función del número de ensayos a realizar. </li><li> Terminar reacciones mediante la adición de 1,5 l de la mezcla de la eliminación. Mezclar bien, girar hacia abajo, y se incuba a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Mientras tanto, pre-ejecutar el gel de poliacrilamida nativo en una unidad de electroforesis vertical en 100 V durante 30 min a 4 ° C, utilizando TBE 0.5x como tampón con una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener la circulación de tampón constante. </li><li> Para cargar la muestra, añadir 2,5 l de colorante de carga que contiene 3x TBE, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol, y 0,25% de xileno cianol FF. Mezclar bien, girar brevemente las muestras, y la carga en el gel usando puntas de carga. </li><li> Correr el gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C con circulación de buffer.</li><li> Para detectar la señal, transferir el gel a una pila de dos hojas de papel de filtro. Envuelva el papel de filtro con el gel en la parte superior mediante una envoltura de plástico transparente, y luego exponerlo a una pantalla de fósforo de almacenamiento a 4 ° C durante el tiempo deseado. </li><li> Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analizar los datos utilizando un software adecuado. </li></ol></li></ol> 2. Mononucleosome ensayos de unión Para ensayar la afinidad de unión de un complejo INO80 dado para mononucleosomes, realice un cambio de movilidad electroforética de ensayo (EMSA) utilizando el sustrato mononucleosomal generada en el paso 1.2. <ol><li> Configurar la reacción de mezclas para ensayos de unión como se ha descrito para los ensayos de remodelación de nucleosomas, pero omitir la ATP y la eliminación de la mezcla de las reacciones; incubar a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Añadir 2,5 l de colorante de carga a cada mezcla de reacción, y se aplican a un gel de poliacrilamida nativo que contiene 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37.5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% de APS, 0,001% y TEMED. </li><li> El uso de TBE 0.5x como tampón, ejecute el gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C con circulación de tampón y se exponga a una pantalla de fósforo de almacenamiento. </li></ol> 3. ADN y Nucleosoma-ATPasa dependiente Ensayos Realizar ensayos de ATPasa en las mezclas de reacción 5 l que contenía 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 60 mM, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 Ci de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complejo INO80 o cantidad de complejo INO80 a ensayar establecer tres reacciones paralelas, una memoria intermedia que contiene EB100 para medir ADN o nucleosoma-ATPasa independiente, uno que contiene ADN plásmido circular cerrado (5.000 pb, ~ 30 nM) para medir el ADN ATPasa dependiente, y una que contiene Hela oligonucleosomas (~ 185 nm) para medir-nucleosoma ATPasa dependiente. Configure todas las reacciones en hielo. <ol&gt; <li> Para cada reacción, se combinan 10-50 nm de la INO80 o INO80 subcomplexes inmunopurificados con una cantidad de tampón EB100 suficiente para dar un volumen de 2,2 l en 1,5 ml tubos de microcentrífuga lubricados pre-refrigerados. Inmediatamente vuelva a congelar las fracciones que contiene INO80-en hielo seco en polvo o nitrógeno líquido. </li><li> Establecer un cóctel maestro. La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción se enumera en la Tabla 7. Escala la receta por la ampliación por un factor de 3 (X + 2) 1, donde X = el número de preparaciones INO80 a ensayar. </li><li> Para preparar conteniendo buffer &#39;sub-cócteles&#39; solamente, ADN, o nucleosomas, dispensan 2.5 (X + 2) l del cocktail master en tres tubos separados. Añadir 0,3 (X + 2) l de cualquiera de EB100, el ADN plásmido circular cerrado (1,5 g / l), o Hela oligonucleosomas (1,5 g / l) y mezclar bien. </li><li> Prescindir de 2,8 l de la sub-cóctel apropiado para los tubos de reacción que contienen enzimas con base en St.ep 3.1. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar; evitar la introducción de burbujas. </li><li> Para iniciar reacciones, transferir los tubos de reacción a un bloque de calor a 30 ° C. </li><li> Después de 5, 15, 30, y 60 min de incubación, detectar 0,5 l de cada mezcla de reacción en una cromatografía de polietilenimina celulosa de capa fina (TLC) placa (20 x 10 cm) en una línea recta al menos 1,5 cm del borde inferior . Devolver inmediatamente tubos de reacción a la 30 ° bloque de calor C por lo que múltiples puntos de tiempo se pueden tomar de un solo tubo. Después de las salpicaduras, seque las placas de TLC utilizando un secador de pelo. </li><li> Transferir las placas de TLC a una cámara de vidrio que contiene suficiente fosfato de potasio 0,375 M (pH 3,5) para permitir que la parte inferior 0,5 cm de la placa de TLC se sumergieron en la solución. </li><li> Cubra la cámara, y esperar que el frente de la fase líquida alcanza la parte superior de las placas de TLC. Inmediato secar las placas a fondo con un secador de pelo. </li><li> Exponga las placas de TLC secas a una pantalla de fósforo de almacenamiento a temperatura ambiente.Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y determinar la cantidad de sustrato ATP radiactivo y producto ADP. </li><li> Para calcular la cantidad de ATP hidrolizado, multiplique el ATP% hidrolizado por la cantidad de ATP presente en la mezcla de reacción de partida utilizando la siguiente fórmula: ATP hidrolizado pmol = 10 ATP pmol en el inicio de la reacción x [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
<li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li>
<li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Para asegurarse de que la remodelación nucleosoma y actividades de ATPasa se observa en los ensayos dependen de la actividad catalítica de complejos INO80, y no en la contaminación de la remodelación y / o enzimas ATPasa, que nucleosoma ensayo de forma rutinaria la remodelación y la actividad ATPasa de versiones catalíticamente inactivos de Ino80, purificado en en paralelo con el tipo salvaje INO80 utilizando el mismo procedimiento. Una reacción de control negativo que carece de ATP también se debe realizar cuando el en...

