Name: Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a inducir lesiones mecánicas en el telencéfalo de pez cebra adulto para estudiar neurogénesis y regeneración cerebral. Este protocolo utiliza inmunohistoquímica para analizar marcadores de proliferación celular.

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Agradecemos a N. Borel y a su equipo de pescadería, a M. Rastegar por su ayuda con la microscopía y a T. Dickmeis por sus comentarios sobre el manuscrito. Estamos agradecidos por el apoyo de la IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, la Red Interreg para la Biología Sintética en el Valle del Alto Rin (NSB-Alto Rin) y la red financiada por BMBF EraSysBio.

El pez cebra se mantuvieron en las instalaciones de peces del Instituto de Toxicología y Genética (ITG) en Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas de protección de animales de Alemania y fueron aprobados por el Gobierno de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemania (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;). 1. Generación de una herida de arma blanca en el telencéfalo <ol><li> Anestesia <ol><li> Para preparar una solución madre de tricaína (éster etílico del ácido 3-amino benzoico, también llamado acetato de 3-aminobenzoato) utilizan 400 mg de polvo de tricaína y se disuelven en 97,9 ml de agua y 2,1 ml de tampón de 1 M de Tris / HCl (pH 9). Ajustar el pH a 7. Hacer alícuotas de 5 ml y almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Transferir un número apropiado de 0,5-1 años de edad del pez cebra de sus tanques en jaulas de plástico de ratón. Nota: El cráneo de un pez cebra adulto en unos 12meses de edad es todavía relativamente suave y se puede perforar fácilmente con una aguja (véase la sección 1.2.3 y en la figura 1A). </li><li> Para anestesiar el pez cebra adulto, mezcle 5 tricaína ml (solución madre) en una jaula cruce de plástico con ~ 100 ml de agua pecera limpia (concentración final de tricaína 0,02% (w / v) tricaína). </li><li> Incubar los peces en los anestésicos hasta que no se mueven más (45-60 seg). </li></ol></li><li> Lesión Telencéfalo <ol><li> Lugar individuo anestesiado pez cebra en una ranura en un bloque de espuma tricaína empapada. </li><li> Bajo un microscopio de disección con luz desde la parte superior coloque un lado del pescado con una mano y orientarlo de manera que permita el acceso a la cabeza de la parte superior. </li><li> Con la otra mano empujar un G jeringa 30 (jeringa de insulina con aguja integrada) verticalmente a través del cráneo en la región medial de un hemisferio telencefálica (figuras 1A-1B). Los hemisferios del telencéfalo unvolver visible a través del cráneo. Asegúrese de que la lesión introducida no es más profunda de 2 mm (Figura 1C). Nota: Se recomienda introducir la lesión siempre en el mismo hemisferio para facilitar la identificación del sitio de la lesión, cuando la disección del cerebro fuera del cráneo. </li><li> Después de la introducción de la lesión telencephalic, coloque el pescado en agua el pescado fresco. Mantener hasta 10 peces en una jaula de 2 L de ratón lleno de peces de agua para la recuperación y conecte la jaula del ratón a un sistema de flujo de agua. Nota: La tasa de supervivencia es generalmente ~ 97% si los peces están sanos y no hay otros experimentos se realizaron con el pescado antes. La adición de antibióticos para el agua de pescado no es necesario. Después de la recuperación, los peces se comportan normalmente: nadan, alimentación, y se aparean. </li></ol></li></ol> 2. Analizar el efecto de la lesión telencefálicas <ol><li> Cerebro La disección y fijación <ol><li> Re-anestesiar el pescado recuperado en diferentes puntos de tiempo después de la lesión (tipicaY, 1, 3, 5, y 14 días después de la lesión (DPL)) con 0,02% (w / v) tricaína como anteriormente y la eutanasia poniéndolos en agua con hielo durante 5 min. </li><li> Coloque el pescado en un pañuelo de papel humedecido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y separar la cabeza del cuerpo cortando detrás de las agallas con una tijera afilada. </li><li> Mantenga las cabezas en 1x PBS durante 5 minutos para permitir el sangrado. Nota: Esto drena la sangre del tejido, lo que puede perturbar nuevas medidas en el protocolo. </li><li> Fijar las cabezas durante la noche a 4 ° C en 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS o 4 horas a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lávese las cabezas fijas dos veces con 1x PBS en una placa de Petri. </li><li> Diseccionar cerebros cuidadosamente en 1x PBS bajo un microscopio de disección 23. La lesión es generalmente visible bajo el microscopio de disección. Cerebros sin lesión visible deberán desecharse. </li><li> Transferencia de cerebros en 2 tubos de reacción ml llena con 1,5 ml de 100% de metanol (MeOH) y invertir los tubos de 5x antes de incubarellos a -20 ° C durante al menos 16 horas. Nota: Los cerebros se pueden mantener durante varios meses en MeOH a -20 ° C hasta que se necesite para inmunohistoquímica o hibridación in situ. </li></ol></li><li> Preparación de tejidos para inmunohistoquímica <ol><li> Rehidratar el cerebro a través de una serie metanol descendente en 2 tubos de plástico ml (secuencialmente 75% de MeOH (1x PBS, 0,1% de Tween-20 = PTW);. 50% de MeOH, 25% de MeOH Incubar los cerebros (15 cerebros tubos de 2 ml / reacción ) durante 5 min en cada solución. </li><li> Lavar los cerebros en PTW durante 5 min. Repetir 4x con frescos PTW. </li></ol></li><li> Incorporación de los cerebros de seccionamiento <ol><li> Para el encapsulado de, transferir los cerebros del tubo de reacción 2 ml en PTW en las cavidades de una bandeja de la taza de moldeo de polietileno con una pipeta de transferencia (5 mm de diámetro). </li><li> Preparar 2% de agarosa (grado de ADN) en 1x PBS en un matraz Erlenmeyer. Calentar en el microondas a 600 W hasta que la agarosa se disuelva por completo. Preparar 50 ml de 10 cerebros. Deje ªe agarosa enfriar durante 3 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Mantener la agarosa en un bloque de calentamiento pre-calentado (60 ° C) mientras que la incrustación de los cerebros con el fin de evitar la solidificación. </li><li> Retire el PBS 1x del molde que contiene un cerebro mediante el uso de una pipeta Pasteur (1 mm de diámetro). Tenga cuidado de no dañar el cerebro. </li><li> Vierta en el molde de agarosa y llenarlo por completo. A continuación, utilice una aguja de disección para agitar el cerebro de la agarosa para lavar el PTW por lo que es más fácil de incrustar el cerebro. </li><li> Oriente el cerebro en la parte ventral del molde hacia abajo, lado dorsal y colocarlo directamente. </li><li> Deje que la agarosa se enfríe. Para un enfriamiento más rápido, colocar el molde en hielo. Repita los pasos. </li><li> Repita 2.3.3-2.3.6 para todos los cerebros. </li></ol></li><li> Recorte de la agarosa Bloquear <ol><li> Usando una aguja de disección, saltará el bloque de agarosa. </li><li> Con una hoja de afeitar afilada, cortar la agarosa en el extremo posterior del cerebro. Asegúrese de que este plano es paralelo al del telencephalon. </li><li> Cortar la agarosa en el extremo anterior del cerebro. Luego, abre el bloque para que se destaca en el plano posterior. </li><li> Retire el exceso de agarosa al cortar en paralelo a dorsal del cerebro y ventral. Luego, abre el cerebro atrás de modo que se encuentra en su lado ventral. </li><li> Cortar el bloque a un triángulo truncado en el que el telencéfalo está situado en el avión más pequeño (Figura 2). </li></ol></li><li> Preparación de la Vibratome para seccionar <ol><li> Preparar la vibratomo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use una hoja de afeitar nueva y reemplazarlo después de 10 cerebros. </li><li> Llenar el baño de tampón con 1x PBS hasta un nivel que sólo alcanza la parte inferior de la hoja. </li><li> Coloque un pequeño punto de pegamento en la parte superior de la platina del vibratome. </li><li> Coloque con cuidado el plano que se encuentra por detrás del cerebro en el pegamento. El pegamento se endurezca tan pronto como está en contacto con el 1x PBS enel baño tampón vibratome. </li><li> Inserte la platina con la muestra en la bandeja de buffer usando el manipulador del microtomo. </li><li> Utilice el manipulador para girar la platina en la posición deseada. Oriente el bloque en el baño de tampón de una manera que localiza el telencéfalo justo debajo de la superficie, con la parte dorsal del cerebro frente a la cuchilla. Luego apriete el SCRW con una llave Allen de 3 mm y retire el manipulador. Nota: El tornillo de sujeción o uno de