Name: Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende el ensayo de formación de focos para evaluar el potencial oncogénico de genes usando células NIH 3T3 de ratón. Este método permite cuantificar la transformación celular mediante tinción con violeta de cristal.

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Este trabajo fue apoyado por una beca del Programa de Premios Nueva Innovador del director del NIH (ED). AA fue financiada en parte por los premios de licenciatura del Instituto Nacional del Cáncer y la Fundación Nacional de Ciencia.

1. Hacer los vectores virales Las secuencias de codificación para el gen de interés, así como los controles positivos y negativos, se insertan en pBabePuro por los métodos tradicionales de clonación (amplificación por PCR, digestión de restricción y ligadura). Hay cuatro sitios de restricción en el vector donde se puede insertar el ADN: BamHI, SnaBI, EcoRI y SalI. <ol><li> Preparar transfección grado plásmido de ADN a partir de células competentes utilizando el kit de plásmido QIAGEN midi. </li><li> Medir la concentración de ADN usando un espectrofotómetro NanoDrop2000. </li></ol> 2. Retrovirus Producción La línea celular de empaquetamiento Plat-E se puede utilizar para producir retrovirus ecotrópico que entregará el ADNc de interés a las células NIH 3T3. <ol><li> Establecer Plat-E culturas de células congeladas <ol><li> Descongelar rápidamente las células Plat-E en un baño de agua ° C 37 y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Poco a poco agregue 9 ml de medio Plat-E (DuMedio Eagle Modificado de lbecco (DMEM) + 10% de suero bovino fetal (FBS) + penicilina y estreptomicina). </li><li> Centrifugar el tubo a 180 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender las células con 10 ml de medio Plat-E y la transferencia a una placa de cultivo de 10 cm. </li><li> Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora hasta que son 80-90% de confluencia (aproximadamente 2 días). </li></ol></li><li> La división celular <ol><li> Aspirar el medio y lavar las células una vez con PBS. </li><li> Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina-EDTA y se incuba durante 1 min a TA. </li><li> Separe las células por el dedo de tapping, añadir 10 ml de medio Plat-E, y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar el tubo a 180 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de medio Plat-E y sembrar en nuevos platos en 1: 4-1: 6 diluciones. </li></ol></li><li> Plat-E Siembra y transfección <ol><li> Semilla 2 x 10 6células por placa de 10 cm de cultivo utilizando medio Plat-E sin antibióticos. </li><li> Se incuban las células O / N en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Al día siguiente, la transferencia de 300 l de Opti-MEM en 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 27 l de polietilenimina (PEI), un reactivo de transfección rentable 12, al tubo preparado con Opti-MEM. Mezclar suavemente por el dedo tocando e incubar durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 9 g de ADN plásmido de grado de transfección en el tubo de Opti-MEM / PEI, mezclar suavemente mediante agitación con vórtex, y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Añadir el ADN / PEI complejo gota a gota en el plato Plat-E, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Al día siguiente, aspirar el medio que contiene el reactivo de transfección y agregar 10 ml de medio Plat-E fresco (sin antibióticos). </li><li> Devolver las células a la incubadora. </li></ol></li></ol> 3. Las células NIH 3T3 y la infección <ol><li> El establecimiento de los NIHCulturas 3T3 y Siembra <ol><li> Descongelar rápidamente las células NIH 3T3 en un baño de agua ° C 37 y transferir a un tubo de 15 ml. Poco a poco agregue 9 ml de medio NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS). </li><li> Centrifugar el tubo a 180 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de medio y la transferencia de NIH 3T3 a una placa de cultivo de 10 cm. </li><li> Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Es muy importante que las células NIH 3T3 se mantienen siempre underconfluent (50-60%), como la frecuencia de transformación espontánea (y, por tanto, los niveles basales de la formación de focos) aumenta una vez al cultivo alcanza la confluencia. </li><li> Seed 3 x 10 5 células por placa de 10 cm y se incuban O / N para la infección el día siguiente. </li></ol></li><li> Infección <ol><li> Se recoge el sobrenadante retroviral de la placa de Plat-E mediante el uso de una jeringa desechable de 10 ml, filtrándola a través de un filtro de membrana de nylon de 0,45 micras de tamaño de poro, y transferir en un 15 mltubo. </li><li> Añadir 10 ml de medio Plat-E fresco a las células (sin antibióticos), y devolverlos a la incubadora. </li><li> Aspirar el medio de la placa de células NIH 3T3 de estar infectados, y añadir 5 ml de medio regular de NIH 3T3 y 5 ml de sobrenadante filtrado que contiene el virus. </li><li> Añadir al plato polibreno a una concentración de 6 mg / ml. </li><li> Se incuban las células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Al día siguiente, repita los pasos 3.2.1 - 3.2.5 para una segunda ronda de la infección. </li><li> Sustituya el medio que contiene el virus con medio normal NIH 3T3. </li><li> Permitir que las células NIH 3T3 crecer durante 2-3 semanas, reemplazando el medio según sea necesario. Compruebe expresión de la proteína de interés por electroforesis de proteínas convencional y inmunoblot sobre lisados ​​de células enteras de placas de réplica. </li></ol></li></ol> 4. La tinción y cuantificación <ol><li> Tinción con cristal violeta <ol><li> Aspirar el medio NIH 3T3 y coloque los platosen hielo. </li><li> Lavar los platos dos veces con helado de PBS. </li><li> Fijar las células con metanol enfriado con hielo durante 10 min. </li><li> Quitar los platos de hielo, aspirar el metanol, y añadir 3 ml de solución de cristal violeta al 0,5% hechos en 25% de metanol (RT). </li><li> Incubar los platos durante 5 min a RT. </li><li> Aspirar la solución de cristal violeta y enjuague cuidadosamente el plato con Milli-Q H 2 O hasta que no hay color sale en el enjuague. </li><li> Deje que los platos se sequen O / N en una mesa de trabajo (al descubierto). </li></ol></li><li> Focos Cuantificación <ol><li> Una vez que los platos están secos, use una regla para medir las colecciones de color oscuro de las células en el plato. Sólo contar los que son mayores que 5 mm de diámetro como &quot;focos&quot;. Registrar el número de focos y calcular los promedios y la importancia en comparación con los controles. </li></ol></li></ol>