Complejos remodeladores de cromatina familia SNF2 incluyen una SNF2 como ATPasa subunidad central de 1,2. Algunos ATPasas función como SNF2 como enzimas de subunidades individuales, mientras que otros funcionan como la subunidad catalítica de complejos de múltiples subunidades más grandes. Dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales cada una de las subunidades de la cromatina complejos remodeladores de contribuir a sus actividades requiere la capacidad de realizar ensayos bioquímicos que diseccionan el proceso de remodelación. Remodelación nucleosoma dependiente de ATP por el complejo INO80 humana y otras enzimas remodelación de la cromatina puede ser concebido como un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión de la enzima a la remodelación nucleosomas, seguido por la activación de su ADN y / o nucleosoma-ATPasa dependiente, translocación de la enzima sobre el ADN nucleosomal remodelación, y la eventual reposicionamiento de los nucleosomas 1,2. La comprensión de los detalles moleculares de la ATP-dependiente proceso de remodelación de la cromatina requiere disección de la reacción de remodelación en sus pasos individuales y definición de las contribuciones de las subunidades individuales del complejo de remodelación de la cromatina a cada etapa de la reacción. Tales análisis requieren la capacidad de analizar la remodelación nucleosoma y otras actividades utilizando sustratos moleculares definidos in vitro. En un protocolo JOVE anterior, describimos los procedimientos utilizados para generar complejos remodeladores de cromatina INO80 y subcomplexes con composiciones de subunidades definidas 3. A continuación, presentamos tres ensayos bioquímicos que permiten el análisis cuantitativo de la unión, ADN y-nucleosoma activado ATPasa, y actividades de remodelación de nucleosomas asociados con tales complejos de nucleosomas.

