Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la respuesta celular y los mecanismos moleculares implicados en la neurogénesis adulta y la regeneración y reparación del sistema nervioso central. En el pez cebra, esto se logra primero generando manualmente una lesión mediante la perforación del hemisferio cefálico derecho de un pez cebra adulto. A continuación, cinco días después de la lesión, el pez se sacrifica y su cerebro se disecciona y se incrusta en aros para seccionarlo en un ome.

A continuación, las secciones del cerebro se tiñen mediante inmunohistoquímica o en C dos hibridación con marcadores apropiados. Con el fin de observar la proliferación celular, se obtienen resultados de glio, agenesia y neurogénesis que muestran una regulación positiva del marcador de proliferación, PCNA, el marcador radioglial S 100 beta y dos células precursoras de oligodendrocitos marcadas con EGFP en la zona ventricular tras la herida por arma blanca. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente en el enfoque transgénico para producir una ablación específica de tejido o tipo celular es su simplicidad, rapidez y eficiencia de causa, lo que permite la producción de muchos cerebros lesionados en poco tiempo.

Después de anestesiar a los peces cebra adultos, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque peces individuales en una ranura en un bloque de papel de seda empapado en trica bajo un microscopio de disección con luz desde arriba. Sostenga suavemente el pez con una mano y oriéntelo de manera que permita el acceso a la cabeza desde la parte superior con una jeringa equipada con una aguja de calibre 30. Por otro lado, empuje la aguja verticalmente a través del cráneo, no más de dos milímetros más profundo en la región medial de un hemisferio cefálico.

Después de introducir la lesión cefálica, coloque el pez en agua fresca. Cuando haya terminado, transfiera el pez de regreso al sistema de flujo de agua. Después de permitir que los peces se recuperen durante el período de tiempo deseado y sacrificarlos de acuerdo con el protocolo de texto, sacrifíquelos en hielo y use una tijera afilada para cortar detrás de las branquias para separar la cabeza del cuerpo.

Incubar las cabezas en un XPBS durante cinco minutos para permitir el sangrado. A continuación, transfiera las cabezas a un 4% de formaldehído en PBS e incube durante la noche a cuatro grados centígrados o durante cuatro horas a temperatura ambiente después de la fijación. Use un XPBS en una placa de Petri para lavar las cabezas dos veces.

Luego, bajo un microscopio de disección, diseccione cuidadosamente los cerebros en PBS. Deseche cualquier cerebro sin una lesión visible. Transfiera los cerebros a dos tubos de reacción de mililitros llenos de 1,5 mililitros de metanol al 100% e invierta los tubos cinco veces antes de incubarlos a menos 20 grados centígrados durante al menos 16 horas.

Para rehidratar el tejido para la inmunohistoquímica, incube los cerebros durante cinco minutos cada uno en una serie descendente de metanol antes de usar PBS tween 20 o PTW para lavar los cerebros cinco veces. Durante cinco minutos cada uno. Junto a incrustar los cerebros, use una pipeta de transferencia para colocarlos en las cavidades de una bandeja de tazas de moldeo de polietileno y disuelva 2%agros en un XPBS calentándolo en un microondas a 600 vatios.

Deje que los agros se enfríen durante tres minutos antes de usar. Luego, retire con cuidado el PTW de un cerebro antes de usar aros para llenar completamente el molde. Use la aguja de disección para hacer girar el cerebro en el aros para lavar el PTW y oriente el cerebro con el lado ventral hacia abajo, el lado dorsal hacia arriba y colóquelo recto antes de dejar que el agros se enfríe.

Con una aguja de disección, retire el bloque de agros del molde. Luego, con la cuchilla de afeitar afilada, corte el agros paralelo al céfalo de la garra en el extremo posterior del cerebro. Ahora corte el agros en el extremo anterior del cerebro antes de voltear el bloque para que quede en el plano posterior.

Retire el exceso de agros haciendo cortes paralelos a los lados dorsal y ventral del cerebro. A continuación, voltee el cerebro hacia atrás para que quede sobre su lado ventral. Finalmente, corta el bloque en un triángulo truncado en el que el céfalo se encuentra en el plano más pequeño.

Después de preparar el viome de acuerdo con las instrucciones del fabricante, use un XPBS para llenar el baño amortiguador de modo que llegue justo al fondo de la cuchilla. A continuación, coloque un pequeño punto de superpegamento en la parte superior del disco de muestra del vibrador. A continuación, coloque con cuidado el plano del bloque que se encuentra posterior al cerebro sobre el superpegamento.

Utilice el manipulador de micrótomo para insertar el disco de muestras en la bandeja de almacenamiento intermedio y gire el disco de muestras a la posición deseada. A continuación, utilice una llave Allen de tres milímetros para apretar el tornillo y retirar el manipulador. Coloque el bloque en el baño amortiguador de modo que el céfalo quede justo debajo de la superficie con el lado dorsal del cerebro mirando hacia la cuchilla para seccionar los cerebros.

Prepare una placa de 24 pocillos para recoger las secciones agregando un mililitro de tampón de bloqueo por cerebro en los pocillos de la placa con el micrótomo vibratorio. Comience a seccionar con un grosor de 50 micrómetros, una velocidad de un milímetro por segundo y una frecuencia de 70 hercios. Con un cepillo sintético, recoja las rodajas finas de aros a medida que se desprenden de la hoja y recójalas en la placa de 24 pocillos.

Para realizar inmunohistoquímica bloquee sitios inespecíficos durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón y agregue 250 microlitros de anticuerpo diluido en tampón de bloqueo para incubar durante la noche a cuatro grados centígrados o durante dos horas a temperatura ambiente antes de usar PTW para lavar las muestras tres veces durante un minuto cada una. Después de la incubación y los anticuerpos secundarios durante dos horas a temperatura ambiente.

Lava las secciones tres veces. Utilice un medio de montaje no fluorescente soluble en agua para montar las secciones. A continuación, analice las muestras bajo un microscopio compuesto o confocal.

Cuando se realiza correctamente, una herida conduce a un canal de lesiones que se extiende desde la dorsal hasta la ventral a través del palam del céfalo de cuento que se curará después de 35 días. Anteriormente se demostró mediante inmunohistoquímica. Esa herida desencadena una regulación positiva de PCNA, un S 100 beta y un patrón de superposición de tres a siete días después de la lesión, lo que indica proliferación de células gliales radiales.

Esta figura muestra una acumulación transitoria de células precursoras de oligodendrocitos u OPC en las proximidades de una herida por arma blanca inducida en peces FP EEG olig dos transgénicos que ya no se observa el día 35 después de la lesión. Si la lesión no se introduce correctamente, el canal de la lesión no será visible. Una regulación positiva de PCNA y S 100 beta o acumulación de OPC es indetectable.

Como se presenta aquí, una prueba de expresión sistémica que compara los reguladores de transcripción en los cerebros de peces con lesiones frente a cerebros de tipo salvaje ha identificado una serie de factores que se expresan en el telecéfalo y que se regulan al alza en respuesta a una lesión. El método de herida escalonada combinado, por ejemplo, con la secuenciación profunda de ARN o la hibridación in situ, puede ayudar a identificar nuevos genes implicados en la neurogénesis, regeneración y reparación del pez cebra adulto.