Name: Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Aprenda a aislar células mononucleares cervicales mediante citobrush y citometría de flujo para estudiar la inmunidad del tracto genital femenino. Este protocolo permite analizar fenotipo y función de linfocitos y monocitos de forma mínimamente invasiva.

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Los autores desean agradecer a Joshua Kimani, director clínico del programa de investigación de la Universidad de Nairobi, por su ayuda en los estudios de inmunología de la mucosa relacionados con este protocolo. Los autores desean agradecer la financiación de la subvención MOP 86721 del CHVI.

Declaración de Ética: La ética tableros de investigación, tanto de la Universidad de Manitoba y Kenyatta Nacional Hospital / Universidad de Nairobi aprobó este estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes en el estudio. 1. Preparación de Medios y CMC Collection Tubes <ol><li> Preparar tampón fosfato salino (PBS) (NaCl 137.93 mM, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoclave en la esterilidad. Esto se puede almacenar a 4 º C durante varios meses. </li><li> Pre-alícuota de 5 ml de PBS en 50 ml tubo Falcon (uno por cada muestra que se recogen) y se almacena a 4 º C hasta el momento de la recogida de muestras. </li><li> Etiquetar 2-4 crioviales o 1,5 ml tubos de microcentrífuga por muestra para recoger el lavado para su almacenamiento. </li><li> Preparar los medios de cultivo de células: RPMI 1640 + 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B (concentración final 100 unidades / ml, 100 mg / 250 ng / ml ml y, respectively, sin FCS / FBS agregó. </li></ol> 2. Toma de muestras citocepillo Recogida de muestras cytobrush es un procedimiento no invasivo que debe ser realizada por un médico o ginecólogo entrenado. <ol><li> Recoger las células mononucleares de cuello uterino (CMC) utilizando tanto un cytobrush y un raspador de madera o plástico. Recoger CMC del participante bajo examen con espéculo mediante la inserción del rascador y que gira alrededor del orificio cervical (Figura 1). Inserte el cytobrush en el sistema operativo endocervicales, girar 360 °, e inmediatamente colocar tanto el cytobrush y el raspador en el tubo Falcon de 50 ml que contiene 5 ml de PBS. </li><li> Mantener las muestras en hielo / a 4 º C hasta su procesamiento. Para mantener la viabilidad celular, muestras de proceso dentro de las 2 horas de la recogida. </li><li> Si es posible, recoger muestras de sangre coincidentes en la tapa verde de tubos vacutainer de heparina para células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de aislamiento para servir como un comparador / de control para el análisis de CMC. </li&gt; </ol> 3. Aislamiento de CMC Lleve a cabo el procesamiento de muestras en un laboratorio de bioseguridad de nivel 2, en un gabinete de bioseguridad estéril con guantes dobles. <ol><li> Durante la recolección, las muestras de CMC pueden contaminarse con sangre. Excluir las muestras con contaminación de la sangre visible desde el estudio con el fin de evitar la inclusión de confusión de PBMC en la muestra final. Debido al bajo número de linfocitos aislados de muestras de CMC, contaminación de la sangre menor de edad puede fácilmente abrumar el componente de linfocitos CMC. </li><li> Tubos Falcon Vortex que contienen tanto el cytobrush y rascador durante 45 segundos para disociar las células de los cepillos. Las muestras pueden ser espumosa durante este proceso; esto es normal. </li><li> Utilice la cytobrush para raspar cualquier material restante de la rasqueta, y desechar el rascador en una solución de cloro. Para recoger las células permanezcan unidas al cepillo / raspador, use un guante fresco para exprimir el rascador entre el pulgar y el índice.Deslízate por el pincel, permitiendo que las células y PBS que se recojan en el mismo tubo de 50 ml. Deseche el cytobrush en una solución de cloro, y deseche el guante. IMPORTANTE: Utilice un guante nuevo para cada muestra. </li><li> Montar un 100 m de células colador de nylon a un tubo Falcon de 50 ml fresco. Usando una pipeta de transferencia, recoger la suspensión de células de PBS desde el tubo de muestra y filtrado a través del filtro en el tubo fresco. </li><li> Añadir 5 ml de medio RPMI 1640 al tubo de muestra original. Utilizando la pipeta de transferencia, lavar los lados del tubo de muestra con el medio RPMI, y transferir a través del filtro para el nuevo tubo de recogida. Lavar la parte inferior del filtro de nylon con el medio RPMI así. </li><li> Centrifugar las muestras durante 10 min a 514 x g. Es crucial para salir de la freno de la centrífuga fuera durante este paso, con el fin de evitar el desplazamiento de la pastilla de CMC. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Tamaño de pellets será muy variable; en lome muestras, la pastilla es bastante grande debido a la presencia de grandes números de células epiteliales, mientras que en otros casos, el sedimento es apenas visible y altamente transparente. </li><li> Resuspender el precipitado por una ligera agitación del tubo Falcon. Añadir 5 ml de PBS para lavar la muestra. </li><li> Se centrifuga de nuevo durante 10 min a 514 xg sin freno de la centrífuga. </li><li> Elimine con cuidado el sobrenadante y volver a suspender el sedimento como anteriormente. Las células están listas, ya sea para la crioconservación (usando un protocolo de criopreservación de PBMC), la estimulación o la citometría de flujo fenotipificación. </li></ol> 4. CMC tinción de la superficie y Citometría de Flujo <ol><li> Resuspender el sedimento de la etapa 3.10 en 100 l de solución de bloqueo y transferir ya sea en una placa de 96 pocillos o un tubo de FACS. La solución de bloqueo (para bloquear los receptores Fc gamma) receta es la siguiente: IgG de ratón 1,8 l (concentración final 0,2 g / l), 5 l de FBS y 93,2 l de FACS de lavado (PBS 2% de FBS).La tinción se puede realizar en una placa de 96 pocillos si los tamaños de pellets son lo suficientemente pequeños, pero puede necesitar ser realizado en tubos de FACS si gránulos son rutinariamente grande. Es importante para titular anticuerpos en consecuencia. </li><li> Bloquee las muestras durante 10 minutos en hielo / a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 100 l de FACS de lavado (PBS 2% de FBS) en placas de 96 pocillos, o 500 l en tubos de FACS. Se centrifuga a 600 × g durante 10 min a 4 ° C con el freno de baja (o desactivar, si un nivel bajo de freno no está disponible). </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular por agitación. Añadir Stain viabilidad (Live colorante de viabilidad fixable Dead). Preparar colorante de viabilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es posible que haya que valora para su uso en cada configuración de laboratorio / citómetro. Incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar las células 100 μl/500 l de PBS (para tubos de placa / FACS de 96 pocillos). Se centrifuga a 600 × g durante 10 min con baja / no freno. Retire supernatant y se resuspenden las células. </li><li> Se incuban las células con el cóctel de anticuerpos de marcadores de superficie, en un volumen total de 100 l. IMPORTANTE: Optimizar y valorar cada una de citometría de flujo de la comisión antes de probar las manchas. Se incuban las células durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Repita el paso 4.5. si la tinción en una placa de 96 pocillos, las células de transferencia a un tubo de FACS y se diluye hasta un volumen final de 750 l de FACS de lavado que contiene 1% de paraformaldehído (PFA) (o CytoFix, se diluyó 1 en 4). Proceder a la adquisición de datos en un citómetro de flujo. </li></ol> 5. Recogida y preparación de Cervical Vaginal Lavado (CVL) <ol><li> Antes de citocepillo de muestreo, utilizar una jeringa para lavar la endocérvix con 2 ml de PBS estéril y aspirar el lavado del fórnix posterior. </li><li> Recoger la muestra de lavado aspirado en un tubo Falcon de 15 ml y mantener en hielo / a 4 º C hasta su procesamiento. </li><li> Centrifugar la muestra a 400 xg durante 7 minutos para eliminar los desechos celulares. </li><li> Collect el sobrenadante, alícuota de la muestra en 1 ml o 500 ml de alícuotas y se almacena a -70 ° C. Las alícuotas se pueden descongelar para ELISA o análisis de bolas de serie de proteínas CVL, pero evitar los ciclos de congelación / descongelación. </li><li> Si se desea, resuspender el sedimento de restos celulares en el ARN Más tarde para medir la expresión de ARN siguiendo el protocolo del fabricante. </li></ol> 6. Adquisición de Datos <ol><li> Prepare un conjunto de tubos de compensación que coincide con el panel de anticuerpos. Ejecutar los tubos de compensación para ajustar la superposición espectral. Ejecute las muestras de ningún flujo multicolor citómetro de que está configurado para los anticuerpos conjugados con fluorocromos utilizados en el