<table><tbody><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa Sigma</td><td></td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón de reacción PCR&nbsp;</td><td>Roche Ciencias Aplicadas&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Roche Taq ADN polimerasa</td><td>Roche Ciencia aplicada&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Columnas de espín sin nucleasa NucAway&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Cat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ATP ultrapuro;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilamida/Bis 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón sonicado&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amonio al 10% (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>benzonasa&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Cat. Nº 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6.000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR termociclador PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer unidad de electroforesis vertical Hoefer</td><td></td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga lubricados de 1,5 ml&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de fósforo de almacenamiento&nbsp;</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM papel de filtro</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageQuant</td> GE <td>Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC Placas de vidrio, PEI-Celulosa F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de transferencia Immobilon-FL 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>Medidor topográfico de uso general con ventana final o panqueque Sonda GM (Geiger-Mueller)</td><td>Biodex</td><td>Modelo 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

los ensayos bioquímicos para actividades analizando de atp-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Los miembros de la familia SNF2 de ATPasas a menudo funcionan como componentes de complejos de remodelación de cromatina de múltiples subunidades que regulan la dinámica de los nucleosomas y la accesibilidad del ADN mediante la catalización de la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. La disección bioquímica de las contribuciones de las subunidades individuales de dichos complejos a la reacción de remodelación de la cromatina dependiente de ATP de varios pasos requiere el uso de ensayos que monitoreen la producción de productos de reacción y midan la formación de intermedios de reacción. Este protocolo JOVE describe ensayos que permiten medir las actividades bioquímicas de los complejos o subcomplejos de remodelación de la cromatina que contienen varias combinaciones de subunidades. La remodelación de la cromatina se mide mediante un ensayo deslizante de nucleosoma dependiente de ATP, que monitorea el movimiento de un nucleosoma en una molécula de ADN mediante un método basado en el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). La actividad de unión a nucleosomas se mide mediante el seguimiento de la formación de mononucleosomas unidos a complejos de remodelación utilizando un método similar basado en EMSA, y la actividad de la ATPasa dependiente del ADN o de los nucleosomas se analiza mediante cromatografía en capa fina (TLC) para medir la tasa de conversión de ATP en ADP y fosfato en presencia de ADN o nucleosomas. Usando estos ensayos, se pueden examinar las funciones de las subunidades de un complejo de remodelación de cromatina comparando las actividades del complejo completo con las que carecen de una o más subunidades. El complejo de remodelación de la cromatina humana INO80 se utiliza como ejemplo; Sin embargo, los métodos descritos aquí se pueden adaptar al estudio de otros complejos de remodelación de la cromatina.

Las cifras muestran resultados representativos de ensayos bioquímicos utilizados para caracterizar las actividades INO80, incluyendo nucleosoma deslizamiento (Figura 1) y vinculante (Figura 2) y ensayos de ADN o ATPasa ensayos nucleosomas dependiente (Figura 3). El experimento mostrado en la Figura 1 compara la capacidad de los complejos de INO80 intactas purificó a través de FLAG-NIF N ° 2 o FLAG-INO80E y de INO80 subcomple...

Aquí describimos ensayos bioquímicos que se pueden utilizar para caracterizar las enzimas de remodelación de la cromatina dependientes de ATP por sus capacidades para 1) catalizar el deslizamiento de nucleosomas dependientes de ATP, 2) interactuar con sustratos de nucleosomas y 3) hidrolizar ATP de una manera dependiente de nucleosomas o ADN.

