Name: Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende endoscopia murina para evaluar colitis, cicatrización de heridas y carcinogénesis en ratones mediante imágenes fluorescentes in vivo. Este método permite seguimiento serial y caracterización funcional de lesiones neoplásicas.

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Damos las gracias a Sonja Dufentester y Elke Weber para la asistencia técnica de expertos. Agradecemos Faekah Gohar para la corrección del manuscrito y Stefan Brückner apoyo informática médica. Este trabajo fue apoyado por una beca interdisciplinaria del Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth fue apoyado por una beca de investigación de la Facultad de Medicina de la Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner fue apoyado por una posición de giro &quot;Gerok&quot; de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Agradecemos Heike Blum para la ilustración de la historieta del ratón.

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) de acuerdo con la Ley de Protección Animal alemán. 1. Materiales y Configuración Experimental <ol><li> Cuidado de los animales <ol><li> Utilice femenino o ratones machos de cualquier cepa que pesa de 20 a 25 g y alojarlos según la legislación local de cuidado de animales. </li><li> Alimente ratones con Chow especial para roedores y aplicar chow-alfalfa libre de por lo menos tres días antes de la fluorescencia exámenes para minimizar endoluminal autofluorescencia. </li><li> Proporcionar autoclave beber agua ad libitum. </li></ol></li><li> La inducción de la colitis inducida por DSS aguda <ol><li> Preparar un 3% (w / v) de sulfato de dextrano sódico (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) solución disolviendo 3 g de DSS en 100 ml de agua en autoclave. Ofrecer esta solución ya que el agua potable exclusivo de ratones ad libitum y calcular 5 ml de solución de DSS-por ratón / día. RSS contratones rol con agua tratada en autoclave sin DSS ad libitum 9. </li></ol></li><li> La inducción de cáncer colorrectal <ol><li> Disolver azoximetano mutagénico (OMA) (PRECAUCIÓN Puede provocar cáncer y daños genéticos!) En solución salina isotónica estéril para obtener una concentración final de 1 mg / ml. Aplicar una dosis única de 10 mg AOM por kg de peso corporal por vía intraperitoneal usando una jeringa de 1 ml (30 G) 10. </li><li> Ratones reto (con exclusión de los ratones de control) con ciclos repetitivos de 3% (w / v) DSS desde el día 0 a 7, 14 a 21 días, el día 28 a 35 y de 42 a 49 días para inducir inflamatoria con la carcinogénesis colorrectal. Alimente los ratones con agua tratada en autoclave solamente entre estos desafíos (véase la figura 4A para un calendario detallado). Alimente los ratones de control con agua tratada en autoclave durante todo el experimento. </li></ol></li><li> Preparación de la endoscopia de fluorescencia (FE) <ol><li> Uso de fluoresceína-Isothiocyanat (FITC) - dextrano (peso molecular 70.000 Da; FITC: Glucosa = 1: 250) para detección de adenoma de colon por realce visual de la displasia asociada patrón vascular. </li><li> Administrar 60 mg de dextrano-FITC conjugado diluido en 100 l de PBS por vía intravenosa 5 minutos antes de un examen endoscópico de fluorescencia. </li></ol></li><li> Anestesia <ol><li> Proporcionar un suministro continuo para la anestesia de isoflurano (1,5 LO 2 / min; 1,5-2% en volumen de isoflurano [2-cloro-2-(difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano]). Utilice un equipo especial de anestesia veterinaria con una mascarilla para controlar estrechamente la anestesia. </li></ol></li><li> Preparación de enema <ol><li> Inculcar 2 ml de enema líquido (contenido: hidrogenofosfato disódico 1,5% (w / v) y dihidrogenofosfato de sodio 11% (w / v)) en el colon si se sospecha de carga fecal significativa que puede ocultar la vista. </li></ol></li></ol> 2. Equipo técnico <ol><li> Utilice una estación