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<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La FFA proporciona un método rápido y fácil de evaluar la transformación maligna in vitro. Es susceptible a la detección de un número relativamente grande de genes candidatos, y sus requisitos técnicos modestos que sea rentable. Además, dos o más genes pueden ser coexpressed (a veces conocido como un ensayo de la &quot;cooperación&quot;) para evaluar el potencial tumorigénico de la combinación. Las ventajas de este ensayo se basan en su técnica sencilla, su facilidad de cuantificación y su relativamente corto t...

Las células tumorales se pueden distinguir de sus homólogos normales por una amplia gama de alteraciones, a partir de patrones de expresión génica a epigenomics a cambios morfológicos y proliferativas. Entre estos últimos, la reducción de la dependencia de suero, la pérdida de contacto (densidad) la inhibición, la adquisición de la proliferación independiente de anclaje y, en última instancia, la capacidad de formar tumores cuando se inyectan en animales son útiles, indicadores medibles de la transformación maligna 3. Varios in vitro y en ensayos in vivo se han desarrollado para la transformación celular. Los ensayos in vitro como objetivo la identificación y medición de los cambios en la morfología de cultivo (ensayo de formación de foco), la dinámica de cultivo (tasa de crecimiento, densidad de saturación) y factor de crecimiento (crecimiento en el suero reducida) o fondeadero (crecimiento en agar blando) requisitos. El estándar de oro para la determinación de la naturaleza maligna de un tipo de célula sigue siendo la formación de tumores (xenoinjertos) en animales de experimentación. Sin embargo, tl costo y la duración de los estudios in vivo no siempre hacen justificable como un primer paso de validación o screening de oncogenes candidatos. Aunque no hay ensayo in vitro proporciona una evaluación definitiva de la potencial oncogénico de un gen, que no proporcionan información sobre potencial oncogénico que pueden reducir futuro en estudios in vivo. Uno de los sistemas más utilizados para evaluar el potencial oncogénico in vitro es la formación de ensayo Focus 2. Este enfoque se basa en el uso de NIH 3T3 de fibroblastos de ratón, una línea de células no transformadas que muestra la inhibición por contacto fuerte. La sobreexpresión de un oncogén resultados en pérdida de crecimiento dependiente de la densidad; a continuación, las células transformadas pueden crecer en múltiples capas, formando &quot;focos&quot;, fácil de visualizar contra la monocapa de fondo de células no transformadas. La formación de focos de ensayo, a continuación, mide la capacidad de un oncogén candidato para inducir la transformación maligna, como lo demuestra la pérdida de contacto inhibition como un fenotipo medible. El FFA ha sido utilizado para evaluar la transformación por la sobreexpresión de las proteínas quinasas (por ejemplo, Src 4, 5 BRAF), factores de transcripción (por ejemplo, N-myc 6) receptores, G acoplados a la proteína (por ejemplo, P2RY8 7) y GTPasas (por ejemplo, , Ras 1), entre otros. La relativa facilidad de este ensayo hace que sea una buena opción que proporcionará una respuesta rápida y visualmente claro si la sobreexpresión del gen es suficiente para transformar células de fibroblastos de ratón NIH 3T3 in vitro. El FFA se describe en este protocolo utiliza la línea celular de empaquetamiento Plat-E 8, que proporciona proteínas de empaquetamiento virales, y el vector retroviral pBabePuro 9 (Addgene plásmido 1764) para producir retrovirus. Después de la transfección con el constructo de pBabePuro que contiene el gen de interés, la línea celular Plat-E producirá retrovirus ecotrópico que se puede utilizar para infectar células NIH 3T3. Tsu método viral del suministro de genes es más eficiente que los métodos de transfección química tradicionales y ofrece una manera de expresar el gen sostenible 10. Una vez incorporado en el genoma de las células NIH 3T3, la sobreexpresión del gen de interés es impulsado por el promotor viral repeticiones terminales largas (LTR) 11. Esta expresión constante se puede utilizar para determinar si el gen de interés tiene actividad oncogénica, medida por la formación de focos, en las células NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>Vector pBABE-puro</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>vector de clonación</td></tr><tr><td>Línea celular de empaquetado retroviral Platinum-E, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>Línea celular RV-101</td><td>para producción viral</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Cell Line 93061524 murina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>para ensayo de formación de focos</td></tr><tr><td>10 ml Jeringa de punta BD Luer-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>309604 reactivo de producción viral</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filtro de jeringa Puradisc Whatman</td><td></td><td>6750-2504</td><td>reactivo de producción viral</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>reactivo de transfección celular</td></tr><tr><td>Polybrene infection / reactivo de transfección</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>reactivo de transfección celular</td></tr><tr><td>Crystal</td><td>Violet Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>reactivo de tinción celular</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>BD Falcon Placas de cultivo de tejidos</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Suministros para cultivos celulares</td></tr><tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054 suministros de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Opti-MEM I medio de suero reducido Gibco</td><td></td><td>31985-062</td><td>medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>medios de cultivo celular</td></tr></tbody></table>

