Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células mononucleares cervicales de un raspado endocervical utilizando un cepillo citológico. Una vez aisladas, estas células se pueden utilizar en múltiples ensayos, incluida la citometría de flujo, en la que se puede determinar el fenotipo y la función de las células inmunitarias en el tracto genital femenino. La recolección de muestras de cepillado y lavado cervical es un procedimiento no invasivo que debe ser realizado por un ginecólogo o un médico capacitado.

Primero se realiza el lavado vaginal cervical, donde se lava el endocérvix con dos molinos de PBS, que luego se recoge del fórnix posterior después del lavado. El extremo cóncavo de un raspador cervical se coloca contra el cuello uterino y se gira para tomar muestras de la abertura cervical o del orificio cervical. A continuación, el cepillo citocervical se inserta en el OS endocervical y se gira 360 grados.

El uso de una presión suave ayudará a garantizar que la muestra no se contamine con sangre. El cepillo citocitológico en el raspador se recoge en un tubo que contiene cinco milésimas de pulgada de PBS. Después de ser transportada en hielo, la muestra se agita rápidamente para disociar las células del cepillo citocito.

Una vez que haya lavado las muestras con medios, se filtran a través de un filtro de nailon de cien micras. Esto permite la recolección de los linfocitos, monocitos y células epiteliales de la muestra. Las células ahora están listas para ser teñidas con anticuerpos contra las proteínas de superficie, y una vez que se han fijado, se pueden ejecutar en el citómetro de flujo.

Le mostraremos cómo analizamos los datos resultantes para evaluar el fenotipo de las poblaciones de células T CD cuatro y CD ocho presentes en el cuello uterino. Hola, soy estudiante de doctorado en el laboratorio del Dr. Keith folk. Nuestra investigación se centra en la relación entre la activación inmunitaria y la susceptibilidad al VIH, así como en la progresión de la enfermedad.

Debido a que la mayoría de las infecciones por el VIH ahora ocurren a través de relaciones heterosexuales, también estamos interesados en determinar los correlatos de la protección con la transmisión del VIH al tracto genital femenino. Desafortunadamente, la recolección de muestras del tracto genital puede ser muy desafiante y bastante invasiva para los participantes del estudio. El uso de cyto brushes para recolectar CMC o células mononucleares cervicales es un método más rápido y sencillo en comparación con otros protocolos como las biopsias.

En este vídeo, le mostraremos cómo aislar y preparar las CMC para su uso en citometría de flujo u otras aplicaciones posteriores. Después de la recolección, el cepillo y el raspador cyto se transportan en cinco milésimas de pulgada de PBS frío. Es importante transportar las muestras en hielo hasta el momento del procesamiento, que no debe ser más de dos horas después de la recolección de la muestra.

Cualquier muestra que esté contaminada con trazas de sangre en este momento debe excluirse de un análisis posterior para disociar las células del cepillo citocito. Agite el tubo en vórtice durante 45 segundos porque las células aún permanecerán en el cepillo y el raspador del citocito. Deben eliminarse manualmente.

Póngase un par de guantes nuevos y use el cepillo cyto para raspar cualquier material restante del raspador. Después de desecharlo en una solución de lejía, use el pulgar y el índice para eliminar todas las células restantes del cepillo citoeléctrico apretando hacia arriba y hacia abajo sobre el tubo de halcón. Después de desechar el cepillo cito, cámbiese los guantes antes de preparar otra muestra, use una pipeta de transferencia para lavar los lados del tubo con PBS asegurándose de que se recoja toda la muestra.

Se adapta a un nailon de cien micras. Filtre sobre un tubo Falcon nuevo y use la pipeta para filtrar todo el volumen de solución de PBS. Agregue cinco milésimas de pulgada de medio RPMI que carecen de FBS al tubo original.

Utilice la pipeta para lavar a fondo los lados del tubo con el fin de eliminar cualquier moco o residuo adherido. A continuación, transfiera los medios a través del filtro. Use algunos de los medios filtrados para lavar la parte inferior del filtro antes de desecharlo en lejía.

Para pellet las células aisladas. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 1500 r pm para evitar que el pellet se desprenda. Recuerde apagar el freno de la centrífuga si las celdas se van a utilizar para la citometría de flujo.