de trabajo endoscópica veterinaria que se elaboró ​​y aprobó el uso de la endoscopia pequeño animal. Conecte el workstation a una unidad de cámara, una fuente de luz de xenón, una bomba de aire y a un monitor de PC convencional para la luz blanca de la endoscopia. A continuación, conecte la cámara y el telescopio rígido miniatura (1,9 mm de diámetro exterior, 10 cm de longitud; la Figura 5). </li><li> Utilice funda de endoscopio con canal de trabajo (Figura 5D) para la aplicación de fórceps de biopsia o tubo de inyección. Utilice la vaina sin canal de trabajo para colonoscopia diagnóstica. </li><li> Configurar los ajustes de la fuente de luz para la endoscopia de fluorescencia para excitar trazadores utilizados (por ejemplo, 490 nm para el dextrano conjugado con FITC). Además, integrar un filtro de paso de banda adecuado entre el telescopio y la cámara (por ejemplo, 525 nm para el dextrano conjugado con FITC). </li><li> Inserte las pinzas de biopsia flexibles (3 Charr., 28 cm) a través del canal de trabajo del endoscopio para obtener biopsias. </li><li> Introducir el tubo flexible de inyección (0,96 mm) a través del canal de trabajo para la administración tópica, intramucoso o endoluminal undministración de agentes de diagnóstico o terapéuticos. </li><li> Utilice una mesa de examen que se puede calentar con una temperatura de 42 ° C. Esto evita que los ratones hipotermia durante el examen. </li></ol> 3. Anestesia de Animales <ol><li> Coloque el ratón en una caja pequeña, pero a prueba de fugas y administrar isoflurano (100% (v / v), 5% en volumen, 3 L / min). Espere hasta que el ratón pierde el conocimiento. </li><li> Transferir el ratón sobre la mesa de examen para la endoscopia. Continuar la inhalación de isoflurano a través de la máscara de cara con una dosis de 100% v / v, 1,5% en volumen, 1,5 L / min. Siempre aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad ocular, mientras que bajo anestesia. </li><li> Evaluar la eficacia de la anestesia mediante la comprobación de los reflejos. Compruebe la &#39;vuelta alrededor reflex&#39;: si anestesiado suficientemente, un ratón que se en la espalda no debe dar la vuelta. Compruebe los dedos de los pies &#39;reflejo&#39;: cuando la anestesia es adecuada, suave pellizco entre los dedos de los animales no debe llevar a la retirada de la pata (etapa detolerancia quirúrgica). </li></ol> 4. Colonoscopia <ol><li> Coloque ratón anestesiado propensa / en la espalda a la mesa de examen. </li><li> Administrar 2 ml de enema mediante una cánula abotonado en el colon si se sospecha de la carga fecal significativa que puede dificultar la visión. Espere a que los ratones que defecan después de administrar el enema. Inserte el endoscopio con mucho cuidado para evitar la perforación. </li><li> Abra las dos válvulas de la funda con uno de ellos está conectado a la bomba de aire. Selle la otra válvula con su dedo índice para prescindir de aire. Inflar colon con aire, lenta y cuidadosamente, sobre todo en el caso de la biopsia o la inyección. </li><li> Avanzar endoscopio sólo hasta la flexura del colon derecho a evitar la perforación (4-5 cm del ano). </li><li> Colonoscopia diagnóstica <ol><li> Examinar la mucosa de las alteraciones inflamatorias o malignas, mientras que tirando hacia atrás el endoscopio. Tire hacia atrás lentamente para evaluar toda la circunferencia del intestino. Evaluar pa intraluminalthologies utilizando los sistemas de puntuación establecidos apropiadas según sea necesario. </li><li> Para justificar la posición endoscópica idéntico para la adquisición de imágenes durante visualizaciones repetitivos de las áreas de la herida, tenga en cuenta la distancia entre el ano murino y la lesión de la mucosa. Además, el uso de la punta de las pinzas de biopsia como un espaciador para lograr distancia idéntica entre el endoscopio y el área de la herida durante la adquisición de imagen. El tamaño de la herida está