enfoque formación: un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

< clase p = 'jove_content'>La transformación maligna de las células se asocia típicamente con un aumento de la proliferación, pérdida de la inhibición del contacto, adquisición de potencial de crecimiento independiente del anclaje y la capacidad de formar tumores en animales de experimentación1. En las células NIH 3T3, se sabe que la vía de transducción de señales Ras desencadena muchos de estos eventos, lo que se conoce como transformación Ras. La introducción de un gen sobreexpresado en las células NIH 3T3 puede promover la transformación morfológica y la pérdida de la inhibición del contacto, lo que puede ayudar a determinar el potencial oncogénico de ese gen de interés. Un ensayo que proporciona un método sencillo para evaluar un aspecto del potencial transformador de un oncogén es el ensayo de formación de foco (FFA)2. Cuando las células NIH 3T3 se dividen normalmente en cultivo, lo hacen hasta que alcanzan una monocapa confluente. Sin embargo, en presencia de un oncogén sobreexpresado, estas células pueden comenzar a crecer en focosdensos y multicapa 1 que se pueden visualizar y cuantificar mediante tinción de cristal violeta o Hema 3. En este artículo describimos el protocolo FFA con transducción retroviral del gen de interés en células NIH 3T3, y cómo cuantificar el número de focos mediante tinción. La transducción retroviral ofrece un método más eficiente de administración de genes que la transfección, y el uso de un retrovirus murino ecotrópico proporciona un control de bioseguridad cuando se trabaja con posibles oncogenes humanos.

MXD3 es un factor de transcripción de la cremallera de leucina básica hélice-bucle-hélice (bHLHZ) que es un miembro de la MYC / MAX / MAD red. Es un miembro atípico de la familia MAD 13-15, y se ha informado a participar en la carcinogénesis 16,17. Cuando se compara con pBabePuro (control negativo) y MYC (control positivo), los platos NIH 3T3 donde se sobreexpresa MXD3 tuvieron significativamente menos focos (Figura 1A). Los datos en la Figura 1B se recogieron a pa...

El ensayo Focus Formación ofrece un método sencillo para evaluar el potencial de transformación de un oncogén candidato.

Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar el ensayo de formación de focos en líneas celulares de fibroblastos de ratón, utilizando un retrovirus para determinar el potencial oncogénico de un gen. Esto se logra primero clonando la secuencia del gen de interés en un vector retroviral. El segundo paso consiste en producir partículas retrovirales utilizando el vector viral y células empaquetadoras PLA e.A continuación, se utiliza el retrovirus para infectar células fibroblásticas murinas NIH three T three con el fin de evaluar el potencial transformante del gen de interés. El paso final consiste en permitir que las células NIH three T three se dividan durante dos o tres semanas, seguido de tinción con violeta de cristal para cuantificar el número de focos formados. En última instancia, el ensayo de formación de focos se emplea para determinar si la sobreexpresión de un gen de interés es suficiente para inducir un crecimiento independiente de la densidad en células fibroblásticas murinas.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como la detección del potencial oncogénico de un gen. Para comenzar, prepare el vector viral según se describe en el protocolo escrito. Luego, establezca cultivos de plat E a partir de células congeladas descongelando rápidamente las células plat E en un baño de agua a 37 grados Celsius y transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 mililitros.Agregue lentamente nueve mililitros de medio PLA E al tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue el tubo a 180 ×g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Re suspenda las células con 10 mililitros de medio plat E y transfiera a una placa de cultivo de 10 centímetros.A continuación, incubar las células en un incubador con 5% CO₂ a 37 grados Celsius hasta que alcancen una confluencia entre el 80 y el 90%. Realizar el repique de las células aspirando primero el medio, luego lavar las células una vez con PBS antes de añadir dos mililitros de tripsina 0.05% EDTA e incubar durante un minuto a temperatura ambiente; desprender las células golpeando ligeramente con los dedos. A continuación, añadir 10 mililitros de medio plat E y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.Centrifugar el tubo como antes y resuspender las células con 10 mililitros de medio plat E. A continuación, sembrar 2 millones de células por placa de cultivo de 10 centímetros utilizando medio plat E sin antibióticos y dejar que las células incuben durante la noche. Al día siguiente, transferir 300 microlitros de óptimum a un tubo microfuga de 1,5 mililitros.Añada 27 microlitros de amina de polietileno al tubo preparado con Optum. Mezcle suavemente golpeando con el dedo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada nueve microgramos de ADN plasmídico de grado transfección al tubo, mezcle suavemente mediante vortex y luego incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.Luego, agregue la mezcla gota a gota en la placa de cultivo antes de incubar durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio que contiene el reactivo de transfección y agregue 10 mililitros de medio fresco para placa E antes de devolver las células al incubador para establecer cultivos de NIH 3T3. Primero, descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 grados Celsius y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros.Añada lentamente nueve mililitros de medio NIH tres, T tres a las células, centrifugue el tubo a 180 ×g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, resuspenda las células con 10 mililitros de medio NIH tres, T tres y transfiera a una placa de cultivo de 10 centímetros. Incube las células en un incubador a 37 °C con 5 % CO₂, manteniéndolas subconfluente, ya que la frecuencia de transformación espontánea aumenta. Una vez que un cultivo alcance confluencia, cuando crezcan semillas tres veces 10 a la quinta nih, tres T tres células por placa de 10 centímetros e incubar durante la noche para la infección al día siguiente. Al día siguiente, recolecte el sobrenadante retroviral de la placa E utilizando una jeringa desechable de 10 mililitros, filtrándolo a través de un filtro de membrana de nailon con un tamaño de poro de 0,45 micrones y transfiriéndolo a un tubo de 15 mililitros. Añada 10 mililitros de medio fresco para placa E a las células antes de devolverlas al incubador.Luego aspire el medio del plato de células NIH 3T3 que se infectará y agregue cinco mililitros de medio regular NI H tres T tres y cinco mililitros de sobrenadante filtrado que contenga virus. A continuación, agregue polibrena al plato. Añada una concentración de seis microgramos por mililitro.Incube las células durante la noche antes de repetir los pasos de infección para una segunda ronda de infección. Tras la infección, sustituya el medio que contiene el virus por medio IH tres T tres normal. Deje crecer las células IH tres T tres durante dos o tres días, reemplazando el medio según sea necesario para la tinción con violeta de cristal.Aspire el medio NIH tres T tres y coloque las placas en hielo. Lave las placas dos veces con PBS frío con hielo. Fije las células con metanol frío con hielo durante 10 minutos.Luego, retire los recipientes del hielo y aspire el metanol. Añada tres mililitros de solución de violeta de cristal al 0,5% preparada en metanol al 25% e incube los recipientes durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, aspire la solución de violeta de cristal y enjuague cuidadosamente el recipiente con agua Milli Q hasta que no se desprenda color en el enjuague.Deje secar los platos descubiertos durante la noche sobre la superficie de la mesa. Una vez que los platos estén secos, utilice una regla para medir los focos y cuente aquellos que tengan un diámetro mayor a cinco milímetros. El número MXD tres es un factor de transcripción atípico de la familia MAD con estructura básica de hélice-bucle-hélice y cierre de leucina, y se ha informado que participa en la carcinogénesis en comparación con el control negativo y el control positivo.Las placas de tres T tres del NIH donde se sobreexpresó MXD tres presentaron significativamente menos focos. Los datos se recopilaron a partir de múltiples experimentos para determinar la significancia, y se observaron las mismas tendencias en este ensayo. Los resultados sugieren que MXD tres no funciona como un oncogén tras seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de formación de focos con combinaciones de genes, la proliferación en agar blando y el análisis del ciclo celular, con el fin de responder preguntas adicionales para evaluar el papel de un gen de interés en la patogénesis de la oncogénesis.

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