Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal
31 de julio de 2014
Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.
El objetivo general de este procedimiento es realizar una oclusión permanente de la arteria cerebral media distal de un ratón, provocando un infarto que se localiza principalmente en la corteza y cuyo tamaño es relativamente similar al de los accidentes cerebrovasculares humanos. Esto se logra primero evaluando la línea base de asimetría en el uso de las extremidades antes de la cirugía. El siguiente paso del procedimiento consiste en realizar la cirugía de inducción del accidente cerebrovascular mediante electrocoagulación de la arteria cerebral media distal.
Después de la cirugía, se evalúan los déficits sensitivomotores focales mediante la puntuación de la asimetría en el uso de las cuatro extremidades. Una vez más, el paso final consiste en analizar el volumen del infarto utilizando tinción con violeta cristal. En última instancia, las lesiones corticales resultantes tienen un tamaño moderado con poca variación, lo que convierte a esta técnica en un modelo valioso para la investigación básica y traslacional del accidente cerebrovascular.
Las principales ventajas de esta técnica frente a otros modelos comunes de accidente cerebrovascular son que la tasa de mortalidad en este modelo es mínima, así como el volumen y la localización del infarto. La corteza cerebral representa la mayoría de los accidentes cerebrovasculares humanos y este modelo es altamente reproducible. En general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades al principio con la eliminación cuidadosa del cráneo para minimizar las lesiones mecánicas.
En segundo lugar, la identificación correcta y la correlación adecuada de la arteria sal media distal son fundamentales para este modelo. Primero, inyecte analgésicos 30 minutos antes de comenzar la operación. Encienda la manta térmica para el ratón y ajústela a 37 grados Celsius para la operación.
A continuación, asegúrese de que el gas anestésico compuesto por 70% nitrógeno, 30% oxígeno e isoflurano esté listo. Luego, exponga al ratón a 4% de isoflurano en una cámara de inducción hasta que deje de moverse. A continuación, coloque al ratón sobre la almohadilla térmica y administre isoflurano al 4% durante un minuto más.
Después del minuto, cambie la tasa de isoflurano al 1,5 %. Ahora, asegúrese de que el ratón esté suficientemente anestesiado mediante una compresión del dedo del pie, y en caso afirmativo, aplique dafan etanol en los ojos utilizando tijeras. Comience la cirugía con una incisión de un centímetro entre la oreja y el ojo. Separe la piel e identifique el músculo temporal.
Ahora, en el generador de alta frecuencia, configure la función en coagulación, el modo en bipolar, la potencia en 12 vatios y conecte la pinza. En la preparación, agregue una gota de suero fisiológico al músculo temporal expuesto. Luego, utilice la pinza de electrocoagulación para separar el músculo temporal del cráneo en sus partes apical y distal.
El resultado es un colgajo muscular aflojado. Ahora identifique la arteria cerebral media o MCA debajo del cráneo transparente. Se encuentra en la parte rostral de la zona temporal, dorsal al seno retroorbital.
Utilice un taladro para adelgazar el hueso directamente por encima de esta arteria hasta que quede delgado. Mantenga el cráneo húmedo durante el taladrado utilizando solución salina. Ahora, con pinzas muy finas, retire cuidadosamente el hueso para exponer la rama de la arteria cerebral media (MCA).
Cambie el generador de alta frecuencia a siete vatios. Ahora coagule la arteria con la pinza de electrocoagulación tocándola suavemente sin agarrarla. Coagule la arteria tanto proximal como distalmente a la bifurcación; en caso de una variación anatómica sin bifurcación de la ACM, coagule la arteria lo más proximal posible en dos sitios, aproximadamente un milímetro separados, después de la coagulación.
Espere 30 segundos y luego toque suavemente la arteria con pinzas romas. A continuación, vuelva a colocar el músculo en su posición, cubriendo el orificio de trepanación. Suture la herida y coloque el animal en una caja de recuperación a 32 grados Celsius para que se recupere de la anestesia, y luego devuélvalo a la jaula.
En general, el animal tarda de cinco a 10 minutos en recuperarse de la anestesia. La prueba del cilindro evalúa la preferencia de una extremidad sobre la otra. Coloque al animal en un cilindro de vidrio acrílico transparente, flanqueado por dos espejos colocados en ángulo recto.