relacionada con el tamaño de la funda de endoscopio, que comprende 3 mm. NOTA: Coloque endoscopio en posición idéntica en comparación óptica con documentación fotográfica de los exámenes anteriores. Medida lesiones en el mismo ángulo y la distancia de cada seguimiento examen endoscópico. </li></ol></li><li> Procedimiento de biopsia <ol><li> Tomar biopsias con la ayuda de dos investigadores. Introducir las pinzas de biopsia con cuidado a través del canal de trabajo hasta que la punta de la pinza es visible en el monitor a la segunda investigador. Pinzas de apertura y cierre con cuidado a unvoid perforación. </li><li> Mueva fórceps para el sitio de la patología. </li></ol></li><li> Procedimiento de inyección <ol><li> Realizar el procedimiento de inyección con la ayuda de dos investigadores. Tubo flexible de inyección pre-llenado (0,96 mm) completamente con el agente a administrar. Empuje el tubo a través del canal de trabajo hasta que la cánula (30 G) es visible en el monitor para el segundo investigador. Preparar la multa jeringa y administrar suavemente la cantidad solicitada de agente de diagnóstico o terapéutico. Los volúmenes de inyección debe ser de 50 l como máximo. </li><li> Inserte la aguja en el submocosa en un ángulo de 15-30 grados. Enfrentar el bisel en la dirección de la mucosa. La mucosa muestra un signo de elevación característica después de la inyección con éxito. </li></ol></li><li> Endoscopia de fluorescencia (FE) <ol><li> Administrar 60 mg de dextrano-FITC conjugado diluido en 100 l de PBS por vía intravenosa antes de la fluorescencia examen endoscópico. </li><li> Compruebe el punto de tiempo óptimo entre la inyección desu fluorescente trazador marcado y el procedimiento de formación de imágenes que depende de la farmacología trazador. Configurar los ajustes de sistema de filtro de paso de banda de acuerdo a la longitud de onda de excitación y emisión del trazador utilizado. Realizar la endoscopia de fluorescencia para trazadores no específicos de volumen de sangre (por ejemplo, FITC) inmediatamente después de la inyección intravenosa del colorante fluorescente para evaluar el patrón vascular de la superficie mucosa. </li><li> Considere la posibilidad de obtener imágenes de varias horas después de la aplicación del marcador en caso de trazadores específicos o &quot;sondas inteligentes&quot; para ofrecer un mejor objetivo de fondo-ratio. </li><li> Realizar fotos y de video-documentación de los resultados. </li></ol></li></ol> 5. Post-colonoscopia <ol><li> Separar el ratón en una jaula vacía y colóquela sobre una toalla de papel para proteger el ratón de la aspiración de la camada. Calentar el ratón con una lámpara redlight para prevenir la hipotermia. Observe el ratón y no lo deje sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficienteconciencia para mantener decúbito esternal. Una vez completamente consciente, colocar el ratón de nuevo a su respectiva jaula. </li><li> Al final del experimento, el lugar del ratón en una caja pequeña, pero a prueba de fugas y administrar CO 2 (100% (v / v), 100% vol, 3 L / min). Espere hasta que el ratón pierde el conocimiento completo y deja de respirar. Despacho del ratón por fractura de cuello. Lleve a cabo una laparotomía abdominal y explantar el colon. Abra el colon longitudinalmente y lavarlo para su posterior evaluación histológica o molecular. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Cicatrización de la herida epitelial es un proceso continuo. Exfoliación fisiológica continua de células de la superficie dentro de la mucosa gastrointestinal se produce requiere la regeneración frecuente de las células epiteliales 16. En consecuencia, con problemas de curación de heridas tiene un inmenso impacto en varias enfermedades incluyendo las úlceras gastrointestinales y fuga anastomótica 17 18. Evaluación del fondo molecular, así como potenciales candidatos a fármacos para estimular la cic...