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

El objetivo del siguiente procedimiento es medir las diversas actividades bioquímicas de complejos de remodelación de cromatina dependientes de TP. Esto se logra midiendo el desplazamiento dependiente de TP de un nucleosoma posicionado desde un extremo de una molécula de ADN hacia una posición más central en el ADN, mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética o EMSA. Un método basado en EMSA similar puede utilizarse para monitorear la formación de mononucleosomas unidos a complejos de remodelación, a fin de evaluar la actividad de unión a nucleosomas de los complejos de remodelación de cromatina.Además, la cromatografía en capa fina puede utilizarse para medir la actividad de las APA en complejos de remodelación de la cromatina dependientes de TP. En última instancia, estos métodos pueden emplearse para medir la remodelación de la cromatina dependiente de TP en complejos humanos de O 80. En este video, demostraremos ensayos bioquímicos para estudiar los complejos de remodelación de la cromatina de NO 80.Un método similar también puede aplicarse para estudiar otros complejos de remodelación de la cromatina, así como para realizar un ensayo de remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Primero, prepare sustratos de nucleosomas tras configurar una reacción de PCR de 100 microlitros según se indica en la tabla. Realice las reacciones de PCR en un termociclador y luego pase los productos de la reacción dos veces a través de columnas giratorias libres de nucleasas para eliminar cualquier nucleótido no incorporado.A continuación, mezcle dos ole de fragmentos de ADN 6 0 1 marcados con P 32 con seis microgramos de nucleosomas hilar en 50 microlitros de tampón, e incube la mezcla a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, diluya secuencialmente la mezcla a 0,8 molar, 0,6 molar y 0,4 molar de cloruro de sodio mediante la adición de 12,5 microlitros, 20,8 microlitros y 41,6 microlitros, respectivamente, de solución tampón de tris HCL suplementada con E-D-T-A-P-M-S-F y DTT, incubando durante 30 minutos a 30 grados Celsius tras cada adición, después de la última incubación agregue 125 y luego 250 microlitros del tampón de clorhidrato de tris. Suplemente adicionalmente con P 40 no indebt, glicerol y PSA en otras dos diluciones de 30 minutos a 30 grados Celsius, hasta alcanzar 0,2 molar y 0,1 molar de cloruro de sodio, respectivamente.Luego, almacene el sustrato de mononucleosoma a cuatro grados Celsius durante hasta tres meses antes de preparar los ensayos con geles nativos de poliacrilamida. A continuación, para cada reacción que se vaya a realizar, combine alrededor de 20 nanomolares en oh 80 con la cantidad adecuada de tampón EB 100 suficiente para obtener un volumen de 4,75 microlitros en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros siliconizado y previamente enfriado. Congele inmediatamente cualquier fracción restante que contenga NO 80, utilizando hielo seco en polvo.A continuación, distribuya 5,25 µL de la mezcla maestra recién preparada en cada tubo de reacción, mezclando bien mediante pipeteo arriba y abajo. Luego, incube las reacciones en un bloque térmico a 30 °C. Al final de la incubación, agregue 1,5 µL de la mezcla removedora recién preparada a cada tubo para detener las reacciones y, a continuación, mezcle cada tubo de reacción.Centrifugue bien y luego incube a 30 grados Celsius durante otros 30 minutos. Mientras tanto, pre-corra el gel nativo de poliacrilamida en una unidad de electroforesis vertical a 100 voltios durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, utilizando TBE 0,5X como tampón de corrida y una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener una circulación constante del tampón. Al final de la incubación, retire la mezcla, agregue 2,5 microlitros de colorante de carga a cada reacción. Después de una breve centrifugación, utilice puntas de carga para aplicar las muestras en el gel.Corra el gel a 200 voltios durante 4,5 horas a cuatro grados Celsius con circulación de tampón. Luego, transfiera el gel a una pila de dos hojas de papel filtro y coloque los filtros con el gel encima utilizando una envoltura de plástico transparente para detectar la señal. Exponga el gel a una pantalla de fósforo de almacenamiento a cuatro grados Celsius durante el tiempo deseado, y luego escanee la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analice los datos utilizando el software adecuado para realizar los ensayos de APAs dependientes de ADN y nucleosomas.Comience combinando de 10 a 50 nanomolares de los subcomplejos inmuno purificados con una cantidad suficiente de tampón eeb 100 para obtener un volumen de 2,2 microlitros en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros preenfriado y lubricado por cada reacción, y luego congele inmediatamente cualquier fracción que contenga NO 80 en hielo seco pulverizado. A continuación, mezcle suavemente 2,8 microlitros del cóctel sub recién preparado que contiene nucleosomas de ADN o ninguno de los dos, en los tubos de reacción que contienen la enzima, mediante