panel. </li><li> Adquirir una muestra PBMC primero para ajustar la dispersión hacia adelante (FSC) y la dispersión lateral (SSC) de tensión a fin de detectar la población de linfocitos. Trate de mantenerlos a 100 en cada eje en una escala lineal. Ejecución de un control de PBMC hará que sea mucho más fácil para encontrar la población de linfocitos CMC. </li><li> El umbral de FSC para las muestras de CMC puede ser necesario un aumento con respecto a las muestras de PBMC debido a manchar el eje SSC a bajos valores de FSC. </li><li> Agite cada tubo antes de adquirir. Adquirir la totalidad del tubo para maximizar el número de eventos puerta de linfocitos recogidos. Vigilar la máquina con cuidado para evitar obstrucciones. </li><li> Exportar los datos a un programa de análisis de citometría de flujo tal como FlowJo. </li></ol> 7. Estrategia Gating <ol><li> Seleccione dispersión lateral delantero alto (FSC-H) / área de dispersión lateral frontal (FSC-A) para determinar la población singlete. </li><li> Seleccione Hora frente marcador fluorescente (como ejemplo FITC) para controlar por la calidad de la adquisición. Cambio en la tasa de flujo puede introducir artefactos en los datos. Excluir cualquier área que muestra la discrepancia en el caudal. </li><li> Identificar la población de linfocitos en SSC-A/FSC-A parcela. Utilice un control PBMC para facilitar la identificación. Tenga en cuenta que la población de linfocitos CMC podría no ser tan claro como el control de PBMC. &lt;/ Li&gt; <li> Puerta en SSC-A/viability tinte para excluir las células muertas de células vivas. Las células muertas pueden incorporar de forma no específica de los anticuerpos, que introducirá los artefactos. </li><li> Puerta en la SSC-A/CD3 para identificar la población de células T. Desde esta puerta, identificar las poblaciones CD4 + y CD8 +. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Dadas las grandes lagunas de conocimiento con respecto a la inmunidad en el tracto genital femenino (FGT), el análisis fenotípico de los CMC puede proporcionar una amplia gama de puntos de vista en varias poblaciones de linfocitos en el cuello uterino. Junto con el análisis proteómico y mediciones de carga viral en el lavado de cuello de útero, la inmunidad a las infecciones de transmisión sexual (ITS) s y otros patógenos puede ser diseccionado en varias poblaciones. Consideraciones ...

La mayoría de las nuevas infecciones por el VIH en todo el mundo surgen a través de la transmisión heterosexual, las mujeres representan el 47% de las nuevas infecciones en 2011 (ONUSIDA 1). Entender el tracto genital femenino (FGT), uno de los principales portales de entrada para el VIH y otros agentes patógenos de transmisión sexual, es de gran importancia en el camino hacia la búsqueda de estrategias eficaces para prevenir la infección. Las respuestas inmunes en la mucosa genital son claramente únicas y difieren de los medidos en la sangre periférica 2. Sin embargo, los conocimientos actuales de la dinámica del sistema inmune en el FGT se limita, en el mejor. Hasta la fecha, los estudios sobre el medio ambiente inmune de la mucosa se ​​han centrado en gran medida en los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), donde se ha convertido en claro que los primeros eventos en los tejidos de las mucosas después de la infección tienen un fuerte impacto en la progresión de la enfermedad posterior 3,4. Recogida de muestras de la mucosa genital representa un gran desafío y es al menos parcialmente responsable de la lack de comprensión de la inmunología de la FGT. Resolviendo el rompecabezas de la dinámica inmunitaria entre el huésped y el patógeno en el contexto del entorno distinto que es el FGT requiere métodos eficaces para la recogida y análisis de muestras de esta localidad. El FGT se divide en dos secciones: el tracto reproductivo superior que incluye las trompas de Falopio, endometrio y endocérvix, y el tracto inferior que contiene el exocérvix y la vagina (revisado por Kaushic et al 5). Aún no está claro lo que la contribución relativa de estos diferentes sitios es a la infección por el VIH, pero se cree que ambos sitios podrían contribuir a la entrada del VIH 6. Células T representan el 40-50% de los leucocitos en los tractos reproductivos superior e inferior, mientras que los macrófagos comprenden aproximadamente el 10% (revisado en Rodríguez-García et al 2). Las células T pueden ser detectados en la vagina, el cuello uterino, y