los dispositivos de sujeción no deben estar situados sobre la brecha en la platina; en estas posiciones de sujeción del disco muestra no es posible. </li></ol></li><li> Seccionar el cerebro <ol><li> Preparar una placa de 24 pocillos para recoger las secciones. Por cerebro para ser seccionada, llenar un pocillo con 1 ml de tampón de bloqueo (0,1% (v / v) 10% de Tween-20, 0.2% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA), 1% (v / v) sulfóxido de dimetilo (DMSO) en PBS). </li><li> Comience el corte a 50 micras de espesor, velocidad de 1 mm / s, y 70 Hz de frecuenciausando un microtomo de vibración. </li><li> Use un cepillo sintético (1 mm) para recoger las rebanadas finas de agarosa medida que salen de la hoja y los recogen en la placa de 24 pocillos. </li></ol></li><li> La inmunohistoquímica en Vibratome Secciones <ol><li> Bloquear los sitios de unión no específica durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (0,1% (v / v) 10% de Tween 20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO en PBS). </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 250 l de anticuerpo diluido en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, se incuba el anticuerpo primario durante 2 horas a TA. A continuación, lavar 3x durante 10 minutos en PTW. Nota: Para la tinción de PCNA utilizar una dilución 1:400 (ratón anti-PCNA Para más detalles ver tabla de materiales.). Múltiples anticuerpos primarios se pueden incubar en el mismo tiempo. </li><li> Incubar las secciones en anticuerpo secundario durante 2 horas a TA, luego lavar 3x durante 10 min en PTW. Nota: 1:1000 dilución en PTW, para el detalle vea la tabla de materiales. Anticuerpos secundarios múltiples pueden ser incubadas en el mismo tiempo. </li><li&gt; Opcional: Se observan los mejores resultados cuando las secciones se mantienen en PTW durante la noche a 4 ° C con el fin de permitir el lavado de los anticuerpos secundarios unidos de forma no específica. En este caso, reemplace el PTW una vez más antes de su montaje. </li></ol></li><li> ARN cerebrales en adultos hibridación in situ (como alternativa a la inmunohistoquímica) <ol><li> Cerebro La disección y fijación (mismo procedimiento que para inmunohistoquímica): <ol><li> La hibridación de la sonda. </li><li> Rehidrate cerebros en 2 ml de tubos de reacción como se describe para la inmunohistoquímica. </li><li> Incubar cerebros en proteinasa K (ProtK;. 10 mg / ml de concentración final) en PTW durante 30 min. Después del tiempo de incubación retire ProtK / PTW y corregir los cerebros de nuevo durante 20 minutos en el BT-Fix (PFA al 4%, 4% de sacarosa, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> Lavar cerebros 5x durante 5 min en PTW (0,1% (v / v) de Tween-20 en PBS). </li><li> Retire PTW y enjuague los cerebros de 500 lHYB tampón (50% (v / v) de formamida desionizada, 5x SSC, 500 microgramos / ml de ARNt de levadura, 50 g / ml de heparina, 0,1% de Tween-20, 9 mM de ácido cıtrico). Esperar hasta que los cerebros se hunden hasta el fondo del tubo a continuación, descartar el sobrenadante y añadir 500 l de tampón de HYB limpia y se incuba a 65-70 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Diluir la sonda de ARN a 1:200 o 1:400 (dependiendo de la sonda) en un volumen final de 400 l de tampón de HYB. Calentar la sonda de ARN diluido a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los cerebros y agregue la sonda de ARN, se incuban a 65-70 ° C (O / N). Todas las soluciones tampón de lavado debe ser precalentado y se mantuvieron a 70 ° C. </li></ol></li><li> Etiquetado <ol><li> Lavar los cerebros a 65-70 ° C (durante todas las 4 etapas de lavado) con 500 l de tampón de lavado 1 (50% de formamida, SSC 1x, 0,05% de Tween 20) dos veces durante 30 min. Reemplazar tampón 1 por tampón 2 (2x SSC, 0,1% de Tween 20), y se incuba durante 15 min. Retirar el tampón 2 y lavar cerebros en tampón 3 (0,2 x SSC, 0,1% de Tween 20) for 30 min, repita este paso 2 dos veces. Reemplace tampón 3 por tampón 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 en PTW), incubar durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar durante 5 min en 500 l de PTW a TA. </li><li> Incrustar cerebros en 2% de agarosa (en 1x PBS) y cortar secciones de vibratomo (50-100 M) como se describe para la inmunohistoquímica. </li><li> Lavado 1x por 5 min en 500 l de tampón de bloqueo (1x PBS, 0,1% de Tween-20, 0.2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO). </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de tampón de bloqueo durante 2 horas a TA. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 300 l anti-Dig anticuerpo acoplado-AP diluido 1:4000 en tampón de bloqueo. </li><li> Incubar o / n a 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP de tinción <ol><li> Lavar 5 veces durante 15 min con tampón de PTW a TA. </li><li> Enjuague en 1x tampón de tinción. Lavar dos veces 5 minutos en tampón de tinción (100 mM Tris / HCl, pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20). </li><li> Aspirar el sobrenadante y se tiñen con 500 μl de solución de tinción (3,5 l de cloruro de tetrazolio 4-(NBT) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) por 1 ml de tampón de tinción). </li><li> Deje de manchar enjuagando 3x a 5x con PTW. </li></ol></li></ol></li><li> El montaje de las secciones <ol><li> Monte las secciones sobre portaobjetos utilizando un medio de montaje no fluorescente soluble en agua (consulte la tabla de Materiales). </li><li> Mantenga las diapositivas en la nevera a 4 ° C. Nota: La tinción es estable durante varias semanas o incluso meses. </li><li> Analizar las diapositivas bajo un compuesto o microscopio confocal. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe aquí un método para inducir una lesión telencefálica empujando una aguja a través del cráneo del pez cebra adultos, y para analizar la reacción celular y molecular a esta lesión por inmunohistoquímica e hibridación in situ. La principal ventaja de esta técnica sobre otros enfoques existentes es su simplicidad, velocidad y eficiencia de costes. Por lo tanto, esta técnica, que permite la producción de muchos cerebros lesionados en un corto período de tiempo, se puede combinar fácilmente con una gran escala en pantalla de hibridación in situ para identificar los genes con un papel en la regeneración y la neurogénesis. La edad del pez cebra adulto en el que se realiza la lesión es crucial. Si los peces son mayores de 1,5 años, el cráneo es demasiado difícil y es posible que el cráneo está siendo empujado hacia abajo o se fracturó y no limpiamente perforada. En cambio, en los peces más jóvenes (menores de 4 meses), todavía hay una gran cantidad de la neurogénesis en marcha, que podría lead a falsos resultados positivos en relación con la neurogénesis reactiva. Otro paso fundamental en este enfoque es el de verificar la eficacia de la herida de arma blanca y de excluir que ambos hemisferios están heridos. Esto puede ser controlado por la tinción de las secciones con el anticuerpo anti-PCNA. En una lesión introducido correctamente, PCNA debe ser significativamente hasta reguladas en sólo uno de los hemisferios. Es importante tener en cuenta que la lesión mecánica inducida tendrá varios efectos secundarios tales como la ablación no específica de células, aumento de la muerte celular a causa de la degeneración secundaria, la inflamación y la destrucción de la barrera sangre-cerebro, y los daños de la zona ventricular y como una posible consecuencia de flujo del líquido cefalorraquídeo en el parénquima cerebral. Sin embargo, los peces heridos parecen sufrir muy poco de la lesión. Dentro de 2 minutos que nadan libremente de nuevo y su conducta de alimentación se restaura dentro de aproximadamente 4 horas. Después de 3 semanas, el injury no es morfológicamente visible ya. En nuestras manos, desde varios cientos de cirugías no perdimos un solo pez a pesar de que teníamos una tasa de lesiones del 100% según la evaluación de la histología a los 5 días después de la lesión. En los últimos años se han desarrollado otras técnicas, tales como los enfoques transgénicos en el pez cebra para producir tejido o tipo de célula de ablación específica 2. Aunque estas técnicas son muy elegante y mínimamente invasiva que se basan en la generación de complicadas construcciones de ADN y el establecimiento de varias líneas transgénicas estables de pez cebra, que puede ser muy tedioso y consume mucho tiempo. Por lo tanto, los enfoques mecánicos simples, tales como el ensayo descrito en este protocolo siguen siendo una herramienta importante para el estudio de la neurogénesis adulta cerebro y la regeneración.