Los modelos animales han enriquecido enormemente nuestra comprensión de numerosas patologías intestinales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) se ha convertido en un modelo animal de primera en la investigación biomédica, debido a su abundante información genética y genómica y es fácilmente disponible en cepas transgénicas y knockout. Además de mejorar la comprensión patogénesis de la enfermedad, los modelos animales se utilizan también importante para probar los fármacos candidatos, así como las intervenciones diagnósticas o terapéuticas preclínicos. Sin embargo, a pesar de la variedad de modelos de ratones que imitan las enfermedades humanas, muchas opciones de diagnóstico y de intervención que se utilizan de forma rutinaria en la atención al paciente no están disponibles para los ratones. En consecuencia, las estrategias de vigilancia para monitorear el curso de la enfermedad murino o el efecto de las intervenciones terapéuticas a menudo se limitan a observaciones indirectas o análisis post mortem. Si bien existen procedimientos no invasivos para los ratones de vigilancia vitalidad como índices de actividad de la enfermedad, quantification de la pérdida o ganancia de peso, la sangre, la orina y las heces análisis, estos son sólo indicadores indirectos y están sesgadas por la variabilidad interindividual. Además, los análisis post mortem prevenir observaciones longitudinales en puntos de tiempo repetitivos. Sofisticadas técnicas de imagen para monitorear actividad de la enfermedad en ratones han sido recientemente introducido 1,2. Aunque estas técnicas de imagen permiten el análisis repetitivos, que sólo proporcionan una visión descriptiva y, a menudo impreciso en el intestino, no permitir la visualización directa de la mucosa o permitir las intervenciones diagnósticas o terapéuticas, tales como la adquisición de la biopsia o la aplicación tópica y intramucosa de los fármacos candidatos. Recientemente, los sistemas endoscópicos de alta resolución para uso en ratones vivos se han desarrollado 3,4. Por primera vez estas técnicas endoscópicas permiten la visualización directa de las patologías de la enfermedad del colon endoluminales tales como la curación de heridas o inflamación intestinal proporcionar objestado reflexivo, en tiempo real permitiendo estudios longitudinales en el mismo animal en puntos de tiempo repetitivos. Aparte de permitir biopsias repetidas en un ratón individual, sistemas endoscópicos también se pueden utilizar para influir terapéuticamente de un tumor distinto o inflamación localizada al permitir la aplicación directa de una sustancia para el área de interés. Además, como sustancias terapéuticas y de control pueden ser entregados directamente a la zona de interés, esto se puede realizar en el mismo ratón, con exclusión de la variabilidad inter-individual. Estos sistemas ahora se han empleado para la evaluación de la inflamación del colon, curación de heridas, biopsias de hígado ortotópico laparoscópicos y la inducción de tumores hepáticos 8 y el desarrollo del tumor usando varios sistemas de puntuación tales como el índice endoscópica murino de gravedad de la colitis (MEICS) 5-7. MEICS consta de cinco parámetros para evaluar la inflamación: engrosamiento de la pared del colon, los cambios del patrón vascular, presencia de fibrina, la granularidad de los mucosal de la superficie, y la consistencia de heces. En este protocolo se describe el uso de la endoscopia rígida en modelos murinos de cicatrización de la herida intestinal, inflamación y cáncer de colon. En primer lugar, se demuestra la evaluación endoscópica de la curación de heridas y la inflamación colónica así como la evaluación longitudinal de la actividad de la colitis y el estudio de carcinogénesis en el colon murino. Más allá del uso descriptivo de la endoscopia murino, se proporcionan instrucciones detalladas sobre el uso de instrumentación endoscópica para obtener biopsias, y la aplicación tópica y intramucosa de diferentes componentes de interés (por ejemplo, fármacos candidatos o células tumorales). Por último, demostrar el uso de la endoscopia de fluorescencia murino, que emplea sofisticadas técnicas de imagen molecular, en el entorno de los tumores colorrectales.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reactivos</td></tr><tr><td>Dieta sin alfalfa</td><td>Harlan Laboritories, Madison, Estados Unidos</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Azoximetano (AOM)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen ungüento oftálmico</td><td>Bayer, Leverkusen, Alemania</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano sódico (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Suecia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100 V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Alemania</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-metilbutano)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compuesto Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican F - cánula</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta estándar</td><td>Altromin, Lage, Alemania</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Países Bajos</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Alemania</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipo</td></tr><tr><td>AIDA Control</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20 096020</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda</td><td>Semrock, Rochester, Estados Unidos</td><td>HC 716/40</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso</td><td>de banda Semrock, Rochester, Estados Unidos</td><td>HC 809/81</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de biopsia, 3 Fr., 28 cm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>61071ZJ</td><td></td></tr><tr><td>Dell Monitor</td><td>Dell, Fráncfort del Meno, Alemania</td><td>U2412Mb</td><td></td></tr><tr><td>Funda de examen, 9 Fr.Karl</td> <td>Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>61029D</td><td></td></tr><tr><td>Funda de examen, 9 Fr.Karl</td> <td>Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>Cable de luz de fibra óptica, 3,5 mm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>69495NL</td><td></td></tr><tr><td>Azul fluoresceína Sistema de filtrado</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20100032</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de barrera de fluoresceína</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20100033</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pedal</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20010430</td><td></td></tr><tr><td>Telescopio HOPKINS, 1,9 mm, longitud 10 cm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>1830231</td><td></td></tr><tr><td>SCB D-luz P&nbsp;</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20 133720</td><td></td></tr><tr><td>SCB tricam SL II</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20 2230 20</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de juego de tubos VETPUMP II</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>69811</td><td></td></tr><tr><td>Tricam PDD PAL</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>20221037</td><td></td></tr><tr><td>UniVet Porta</td><td>Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Alemania</td><td>BKGM 0451</td><td></td></tr><tr><td>Vetpump 2</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania</td><td>69321620</td><td></td></tr></tbody></table>