Prepare la solución de bloqueo necesaria para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos. Durante la etapa de centrifugación, utilice 100 microlitros de solución bloqueante por muestra. La solución de bloqueo contiene 93,2 microlitros de fax, lavado o PBS más un 2% de FBS, cinco microlitros de FBS y 1,8 microlitros de IgG de ratón.

Después del centrifugado, la mayoría de las muestras con células viables tendrán una bolita visible. En algunos casos, el pellet será bastante grande. Mientras que en otras muestras puede ser apenas visible.

El tamaño de los pellets no siempre está relacionado con el rendimiento de las celdas. Con cuidado, para inclinar el sobrenadante, asegurándose de no perturbar las células, vuelva a suspender el pellet mediante una agitación suave. Lave las celdas con cinco milésimas de pulgada de PBS y repita la centrifugación durante 10 minutos a 1500.

PVP M con la rotura apagada, una vez más, decantar el sobrenadante y resuspender el pellet como antes. En este punto, las células están listas para ser criopreservadas o teñidas en la superficie antes de la tinción Con anticuerpos fluorescentes, es beneficioso bloquear la unión inespecífica mediante la incubación de células con una solución de bloqueo preparada durante una centrifugación anterior. Después de volver a suspender el gránulo de celda, agregue cien microlitros de solución de bloqueo a la muestra y mezcle bien.

El resto de los pasos del protocolo se pueden realizar en una placa de 96 pocillos o en un tubo de fax. Dependiendo del tamaño del pellet CMC. Transfiera la solución de bloqueo y la mezcla de células a un tubo de fax.

Incubar la muestra durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Durante los 10 minutos de incubación, prepare el tinte de viabilidad que se utilizará para discriminar las células vivas y muertas. Durante el análisis de datos, prepare el tinte de viabilidad de acuerdo con el fabricante y prevalore según sea necesario.

Asegúrese de mantener la mezcla de tinte cubierta de la luz hasta que esté lista para usar. Después de la incubación de 10 minutos, lavar las células con 500 microlitros de fax, lavar o PBS con 2% de FBS, y luego centrifugar durante 10 minutos a 1600 RPM. Después de girar, decantar el sobrenadante del tubo de fax.

Vuelva a suspender las células por agitación. Ahora agregue el volumen adecuado del tinte de viabilidad que se preparó previamente. Incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, asegúrese de que las muestras permanezcan cubiertas de la luz envolviéndolas en papel de aluminio.

Durante esta incubación, puede preparar la mezcla maestra de anticuerpos fluorescentes que se utilizará para marcar las células. Asegúrese de prevalorar y validar sus anticuerpos en muestras de control de sangre periférica antes de utilizarlos en CMC. Mezcle los anticuerpos titulados y lleve a un volumen final de cien microlitros por muestra.

Con fax, lavado, proteja todos los anticuerpos de la luz durante estos pasos. Después de los 30 minutos de incubación, una vez más, lavar la muestra con 500 microlitros de fax, lavar, centrifugar, decantar y volver a suspender las células como antes. Ahora es el momento de incubar las células con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos preparado durante la incubación anterior.

Una vez más, incuba las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, asegurándote de que estén protegidas de la luz. Las CMC en incubación ya están listas para ser lavadas con 500 microlitros de PBS por última vez. Centrifugar la muestra a 1600 RPM durante 10 minutos.

Después de decantar y resus, suspender el pellet, diluir las células en un volumen final de 750 microlitros en una solución de paraldehído al 1%. Para solucionarlos, es importante resuspender las células en este gran volumen para evitar la obstrucción del citómetro de flujo. Incluso a este volumen, el tubo de muestra puede parecer bastante turbio.

Mantenga las células en la oscuridad a cuatro grados centígrados hasta que se adquieran en el citómetro de flujo. Además de la muestra de cepillo citocitométrico, recolectamos rutinariamente dos milésimas de pulgada de lavado de PBS del cuello uterino y la vagina. Esta muestra se centrifuga a 1400 RPM durante siete minutos para eliminar los restos celulares del lavado.