Grabe al animal durante cinco minutos frente al vértice de los dos espejos, en el lado opuesto del cilindro. Después de cada ensayo, limpie el cilindro y la superficie de la mesa con etanol al 60%. Posteriormente, realice un análisis cuadro por cuadro.
Puntúe el ensayo contando el contacto de una de las cuatro patas con el cilindro mientras el animal está completamente erguido, y también contando los aterrizajes con una de las cuatro extremidades. Después de una puntuación por erguirse completamente, al menos 20 contactos de una de las cuatro extremidades por ensayo sección criogénica, cada cerebro seriado en secciones de 20 micrómetros de grosor tomadas a intervalos de 400 micrómetros. Recoja las secciones sobre portaobjetos para almacenarlas a menos 20 grados Celsius.
Utilizando este protocolo de corte, todas las secciones que cubren el área de infarto de un cerebro pueden colocarse en un solo portaobjetos. Tiña las secciones utilizando un protocolo estándar de violeta cresta para delimitar el área del tejido infartado en cada sección cerebral. Luego, las muestras pueden montarse, escanearse y analizarse mediante el método de Swanson para evaluar el edema.
La mortalidad corregida debida a la cirugía de oclusión de la ACM fue inferior al 5 %, principalmente por hemorragia subaracnoidea o anestesia incorrecta. Ningún animal falleció durante el período. Para este análisis con fines de PA, se midió la asimetría mediante la prueba del cilindro tras la inducción del accidente cerebrovascular y se comparó con los valores basales obtenidos antes de la oclusión de la ACM; se detectó una asimetría significativa de las extremidades a las 24 horas, que se recuperó parcialmente durante la primera semana tras el accidente cerebrovascular, una semana después del evento.
El infarto inducido con tinción de violeta cresta mostró un volumen medio de infarto de 15,4 milímetros cúbicos, lo que representa aproximadamente el 12 % de un hemisferio cerebral. La desviación estándar de este modelo es muy baja. Además, la ubicación del infarto presentó una variabilidad mínima.
Una vez realizada, esta operación puede finalizarse en menos de 10 minutos si se realiza correctamente. Además de las pruebas de cilindro demostradas y la tinción con violeta de cristal, se pueden utilizar otras pruebas de comportamiento e histológicas establecidas para caracterizar más a fondo el resultado y abordar preguntas específicas de investigación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una oclusión permanente de la arteria cerebral media distal en ratones.
Recomendamos encarecidamente utilizar procedimientos operativos estándar y documentación detallada para mantener la reproducibilidad del método.
Descripción general
Este artículo presenta un método para realizar una oclusión permanente de la arteria cerebral media distal (MCAO) en ratones, que provoca una infartación cortical consistente similar a los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos. La técnica es valiosa tanto para la investigación básica como traslacional del accidente cerebrovascular debido a su reproductibilidad y su tasa de mortalidad mínima.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre accidente cerebrovascular
- Modelos animales
Antecedentes
- La oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) es un modelo común para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico.
- Este modelo permite examinar la infartación cortical en un entorno controlado.
- Comprender los mecanismos del accidente cerebrovascular en ratones puede proporcionar conocimientos aplicables a las condiciones humanas.
- La reproducibilidad y las bajas tasas de mortalidad aumentan la utilidad del modelo en la investigación.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para inducir oclusión permanente de la arteria cerebral media en ratones.
- Evaluar el tamaño del infarto cortical resultante y su relevancia respecto a los accidentes cerebrovasculares humanos.
- Valorar los resultados conductuales tras la cirugía mediante pruebas de asimetría en el uso de las extremidades.
Métodos Utilizados
- Puntuación de la asimetría basal en el uso de las extremidades antes de la cirugía.
- Electrocoagulación de la arteria cerebral media distal para inducir un accidente cerebrovascular.
- Evaluación postoperatoria de déficits sensoriomotores mediante la prueba del cilindro.
- Análisis del volumen del infarto mediante tinción con violeta cresta de secciones cerebrales.
Resultados principales
- El volumen medio del infarto medido fue de 15,4 milímetros cúbicos, lo que representa aproximadamente el 12 % de un hemisferio cerebral.
- Se detectó una asimetría significativa en las extremidades a las 24 horas posteriores a la cirugía, con una recuperación parcial observada durante la semana siguiente.