murino endoscopia para en vivo healing multimodal imaging de carcinogénesis y evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Los modelos de ratón se utilizan ampliamente para estudiar la patogénesis de las enfermedades humanas y para evaluar los procedimientos de diagnóstico, así como las intervenciones terapéuticas preclínica. Sin embargo, la evaluación válida de alteraciones patológicas a menudo requiere el análisis histológico, y cuando se realiza ex vivo, requiere la muerte del animal. Por lo tanto en entornos experimentales convencionales, los exámenes de seguimiento intra-individuales son raramente posible. Así, el desarrollo de la endoscopia murino en ratones vivo permite a los investigadores por primera vez tanto a visualizar directamente la mucosa gastrointestinal y también repetir el procedimiento de supervisión para las alteraciones. Existen numerosas aplicaciones para la endoscopia murino in vivo, incluyendo el estudio de la inflamación intestinal o la cicatrización de heridas, la obtención de biopsias de la mucosa en varias ocasiones, y para administrar localmente agentes de diagnóstico o terapéuticos que utilizan catéteres de inyección en miniatura. Más recientemente, la imagen molecular se ha extendido mo de diagnóstico por imágenesdalidades que permiten la detección específica de moléculas diana diferentes utilizando fotosondas específicos. En conclusión, la endoscopia murino se ha convertido en una novedosa tecnología de vanguardia para el diagnóstico experimental de imágenes in vivo y puede tener un impacto significativo en la investigación preclínica en diversos campos.