A continuación, el sobrenadante restante puede asignarse y congelarse a menos 80 grados centígrados para el análisis futuro de la concentración de proteínas solubles. Estos datos pueden ser particularmente útiles en combinación con los datos de fenotipo celular obtenidos por citometría de flujo. Antes de ejecutar el ejemplo de CMC.

Es útil preparar los controles PBMC para ayudar con los tubos de compensación de recorrido de compuerta, utilizando perlas o celdas de tinción única para ajustar la superposición espectral. Adquiera todo el tubo CMC para recolectar todos los eventos en comparación con las muestras de PBMC. Las CMC exhibirán más dobletes en una parcela de área FSC en comparación con la altura y es posible que no exhiban una población de linfocitos tan distintiva como pbmc.

Después de adquirir sus muestras, exporte los archivos para su análisis en un programa como FlowJo. Aquí mostraremos los componentes principales de una estrategia de activación típica para los linfocitos T CD cuatro positivos y CD ocho positivos derivados de CMC. Utilice un gráfico de área FSC frente a altura para G en los singletes de la muestra.

En esta comparación emparejada, se puede ver claramente el aumento del número de dobletes en una muestra de CMC en comparación con p BMC. A continuación, el trazado de un marcador fluorescente o FSC en función del tiempo sirve como paso de control de calidad. Si algún cambio en el caudal introdujo artefactos en los datos, se pueden eliminar en este paso.

En la parte superior, puede ver un perfil de fluorescencia consistente a lo largo del tiempo indicativo de una muestra de alta calidad. A continuación puede ver una muestra con múltiples interrupciones y caudal, que se pueden excluir de un análisis posterior. La identificación de la población de linfocitos en muestras de CMC puede ser un desafío.

El uso del control A-P-B-M-C ayudará con la colocación de la marcha. Como puede ver, algunas muestras exhiben grandes poblaciones claras, mientras que otras muestras carecen de poblaciones de linfocitos. En conjunto, estas muestras deben excluirse.

Aunque nos centraremos en las poblaciones de linfocitos. También es posible gon en monocitos mediante la activación de células que carecen de la expresión de marcadores de linaje. Es posible identificar células que expresan combinaciones de marcadores de células dendríticas y monocitos, como CD 16 y CD 11 C. La inclusión de un marcador de viabilidad o colorante es crucial para el análisis de CMC incluso en células frescas.

Como puede ver, la mayoría de los linfocitos CMC son viables, pero algunas muestras contienen altas frecuencias de células muertas que deben excluirse del análisis. Las células muertas pueden absorber de forma no específica el anticuerpo y confundir el análisis de datos dentro de la marcha de los linfocitos. La tinción de CD tres debe ser robusta.

La proporción de linfocitos T CD tres positivos es menor y más variable que en las muestras de PBMC, por lo que es crucial adquirir la muestra completa de CMC y maximizar el número de eventos recolectados. Las poblaciones de linfocitos T CD cuatro positivos y CD ocho positivos se pueden identificar igual que en las muestras de TBMC. En algunas muestras de CMC.

La proporción de CD cuatro a CD ocho es más baja que la observada en la sangre periférica y algunos individuos exhiben una gran población de células T doble negativas. Después de identificar las poblaciones de linfocitos T CD cuatro positivos y CD ocho positivos, es posible cuantificar la expresión de numerosos marcadores fenotípicos. Aunque la expresión de CD-1 61 puede detectarse en las CMC, la población brillante de CD-1-61 que es evidente en la sangre está ausente en el tracto genital.

Del mismo modo, la expresión de marcadores de activación como CD 69 y H-L-A-D-R, así como de marcadores como CCR cinco y PD uno pueden medirse y cuantificarse de forma fiable entre las muestras de CMC. El uso de muestras de citocepillo nos permite caracterizar tanto el fenotipo como la función de las células inmunitarias de la mucosa, especialmente en el contexto de enfermedades infecciosas. Esto no solo nos da una mayor comprensión de los mecanismos que regulan la inmunología de la mucosa y la reproducción y la reproducción, sino que también proporciona la base para el desarrollo de nuevas medidas de eficacia de la vacuna de la mucosa.