pipeteo ascendente y descendente, y transfiera los tubos a un bloque térmico a 30 grados Celsius. A continuación, utilice un lápiz para trazar una línea muy tenue a al menos 1,5 centímetros del borde inferior de un polietileno de 20 por 10.Me refiero a una placa de cromatografía en capa fina o placa TLC. Luego, aplique 0,5 microlitros de cada mezcla de reacción sobre la línea a los 5, 15, 30 y 60 minutos posteriores a la incubación, devolviendo inmediatamente cada muestra al bloque térmico, de modo que se puedan obtener múltiples puntos temporales a partir de un solo tubo. Después de aplicar la última muestra, use un secador de pelo para secar la placa y luego transfiera la placa a una cámara de vidrio que contenga suficiente.Fosfato de potasio 0,375 molar para permitir que el extremo inferior de 0,5 centímetros de la placa de TLC quede sumergido en la solución. Tape la cámara y desarrolle la reacción hasta que el frente de la fase líquida alcance la parte superior de la placa de TLC, momento en el cual la placa debe secarse inmediatamente con aire y exponerse a una pantalla fosfoimagen a temperatura ambiente. Finalmente, escanee la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos para determinar la cantidad de sustrato radiactivo a TP y producto a DP.Este primer experimento demuestra que el complejo purificado mediante la etiqueta IES dos banderas, N-O-A-T-E y la bandera NO 80 delta N, presenta actividades de deslizamiento de nucleosomas similares, lo que indica que el extremo N-terminal de NO 80 y/o sus subunidades asociadas son prescindibles para la remodelación de nucleosomas por el complejo NO 80. En contraste, el complejo purificado mediante la etiqueta NO 80 delta n delta HSA es inactivo en este ensayo, lo que indica que la actividad de remodelación depende del dominio HSA de las APAs de NO 80 y/o sus subunidades asociadas. Mediante una modificación del procedimiento del ensayo de deslizamiento de NUCLEOSOMA, se puede medir la actividad de unión a nucleosomas de los complejos de remodelación de cromatina.En este experimento, la incubación de los nucleosomas con cantidades crecientes de complejos NO 80 intactos purificados mediante la subunidad NO 80 E provocó la desaparición dependiente de la dosis de la banda correspondiente a los mononucleosomas libres y la aparición de una nueva especie desplazada que migró cerca de la parte superior del gel. En contraste, cuando los nucleosomas se incubaron con complejos más pequeños purificados mediante NO 80 delta N y que carecían de un subconjunto de subunidades de NO 80, la especie desplazada migró más rápidamente, lo que sugiere que la movilidad relativa de la banda sobredesplazada está determinada por el tamaño de los complejos en el ensayo. En este último experimento, se muestran los resultados de un ensayo que compara las actividades de APA activadas por ADN y por nucleosomas de dos subcomplejos diferentes de NO 80.Los puntos que migran más lentamente corresponden al TP-alfa marcado con 32P que sirve como punto de partida, y las especies que migran más rápidamente son los productos de la reacción ADP, con áreas que indican la dirección de la migración del disolvente. Al utilizar estos procedimientos, es importante recordar realizar ensayos que varíen en la duración y que contengan diferentes concentraciones de enzima. Esto garantizará que las mediciones se realicen cuando las curvas de respuesta del producto frente al tiempo y a la dosis sean lineales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las actividades de unión a nucleosomas y deslizamiento de nucleosomas de complejos purificados de remodelación de cromatina. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser peligroso. Se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio y protección ocular, monitorear la contaminación radiactiva y desechar adecuadamente los desechos radiactivos.

biochemical-assays-for-analyzing-activities-atp-dependent-chromatin

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) es un método...

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.

Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Este protocolo describe una batería de métodos que incluye cromatografía analítica de exclusión de tamaño para estudiar la oligomerización y estabilidad de la chaperona de histonas, ensayo de extracción hacia abajo para desentrañar las interacciones chaperona-histona de histonas, AUC para analizar la estequiometría de los complejos de proteínas y ensayo de acompañamiento de histonas para caracterizar funcionalmente una chaperona de histonas putativa in vitro.

In vitro Caracterización de chaperonas de histonas mediante ensayos analíticos, pull-down y acompañantes

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.

Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

Aprende ensayos bioquímicos para analizar enzimas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP usando EMSA y cromatografía en capa fina. Estos métodos permiten medir deslizamiento de nucleosomas e hidrólisis de ATP.

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

Explorar más videos