- El modelo mostró una baja variabilidad en la ubicación y el tamaño del infarto.
- La mortalidad debida al procedimiento fue inferior al 5 %, principalmente por hemorragia subaracnoidea o errores en la anestesia.
Conclusiones
- El método MCAO descrito es eficaz para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico en ratones.
- Proporciona un modelo reproducible con una mortalidad mínima y resultados consistentes.
- Los ensayos conductuales y los análisis histológicos pueden caracterizar aún más los efectos del accidente cerebrovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo permite la infusión cortical reproducible en ratones con baja mortalidad, lo que favorece la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas para el accidente cerebrovascular. El tamaño y la localización del infarto coinciden con la patología del ictus humano, mejorando la relevancia traslacional para la evaluación terapéutica preclínica. Las lecturas conductuales e histológicas proporcionan puntos finales cuantitativos para decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas en vías de accidente cerebrovascular cortical con alta relevancia anatómica para la enfermedad humana.
- Valor operativo: La baja variabilidad en el volumen e ubicación del infarto aumenta la confianza en las evaluaciones de interacción con el objetivo y modulación de la vía.
- Valor predictivo: Facilita la triage preclínica mediante la modelización de mecanismos fisiopatológicos tardíos como la inflamación, la angiogénesis y la plasticidad neuronal.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce lesiones corticales estandarizadas adecuadas para cribado consistente de compuestos y evaluación de respuesta a la dosis.
- Resultados cuantitativos: La medición del volumen del infarto mediante tinción con violeta cresilo permite un análisis objetivo y histomorfológico de los efectos del tratamiento.
- Escalabilidad: El procedimiento quirúrgico finaliza en menos de 10 minutos con una mortalidad mínima, lo que favorece un mayor rendimiento en los flujos de trabajo de descubrimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: La predominancia del infarto cortical refleja la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos, lo que mejora la confianza predictiva para la traducción clínica.
- Continuidad mecanicista: Facilita el estudio de las vías del accidente cerebrovascular subagudo y crónico, incluyendo la regeneración y la plasticidad, durante ventanas de observación prolongadas.
- Avance ajustado al riesgo: La baja mortalidad y la alta reproducibilidad reducen la variabilidad biológica, permitiendo evaluaciones preclínicas más confiables de eficacia y seguridad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo se integra en el continuo de descubrimiento del accidente cerebrovascular, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación de la eficacia preclínica, especialmente para terapias que se dirigen a lesiones corticales y mecanismos de reparación.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis de compuestos neuroprotectores y neurorestauradores en un modelo de infarto clínicamente relevante.
- Tamizaje: Permite la generación estandarizada de infartos para una evaluación consistente de los efectos del compuesto sobre la progresión de la lesión.
- Análisis: La tinción con violeta cresilo y la prueba del cilindro proporcionan lecturas complementarias histológicas y funcionales para análisis de respuesta a la dosis y curso temporal.
- Investigación Traducional: Modela procesos fisiopatológicos retardados relevantes para ventanas de intervención en fases subagudas y crónicas del accidente cerebrovascular.
- Reutilización Empresarial: Los procedimientos quirúrgicos y analíticos estandarizados permiten la reproducibilidad entre proyectos y el intercambio de plataformas entre equipos de neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: La alta fidelidad anatómica y fisiopatológica al accidente cerebrovascular humano aumenta la confianza en la validación de dianas terapéuticas.
- Valor operativo: La mortalidad mínima y la baja variabilidad del infarto mejoran la reproducibilidad del ensayo y reducen el número de animales necesarios por experimento.
- Valor estratégico: Permite la identificación temprana de compuestos biológicamente activos, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas de los programas contra el accidente cerebrovascular.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización basada en datos de dianas terapéuticas según la modulación constante del tamaño del infarto y la recuperación funcional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía y en la identificación vascular intracraneal.
- Depende del equipo de electrocoagulación y de ajustes precisos de potencia para la oclusión arterial.
- Necesita protocolos estandarizados de anestesia y cuidados posoperatorios para minimizar la variabilidad.
- La adaptación a modelos transgénicos requiere la validación de la viabilidad quirúrgica y la consistencia del infarto.
- El análisis histológico exige protocolos estandarizados de corte y tinción para una cuantificación fiable del infarto.