En la vigilancia in vivo de cicatrización de la herida intestinal Durante la endoscopia de rutina, heridas de la mucosa fueron inducidas mecánicamente por fórceps de biopsia en miniatura con un diámetro de 3 Francés (igual a 1 mm; Figura 1A). Posteriormente, la cicatrización de heridas se monitorizó mediante exámenes endoscópicos diarias y cuantificado por medición de la zona de la herida residual utilizando software de edición de imagen, por ejemplo, Ima...

Pequeños técnicas de imagen permiten animales exámenes de diagnóstico de serie y las intervenciones terapéuticas en vivo. Recientemente, el alcance de las aplicaciones se ha ampliado significativamente y actualmente incluye la evaluación del desarrollo de tumores del colon, la cicatrización de heridas y el seguimiento de la inflamación. Este protocolo se ilustran estas diversas aplicaciones potenciales de la endoscopia murino.

Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

En este video, se presentará una variedad de aplicaciones de la endoscopia neuronal en la primera aplicación. En la segunda aplicación se mostrará cómo utilizar el endoscopio para puntuar la gravedad de la enfermedad en un modelo de ratón de colitis. El uso de la endoscopia para monitorizar in vivo la cicatrización de heridas mucosas se demostrará en la última aplicación.El uso de la endoscopia de fluorescencia para la detección de tumores intestinales y la técnica para inyectar agentes intramucosanos serán presentados en última instancia por la cicatrización de heridas intestinales, inflamación y cáncer. La agenesia puede evaluarse en función de los hallazgos del análisis endoscópico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el análisis histológico de la colitis experimental, es que con esta técnica se pueden realizar exámenes de seguimiento intra individuales y evaluar de forma repetitiva las alteraciones de la mucosa.Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación intestinal experimental, como cuál es el establecimiento temporal de la colitis. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia del cáncer colorrectal debido a la posibilidad de caracterizar funcionalmente las lesiones neoplásicas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo del cáncer colorrectal, también se puede aplicar a otros sistemas, como la enfermedad inflamatoria intestinal o la colitis infecciosa.En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al desafío de manejar la fluorescencia del endoscopio a pequeña escala. La endoscopia amplía el potencial de la endoscopia de luz amplia a la obtención de imágenes moleculares mediante la focalización específica de las estructuras celulares mediante trazas marcadas con fluorescencia durante los exámenes endoscópicos. Para inducir el cáncer colorrectal en los animales de experimentación, primero se utiliza una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 para inyectar interperitonealmente 10 miligramos por kilogramo mutagénicos recién preparados como oxi metano en cada ratón.Desafíe al grupo experimental de ratones con ciclos repetitivos de 3% de peso por volumen, sulfato de dextrano sódico o DSS desde el día cero hasta el 7, 21 a 28 y 42 a 49 para inducir el cáncer colorrectal inflamatorio. Agenesia suministrando a los ratones agua de autoclave entre los desafíos el día de la colonoscopia. Después de confirmar la sedación mediante un pellizco en el dedo del pie, use una cánula abotonada para instilar dos mililitros de enema líquido en el colon de un animal de experimentación.Si se sospecha de una carga fecal significativa, mientras espera que el ratón defeque, conecte una estación de trabajo endoscópica veterinaria para animales pequeños a la unidad de cámara para la endoscopia con luz blanca. Configure los ajustes de la fuente de luz para excitar las trazas que se inyectarán y, a continuación, integre un filtro de paso de banda adecuado entre el telescopio y la cámara. Ahora, coloque el ratón en la mesa de examen e inserte el endoscopio con mucho cuidado.Para evitar perforaciones, abra ambas válvulas de la funda. Se debe conectar una válvula a la bomba de aire. El otro debe sellarse con un dedo índice para controlar el aire.A continuación, infle el colon de forma lenta y cuidadosa, avanzando el endoscopio solo hasta el flexor del colon derecho para evitar la perforación a unos 4,5 centímetros del ano. Ahora, retire lentamente el endoscopio y examine la mucosa en busca de alteraciones inflamatorias o malignas, y evalúe toda la circunferencia del intestino. Luego, para