Los mamíferos tienen una capacidad muy limitada para generar nuevas neuronas durante la vida adulta, y la neurogénesis adulta en el cerebro se circunscriben principalmente a dos regiones telencefálicas situados en la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales, y la zona subgranular (SGZ) del dentado circunvolución en el hipocampo 1. Los mamíferos también no pueden reparar el daño del cerebro causada por enfermedades neurodegenerativas, ictus o lesiones, de manera eficiente. Neuronas perdidas no se reemplazan y en lugar de la proliferación de diferentes tipos de células gliales, incluyendo astrocitos, microglia, y oligodendrocitos, se observa. Como consecuencia de este proceso proliferativa llamado gliosis reactiva, el tejido cerebral lesionado está sellada por la formación de una cicatriz glial, que inhibe la regeneración axonal neuronal y 2-4. En contraste a los mamíferos, peces teleósteos como el pez cebra formar nuevas neuronas en abundancia en los estadios adultos y tienen un alto regenerativa y proliferaive potencial de reparar lesiones del sistema nervioso central 2,5-7. El cerebro adulto pez cebra contiene 16 distintos nichos de células madre neurales que generan un gran número de nuevas neuronas durante toda la vida 8-11. Las neuronas que nacen en estas zonas de proliferación específicas del cerebro de pez cebra adultos emigran a las zonas beneficiarias, donde van a madurar e integrar en las redes neuronales existentes 8,10,12-15. Entre las zonas progenitoras identificadas en el pez cebra adultos, la zona ventricular telencefálica es uno de los nichos de células madre neuronales más estudiados. Las células en este nicho progenitor se pueden clasificar en tres tipos distintos en cuanto a su morfología, la tasa y la expresión de diferentes marcadores neuronales o gliales división. Tipo I y Tipo II son células gliales radiales como las células que tienen procesos largos. Ellos expresan marcadores de células madre, incluyendo GFAP, nestina y S100β. El tipo I células no proliferan, mientras que las células de tipo II proliferae lentamente, como se evidencia por su expresión de marcadores de proliferación, tales como la proliferación de células antígeno nuclear (PCNA) y la incorporación de análogos de desoxythymidine. Las células de tipo III están dividiendo rápidamente las células que se han comprometido a convertirse en progenitores neurales y expresar genes marcadores neuronales, tales como PSA-NCAM 5,16. Aunque las capacidades regenerativas de peces teleósteos están bien documentados, sólo pocas publicaciones han descrito e investigado en detalle los mecanismos celulares y moleculares implicados en la regeneración neuronal en el telencéfalo adulta en respuesta a una lesión 15,17-22. Para descifrar los mecanismos implicados en el pez cebra adulto regeneración del sistema nervioso central y la reparación y para comprender las similitudes y las diferencias entre la neurogénesis constitutiva y regenerativa, hemos desarrollado un modelo de pez cebra de la lesión telencephalic adulto. Aquí, vamos a describir visualmente cómo generar una lesión en uno de los Hemisfe telencephalicEres con la ayuda de una aguja de jeringa, mientras se mantiene el lado no lesionado contralateral como control interno. También mostraremos cómo monitorear cambios sobre la lesión en la proliferación celular y la expresión génica mediante técnicas de inmunohistoquímica y en ensayos de hibridación in situ.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 30 G (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de vasos de moldeo de polietileno&nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Agarosa universal&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de disección</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&ouml; ffler und W&ouml; rner</td><td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx? ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>de vidrio Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1.000)</td><td>Anticuerpo</td> acoplado a <td>AP GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig de Aves Labs&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de tetrazolio 4-Nitroblue (NBT)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de vasos de moldeo de polietileno&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Sp5 DM6000</td><td>Microscopio</td> de disección Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Catálogo de halcones&nbsp;</td><td></td><td></td>353226</tr><tr><td>Estudiante Dumont #5 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas 91150-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td><td>Shin et al.24</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Cepas WT (e.g., AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

