Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

El objetivo general de este procedimiento es realizar el ensayo de formación de foco en líneas celulares de fibroblastos de ratón, utilizando un retrovirus para determinar el potencial oncogénico de un gen. Esto se logra clonando primero la secuencia del gen de interés en un vector retroviral. El segundo paso es producir partículas retrovirales utilizando el vector viral y las células de empaquetamiento de PLA e.

A continuación, el retrovirus se utiliza para infectar tres células fibroblastos de ratón T tres NIH con el fin de evaluar el potencial transformador del gen de interés. El paso final es permitir que las tres células T tres de los NIH se dividan durante dos o tres semanas, seguidas de una tinción de violeta cristalino para cuantificar el número de focos formados. En última instancia, el ensayo de formación de foco se utiliza para mostrar si la sobreexpresión de un gen de interés es suficiente para inducir un crecimiento independiente de la densidad en las células de fibroblastos de ratón.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como la detección del potencial oncogénico de un gen. Para comenzar, haga el vector viral como se describe en el protocolo de texto. A continuación, establezca cultivos de plat E a partir de células congeladas descongelando rápidamente las células plat E en un baño de agua a 37 grados Celsius y luego transfiriéndolo a un tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue lentamente nueve mililitros de medio PLA E al tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 180 veces G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células con 10 mililitros de medio plat E y transfiéralas a una placa de cultivo de 10 centímetros.

A continuación, incubar las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 grados centígrados hasta que estén entre 80 y 90% confluentes. Realice la división de las células aspirando primero el medio, luego lave las células una vez con PBS antes de agregar dos mililitros de 0.05% tripin EDTA e incubar durante un minuto a temperatura ambiente, separar las células golpeando con el dedo. Luego agregue 10 mililitros de medio plat E y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo como antes y volver a suspender las células con 10 mililitros de medio plat E. A continuación, 2 millones de células por placa de cultivo de 10 centímetros utilizando medio plat E sin antibióticos y deje que las células incuben durante la noche. Al día siguiente, transfiera 300 microlitros de optimum a un microtubo de 1,5 mililitros.

Agregue 27 microlitros de amina de polietileno al tubo preparado con Optum. Mezclar suavemente con los dedos e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue nueve microgramos de ADN plasmídico de grado de transfección en el tubo mezclado suavemente por vórtice e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, añada la mezcla gota a gota en la placa E antes de incubar durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio que contiene el reactivo de transfección y agregue 10 mililitros de medio P E fresco antes de devolver las células a la incubadora para establecer cultivos NIH tres T tres. Primero, descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 grados centígrados y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros.

Agregue lentamente nueve mililitros de medio NIH 3, T 3 a las células, centrifugue el tubo a 180 veces G durante cinco minutos y deseche el snat. A continuación, vuelva a suspender las células con 10 mililitros de medio NIH 3, T 3 y transfiéralas a una placa de cultivo de 10 centímetros. Incubar las células en una incubadora de CO2 al 5% de 37 grados centígrados, manteniéndolas bajo confluente a medida que aumenta la frecuencia de la transformación espontánea.

Una vez que un cultivo alcanza la cofluidez, una vez cultivado se siembra tres veces 10 hasta el quinto nih, tres células T tres por placa de 10 centímetros y se incuba durante la noche para la infección al día siguiente. Al día siguiente, recoja el sobrenadante retroviral de la placa E utilizando una jeringa desechable de 10 mililitros, filtrándolo a través de un filtro de membrana de nailon de 0,45 micras de tamaño de poro y transfiriéndolo a un tubo de 15 mililitros. Agregue 10 mililitros de medio plat E fresco a las celdas antes de devolverlas a la incubadora.

A continuación, aspire el medio de la placa de tres células T de los NIH que se van a infectar y añada cinco mililitros de NI H tres regulares, medio T tres y cinco mililitros de sobrenadante filtrado que contenga virus. A continuación, agregue cerebro de polietileno al plato. Añade una concentración de seis microgramos por mililitro.

Incubar las células durante la noche antes de repetir los pasos de infección para una segunda ronda de infección. Después de la infección, reemplace el virus, contenga medio con IH regular tres T tres medio. Permita que las células IH tres T tres crezcan de dos a tres, reemplazando el medio según sea necesario para la tinción de violeta cristalino.

Aspire el NIH tres T tres medio y coloque los platos sobre hielo. Lave los platos dos veces con PBS helado. Fije las celdas con metanol helado durante 10 minutos.

A continuación, retire los platos del hielo y aspire el metanol. Añadir tres mililitros de solución de violeta cristalina al 0,5% hecha en metanol al 25% e incubar los platos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, aspire la solución de violeta cristalina y enjuague cuidadosamente el plato con agua Milli Q hasta que no se desprenda color en el enjuague.

Deje que los platos se sequen sin tapar durante la noche en una mesa de trabajo. Una vez que los platos estén secos, use una regla para medir los focos y cuente aquellos que tengan más de cinco milímetros de diámetro para registrar. El número MXD tres es un factor de transcripción básico de la leucina de hélice en bucle que es un miembro atípico de la familia MAD, y se ha informado que está involucrado en la carcinogénesis en comparación con el control negativo y el control positivo.

Las placas NIH tres T tres donde se sobreexpresó MXD tres tuvieron significativamente menos focos. Los datos se recopilaron de múltiples experimentos para determinar la significación y se observaron las mismas tendencias a partir de este ensayo. Los resultados sugieren que MXD three no funciona como un oncogén siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de formación de focos con combinaciones de genes, el crecimiento en la proliferación de barrenas blandas y el análisis del ciclo celular, con el fin de responder a preguntas adicionales para evaluar el papel de un gen de interés en la patogénesis de la oncogénesis.