recuperar una muestra de biopsia, introduzca las pinzas de biopsia con cuidado a través del canal de trabajo hasta que la punta de las pinzas sea visible en el monitor.Abra y cierre las pinzas con cuidado para evitar perforaciones y muévalas al sitio de la patología. Para la aplicación intramucosa de agentes farmacológicos, llene previamente un tubo de inyección flexible completamente con el agente de interés y, a continuación, empuje el tubo a través del canal de trabajo hasta que la cánula sea visible en el monitor. A continuación, coloque una jeringa fina e inserte la aguja en la submucosa En un ángulo de 15 a 30 grados mirando el bisel en dirección a la mucosa, administre suavemente hasta 50 microlitros del agente terapéutico.Después de una inyección exitosa, la mucosa exhibirá un levantamiento característico para realizar una endoscopia de fluorescencia, administrar el agente de interés por vía intravenosa antes del examen. Verifique el momento óptimo entre la inyección de su marcador marcado con fluorescencia y el procedimiento de diagnóstico por imágenes, que depende de la farmacología del trazador. Luego, para ver el agente inyectado por endoscopia fluorescente, configure los ajustes del sistema de filtro de paso de banda de acuerdo con las longitudes de onda de excitación y emisión del trazador inyectado.Finalmente, obtenga una imagen del tejido después de la aplicación del marcador para adquirir una lectura de la relación objetivo-fondo después de la inducción de colitis. Ratón. Muestran pérdida de peso a partir del tercer día con una pérdida máxima de peso corporal del 19% que ocurre en el séptimo día de acuerdo con la pérdida de peso corporal. El índice endoscópico neuronal de la puntuación de gravedad de la colitis aumenta al séptimo día después del inicio del DSS, lo que indica un daño inflamatorio masivo de la mucosa colónica, que mejora el día 13.También en el día siete, después del inicio del DSS, el daño histológico es significativamente mayor en los ratones tratados con DSS en comparación con los controles, como se refleja en la denudación epitelial, las ulceraciones de la mucosa y el aumento de la infiltración de neutrófilos, todos los cuales mejoran significativamente en el día 13. En estas imágenes representativas de una endoscopia de rutina, las heridas mucosas fueron inducidas mecánicamente por pinzas de biopsia en miniatura con una herida de un milímetro de diámetro. A continuación, se monitorizó la cicatrización mediante un examen endoscópico diario y se cuantificó mediante la medición del área residual de la herida con un software de edición de imágenes.El cierre del área de la herida individual a lo largo del tiempo se expresó mediante el cociente del área de la herida real por el área de la herida inicial. Por ejemplo, tres días después de la generación de la herida, se recuperó el 41% del área de la herida, mientras que a los siete días, la herida se curó por completo. Como es habitual, al final de un experimento, las heridas pueden ser resecadas para su evaluación histológica, X vivo como en estas imágenes representativas de lechos de heridas teñidos con hematina y ESN en el día cero y cinco, aproximadamente 80 días después de la inducción tumoral por como oximetano y tres ciclos de DSS múltiples tumores de colon, así como se pueden observar signos macroscópicos de inflamación crónica como mucosa granulada.La endoscopia endoscópicamente fluorescente del intestino neuronal sin la aplicación de un trazador, da como resultado una falta de detección de cualquier señal específica, y no se observan interacciones con el tejido colónico o la autofluorescencia fecal. Por el contrario, inmediatamente después de la aplicación intravenosa de Fitz Dextran, el fluorocromo puede observarse en la mucosa colónica y puede utilizarse para evaluar el aumento de la vascularización en regiones de inflamación crónica o mucosa maligna. En consecuencia, la cuantificación de la intensidad de fluorescencia se puede utilizar para medir el aumento significativo de la absorción del fluorocromo dentro del tejido maligno en comparación con la mucosa colónica no afectada.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco a 10 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe avanzar el endoscopio rígido con cuidado a través del colon marino. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo evaluar la cicatrización de heridas epiteliales, la inflamación intestinal y la agenesia del cáncer mientras realiza una colonoscopia marina.