puñalada de lesiones de la herida del pez cebra telencéfalo adultos: un método para investigar vertebrados cerebro neurogénesis y regeneración

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Pez cebra adultos tienen una asombrosa capacidad para regenerar su sistema nervioso central después de la lesión. Para investigar la respuesta celular y los mecanismos moleculares implicados en el sistema nervioso central adulto el pez cebra (CNS) regeneración y reparación, se desarrolló un modelo de pez cebra de la lesión telencephalic adulto. En este enfoque, generamos manualmente una lesión empujando una aguja de jeringa de insulina en el telencéfalo de adultos de pez cebra. En diferentes días después de la lesión, los peces se sacrifican, sus cerebros se diseccionaron y se tiñeron mediante técnicas de inmunohistoquímica y / o hibridación in situ (ISH) con marcadores adecuados para observar la proliferación celular, gliogenesis, y la neurogénesis. El hemisferio contralateral no lesionado sirve como un control interno. Este método combinado por ejemplo con ARN secuenciación profunda puede ayudar a la pantalla de nuevos genes con un papel en el pez cebra neurogénesis adulta telencéfalo, la regeneración, y la reparación.

Utilizando el flujo de trabajo descrito en este artículo, una lesión se introdujo en el hemisferio derecho del telencéfalo adultos de pez cebra (Figuras 1A-1B). Una herida correcta conduce a un canal de la lesión que se extiende desde dorsal a ventral a través de todo el palio del telencéfalo (Figura 3C). La lesión se debe restringir a uno de los hemisferios y no debe cruzar el ventrículo medial. El canal lesión es visible con el microscopio de campo claro (Figura 3 C) y se curó después de aproximadamente 35 días 15. Se demostró previamente que después de la herida una regulación de la proliferación celular antígeno nuclear (PCNA; Figura 3A) y S100β (Figura 3B) en 3 a 7 DPL es detectable por inmunohistoquímica 15. La tinción de PCNA y S100β es la superposición, indicando la proliferación de células gliales radiales. Furthermore, con el fin de visualizar las células precursoras de oligodendrocitos (OPC), un ensayo de herida de arma blanca se realizó en la Tg (Olig2: EGFP) de pescado 24. Tras la tinción con un anticuerpo anti-GFP, la acumulación de los OPC en estrecha proximidad con el canal de lesión es detectable (Figura 3D). Esta acumulación es transitoria, y grupos OPC no se observan más a 35 dpl 15. Si la lesión no se introdujo correctamente, el canal de la lesión no será visible, y sobre regulación de PCNA y S100β o acumulación de los OPC no será detectable. PCNA es el marcador más sensible para la lesión cerebral. Con el fin de verificar la eficacia de la herida de arma blanca y de excluir que los dos hemisferios están heridos, se recomienda encarecidamente a manchar siempre las secciones con un anticuerpo anti-PCNA. En una lesión introducido correctamente, PCNA debería ser significativamente hasta reguladas (hasta 4 veces 15) en sólo uno de los hemisferios. Aunque en la mayoría de los casos essuficiente para sólo usar el lado no lesionado contralateral como control interno para monitorizar los cambios en la expresión génica, es muy recomendable para comparar la expresión génica en el hemisferio de control con la expresión en hemisferios telencefálicas de cerebros de tipo salvaje. De esta manera, cualquier efecto sistémico de la lesión en la expresión génica que afectaría a ambos hemisferios se pueden detectar. El ensayo de la herida de arma blanca en combinación con una pantalla sistemática expresión de reguladores de la transcripción (TR) (25 y Schmidt et al., No publicado) también se puede utilizar para identificar los genes TR con un posible papel en la neurogénesis y la regeneración (Figuras 4A-4C). Este enfoque ha identificado una serie de factores que se expresan en el telencéfalo y cuya expresión es específica hasta reguladas en respuesta a la lesión (Figura 4A-C). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Representación esquemática de adultos de pez cebra herida de arma blanca telencephalic. A) una aguja de jeringa de insulina es empujado a través del cráneo de un pez cebra adulto para generar una lesión telencefálica. El blanco de línea discontinua representa la frontera entre los dos hemisferios telencefálicas y la cruz verde indica la posición de la herida de arma blanca. B) Vista dorsal de un pez cebra cerebro adulto. Las principales áreas del cerebro que se indican. La cruz verde muestra la posición de la lesión inducida. C) La punta de la aguja, que sirve para inducir la lesión telencefálica, mide 2 mm. Bulbo olfatorio (OB), telencéfalo (tel) y techo óptico (ot). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Srepresentación chematic de un cerebro del pez cebra adulto en un bloque de agarosa recortado justo antes vibratome seccionamiento. anterior es hacia arriba. Bulbo olfatorio (OB), telencéfalo (tel), techo óptico (ot), cerebelo (cb) y médula (m). Barra de escala: 500 m. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Respuestas regenerativas para apuñalar lesiones herida. AD) Adulto cerebro del pez cebra a los 5 días después de la lesión (DPL). AB) El PCNA proliferativa marcador (A) y el marcador de la glía radial S100β (B) son regulados hasta en la zona ventricular (flechas) en las heridas de arma blanca. (C) El canal de lesión es visible bajo iluminación de campo brillante (flechas). La zona ventricular está indicada por la línea verde. las células precursoras de oligodendrocitos (D) (OLIG2: EGFP +) se acumulan en el sitio de lesión (flechas). Barra de escala: 200 m. En todos los paneles, el hemisferio derecho es el hemisferio lesionado. Dorsal está para arriba. La línea discontinua en la A a la D indica la frontera entre el palio y el subpallium. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Un ejemplo de genes regulados en respuesta a apuñalar lesiones. Tenga en cuenta la fuerte sobre regulación (flechas) de eomesa (A, B) y sox4a (C) mRNA expresión en el hemisferio telencephalic derecho (hemisferio apuñalado) monitorizada por hibridación in situ en 5 DPL. El hemisferio izquierdo está ileso y sirve como control. (B) muestra un aumento mayor de la región dorsal del telencephalic A. dorsal es hacia arriba. Barra de escala: 200 m para A y C y 55 micras para B. Ellínea de puntos en A y C indica la separación entre el palio y el subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> ABREVIATURAS </td></tr><tr><td> AP </td><td> Fosfatasa Alcalina </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Albúmina de suero bovino </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Sistema nervioso central </td></tr><tr><td> Excavación </td><td> Digoxigenina </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sulfóxido de dimetilo </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Días después de la lesión </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin homólogo de un </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> La proteína ácida glial fibrilar </td></tr><tr><td> hr </td><td> Hora </td></tr><tr><td> HYBbuffer </td><td> El tampón de hibridación </td></tr><tr><td> ISH </td><td> hibridación in situ </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Metanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro azul tetrazolio </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> Las células precursoras de oligodendrocitos </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Salina tamponada con fosfato </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Antígeno nuclear de proliferación celular </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldehyde </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinasa K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polisialiladas molécula de adhesión celular neuronal </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% de Tween-20 </td></tr><tr><td> ARN </td><td> El ácido ribonucleico </td></tr><tr><td> RT </td><td> Temperatura de la habitación </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Zona subgranular </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-box que contiene el gen 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Citrato sódico salino </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Zona subventricular </td></tr><tr><td> TR </td><td> Reguladores de la transcripción </td></tr></tbody></table>

Para arrojar luz sobre los mecanismos celulares y moleculares de la neurogénesis y regeneración del pez cebra adulto, desarrollamos un protocolo para la cirugía invasiva que causa lesiones mecánicas en el telencéfalo adulto del pez cebra y el posterior seguimiento de los cambios en el hemisferio apuñalado mediante inmunohistoquímica o hibridación in situ.

Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la respuesta celular y los mecanismos moleculares implicados en la neurogénesis adulta y en la regeneración y reparación del sistema nervioso central. En el pez cebra, esto se logra primero generando manualmente una lesión mediante la punción del hemisferio céfalo derecho de un pez cebra adulto. Luego, a los cinco días posteriores a la lesión, el pez se sacrifica, su cerebro se extrae mediante disección e incluye en aros para su seccionamiento en un ome. Luego, las secciones cerebrales se tiñen mediante inmunohistoquímica o hibridación in situ con marcadores adecuados. Con el fin de observar la proliferación celular, la gliogénesis y la neurogénesis, se obtienen resultados que muestran la sobreexpresión del marcador de proliferación PCNA, el marcador de células gliales radiales S100β y las células precursoras de oligodendrocitos marcadas con EGFP, etiquetadas en la zona ventricular tras una lesión por punción. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el enfoque transgénico para producir ablación específica de tejido o tipo celular, radica en su simplicidad, rapidez y eficiencia, lo que permite la producción de muchos cerebros lesionados en poco tiempo.Después de anestesiar peces cebra adultos según el protocolo descrito en el texto, coloque cada pez individualmente en una hendidura de un bloque de espuma relleno con papel absorbente empapado en trica, bajo un microscopio estereoscópico con iluminación desde arriba. Sujete suavemente el pez con una mano y oriente el cuerpo de forma que permita acceder desde arriba a la cabeza con una jeringa equipada con una aguja de calibre 30. Con la otra mano, introduzca verticalmente la aguja a través del cráneo, sin profundizar más de dos milímetros en la región medial de un hemisferio cefálico.Después de inducir la lesión cefálica, coloque el pez en agua fresca para peces. Una vez finalizado, transfiera el pez de regreso al sistema de flujo de agua. Después de permitir que el pez se recupere durante el período de tiempo deseado y aplicar la eutanasia según el protocolo descrito en el texto, sacrifíquelo sobre hielo y use una tijera afilada para cortar por detrás de las branquias y separar la cabeza del cuerpo.Incube las cabezas en un XPBS durante cinco minutos para permitir la hemorragia. Luego, transfiera las cabezas a paraformaldehído al 4% en PBS e incube durante la noche a cuatro grados Celsius o durante cuatro horas a temperatura ambiente después de la fijación. Use un XPBS en una placa de Petri para lavar las cabezas dos veces.Luego, bajo un microscopio estereoscópico, diseccionar cuidadosamente los cerebros en PBS. Descartar cualquier cerebro que no presente una lesión visible. Transferir los cerebros a tubos de reacción de dos mililitros llenos con 1,5 mililitros de metanol al 100 % e invertir los tubos cinco veces antes de incubarlos a menos 20 grados Celsius durante al menos 16 horas.Para rehidratar el tejido para inmunohistoquímica, incube los cerebros durante cinco minutos cada uno en una serie descendente de metanol antes de lavarlos cinco veces con PBS Tween 20 o PTW, cinco minutos cada vez. A continuación, para incluir los cerebros, use una pipeta de transferencia para colocarlos en las cavidades de una bandeja de moldeo de polietileno y disuelva el 2% de agrosa en 1x PBS calentando en un microondas a 600 vatios.Deje enfriar el agros durante tres minutos antes de usarlo. Luego, retire cuidadosamente el PTW de un cerebro antes de usar aros para llenar completamente el molde. Utilice la aguja de disección para mover el cerebro dentro del aros con el fin de eliminar el PTW, oriente el cerebro con el lado ventral hacia abajo y el dorsal hacia arriba, y colóquelo en posición recta antes de dejar enfriar el agros.Utilizando una aguja de disección, retire el bloque de agarosa del molde. Luego, con la cuchilla de afeitar afilada, corte la agarosa paralelamente al talón cefálico en el extremo posterior del cerebro. Ahora corte la agarosa en el extremo anterior del cerebro antes de girar el bloque para que quede apoyado sobre el plano posterior.Elimine el exceso de agar realizando cortes paralelos a los lados dorsal y ventral del cerebro. Luego, gire el cerebro nuevamente para que quede apoyado sobre su lado ventral. Finalmente, corte el bloque en forma de triángulo truncado, en el que el cefalón se encuentra en el plano más pequeño.Después de preparar el viome según las instrucciones del fabricante, use un XPBS para llenar el baño de tampón de manera que apenas alcance la parte inferior de la cuchilla. A continuación, coloque un pequeño punto de pegamento superfuerte en la parte superior del disco del espécimen del vibrátomo. Luego, coloque cuidadosamente el plano del bloque que se encuentra posterior al cerebro sobre el pegamento superfuerte.Utilice el manipulador del micrótomo para insertar el disco de la muestra en la bandeja de tampón y gire el disco de la muestra hasta la posición deseada. Luego, utilice una llave Allen de tres milímetros para apretar el tornillo y retire el manipulador. Coloque el bloque en el baño de tampón de manera que el cefalón quede justo debajo de la superficie, con el lado dorsal del cerebro orientado hacia la cuchilla para seccionar los cerebros.Prepare una placa de 24 pocillos para recolectar las secciones, añadiendo un mililitro de tampón bloqueante por cerebro en los pocillos de la placa con el microtomo vibrante. Comience el corte con un grosor de 50 micrómetros, una velocidad de un milímetro por segundo y una frecuencia de 70 hercios. Utilizando un pincel sintético, recoja las láminas delgadas de aros a medida que salen de la hoja y coléctelas en la placa de 24 pocillos.Para realizar la inmunohistoquímica, bloquee los sitios no específicos durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón y agregue 250 microlitros de anticuerpo diluido en tampón de bloqueo; incube toda la noche a cuatro grados Celsius o durante dos horas a temperatura ambiente antes de usar PTW para lavar las muestras tres veces, un minuto cada vez. Después de la incubación, agregue los anticuerpos secundarios y incube durante dos horas a temperatura ambiente.Lave las secciones tres veces. Utilice un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente para montar las secciones. A continuación, analice las muestras bajo un microscopio compuesto o confocal.Cuando se realiza correctamente, una herida provoca un canal de lesión que se extiende de dorsal a ventral a través de la palma del cefalópodo de la cola, el cual se curará tras 35 días. Se ha demostrado previamente mediante inmunohistoquímica que la lesión provoca una sobrexpresión de PCNA, S100 beta y un patrón superpuesto entre los tres y siete días posteriores a la lesión, lo que indica la proliferación de células gliales radiales.Esta figura muestra una acumulación transitoria de células precursoras de oligodendrocitos o OPCs en proximidad cercana a una herida por punción inducida en peces transgénicos olig dos EEG FP, la cual ya no se observa el día 35 posterior a la lesión. Si la lesión no se introduce adecuadamente, el canal de la lesión no será visible. Una regulación positiva de PCNA y S100 beta o la acumulación de OPCs es indetectable.Como se presenta aquí, una pantalla de expresión sistémica que compara reguladores de la transcripción en los cerebros de peces con lesiones frente a cerebros de tipo silvestre ha identificado una serie de factores que se expresan en el telencéfalo y que se sobreexpresan en respuesta a una lesión. El método de herida por incisión, combinado, por ejemplo, con secuenciación profunda de ARN y/o hibridación in situ, puede ayudar a identificar nuevos genes implicados en la neurogénesis, regeneración y reparación en el pez cebra adulto.

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Investigación

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Neurociencia

Este video describe la técnica de microdisección del cerebro de un pez cebra adulto. Este método ayuda a obtener neuorosferas derivadas de todo el cerebro que se pueden estudiar más a fondo.

Disección del cerebro del pez cebra: una técnica de neurobiología de peces

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Aquí se presenta un método de electroporación para la entrega de ADN plásmido y el etiquetado de células ependimarinas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo es un método rápido y eficiente para visualizar y rastrear células ependymoglial individuales y abre nuevas posibilidades para aplicar la electroporación a una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Se describe un modelo mecánico de lesión cerebral en el pez cebra adulto para investigar los mecanismos moleculares que regulan su alta capacidad regenerativa. El método explica crear una lesión por arma blanca en el tectum óptico de múltiples especies de peces pequeños para evaluar las respuestas regenerativas utilizando inmunotinción fluorescente.

Modelo de lesión por puñalada del Tectum óptico adulto utilizando pez cebra y medaka para el análisis comparativo de la capacidad regenerativa

Capaz de recuperarse funcionalmente después de una lesión de la médula espinal, el pez cebra adulto es un sistema modelo de primer nivel para dilucidar los mecanismos innatos de regeneración neuronal. Aquí, describimos la resistencia a la natación y los ensayos de comportamiento de natación como lecturas funcionales de la regeneración de la médula espinal.

Evaluación de la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos

El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.

Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra

Aprende a inducir lesiones mecánicas en el telencéfalo de pez cebra adulto para estudiar neurogénesis y regeneración cerebral. Este protocolo utiliza inmunohistoquímica para analizar marcadores de proliferación celular.

Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración (Video) | JoVE Journal

Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración

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