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Investigación

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El íleo postoperatorio (POI) es una complicación de la cirugía abdominal que lleva a una mayor morbilidad y una estancia hospitalaria prolongada. Como las estrategias profilácticas o terapéuticas faltan intensificación de la investigación es necesaria. Por lo tanto, se estableció un modelo de ratón estandarizado y factible para investigar la fisiopatología de la PDI y estudiar posibles opciones terapéuticas.

Evaluación funcional de la motilidad intestinal y la inflamación de la pared intestinal en roedores: Análisis de un modelo estandarizado de manipulación intestinal

En los últimos años, los endoscopios de nueva generación se han convertido en importantes ayudas de investigación de diagnóstico para la evaluación de la colitis murina y tumores colorrectales. Se presenta en el presente documento un protocolo detallado para la evaluación endoscópica de la inflamación y tumores colorrectales en ratones, así como un sistema de puntuación novedoso que utiliza identificadores decimales para documentar la gravedad de la colitis endoscópica y tumores colorrectales.

La colonoscopia flexible en ratones para evaluar la gravedad de la colitis y colorrectal tumores utilizando un sistema validado de puntuación endoscópica

Mediante el uso de ratones reporteros transgénicos y marcadores fluorescentes inyectables, la microscopía confocal de disco giratorio intravital a largo plazo permite la visualización directa del comportamiento de las células mieloides en el adenoma intestinal en el modelo de cáncer colorrectal ApcMin/+.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica Apc Min / + Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Describimos métodos para la monitorización longitudinal de la eficacia de terapias para el tratamiento de patologías colónicas en ratones utilizando un endoscopio rígido. Este protocolo se puede utilizar fácilmente para la caracterización de la respuesta terapéutica de un tumor individual en ratones vivos y también para el seguimiento de una posible recaída de la enfermedad.

Evaluación no invasiva de la eficacia de nuevas terapias para Intestinal Patologías recurriendo a imágenes de Endoscópica serie de ratones vivos

Se describe el montaje y uso de un microendoscopio multimodal que puede co-registrar datos de imágenes de tejido superficial con parámetros fisiológicos tisulares incluyendo la concentración de hemoglobina, concentración de melanina y saturación de oxígeno. Esta técnica puede ser útil para evaluar la estructura y la perfusión del tejido, y puede optimizarse para las necesidades individuales del investigador.

Multimodal de imágenes y la Plataforma Microendoscopy Espectroscopia de fibra paquete para no invasiva,<em&gt; En Vivo</em&gt; Análisis de Tejidos

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Aquí, presentamos un protocolo para establecer puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeña lesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular y utilizando el peso intestinal pequeño, la profundidad de la cripta y la altura de las vellosidades como puntos finales.

Puntos finales importantes y marcadores proliferativos para evaluar lesiones intestinales pequeñas y adaptación utilizando un modelo de ratón de mucositis inducida por quimioterapia

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Aquí, proporcionamos una descripción detallada del procedimiento para inducir biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y el cierre de heridas de vía en tiempo real. Además, se proporcionan métodos para la preparación de tejidos para análisis histológicos, inmunohistoquímicos y moleculares del lecho de la herida.

Realización de biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y evaluación de cambios de tejido posteriores

Aquí, presentamos un método para obtener imágenes del intestino tras heridas inducidas por láser. Al exponer el intestino del ratón a un láser multifotónico, la pérdida de una o varias criptas se induce localmente. Al obtener imágenes repetidas del área dañada durante meses, se captura la dinámica en tiempo real de la recuperación intestinal.

Ablación láser y microscopía intravital para estudiar la remodelación intestinal

Aprende endoscopia murina para evaluar colitis, cicatrización de heridas y carcinogénesis en ratones mediante imágenes fluorescentes in vivo. Este método permite seguimiento serial y caracterización funcional de lesiones neoplásicas.

Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal (Video) | JoVE Journal

Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

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