endometrio. Los macrófagos son más fuertemente localizeta en el endometrio y el tejido conectivo del miometrio que el cuello del útero, a pesar de que se pueden detectar en ambos tejidos. Por último, las células dendríticas plasmacitoides (PDC) y células de Langerhans también pueden ser detectados en los tejidos de TGC. El fenotipo y proporciones de poblaciones inmunes y su susceptibilidad a la infección por el VIH pueden variar importante de acuerdo a los ciclos hormonales, el uso de anticonceptivos hormonales, la vaginosis bacteriana o actividades sexuales 5,7-9. Diversos métodos se han desarrollado para estudiar las poblaciones inmunes y el medio ambiente de la FGT. Biopsia cervical, cepillados cervicales y lavados cervicovaginales (CVL) 10-12 son los más utilizados en toda la literatura. Colección CVL por PBS lavado es el método más simple y permite el estudio de proteínas inmunomoduladoras, pero los resultados en rendimiento extremadamente bajo de células, y por lo tanto no es adecuado para el estudio de las poblaciones de células inmunes del TGC 13. Muestras CVL son, por otra parte, VEry útil para evaluar el entorno inmunológico del TGC mediante la medición de la expresión de diversas citoquinas, quimioquinas o factores antimicrobianos utilizando métodos tales como ELISA, de bolas de serie de citoquinas 14 o espectrometría de masas 15,16. Caracterización de las frecuencias de células inmunes, fenotipos y funciones se puede lograr mediante la recopilación de las células mononucleares de cuello uterino (CMC) por citocepillo cervical o mediante la toma de muestras de biopsia cervical. Toma de muestras de biopsia de cuello uterino es un método invasivo que aumenta el malestar y el riesgo de sangrado y tarda de 2 a 11 días en sanar después del procedimiento, dependiendo del estado inmunológico de la mujer 12. Por otro lado, cepillados cervicales, a pesar de la menor rendimiento de las células recogidas, es un método menos invasivo y más conveniente para recoger las células inmunes de la TGC. Ambos métodos pueden alcanzar el mismo rendimiento de leucocitos CD45 +, pero dos cepillados cervicales secuenciales son necesarias para obtener la misma cantidad de células contenidas in una biopsia 13. Sin embargo, el muestreo citocepillo todavía proporciona un número aceptable de células (células CD45 + sobre 5000 / citocepillo) para obtener más fenotipificación ex vivo mediante citometría de flujo 14. Además, la caracterización funcional puede llevarse a cabo en estas muestras, como se han realizado la estimulación y citometría de flujo intracelular o qPCR utilizando CMC cytobrush derivados para identificar respuestas inmunes específicas para el VIH 17 o polarización de las células Th. 18. La expansión de la población de células T también puede facilitar los estudios funcionales con CMC 19. Es importante tener en cuenta que las biopsias y cepillados muestrean porciones distintas de la TGC. Las biopsias se derivan de la parte superior del epitelio y el estroma del exocérvix 12,13, mientras cepillados cervicales muestrean del orificio cervical, la recolección de células derivadas del epitelio del endocérvix y, presumiblemente, la zona de transformación. Por lo tanto, las muestras citocepillo muestrean una reregión compone de una sola capa de epitelio cilíndrico, mientras que las biopsias, incluyen una región de la línea por un epitelio escamoso estratificado 5. Como resultado, la naturaleza de las poblaciones de leucocitos recogidos por biopsia cervical y citocepillo difiere. Las biopsias recogen una mayor proporción de células T CD3 +, mientras que cepillados resultan en la colección de una mayor proporción de monocitos CD14 + / macrófagos 13. El estudio de la inmunología de la FGT ha habido un interés por muchos años 20-22 y hemos acumulado una gran experiencia con el estudio de los CMC cytobrush derivados. Nuestros estudios se centran principalmente en el estudio de la infección por el VIH, no infectados y expuestos al VIH seronegativos (HESN) trabajadoras sexuales de Nairobi, Kenia. El VIH se replica preferentemente en células T activadas 23 e inferior del número de células activadas que pueden ser dirigidos por el VIH en el TGC podrían contribuir a la protección contra la adquisición del VIH. De acuerdo con esta hipótesis, varios studies han descrito la activación inmune más baja entre los trabajadores del sexo HESN que están altamente expuestos al VIH aún permanecen infectados 24,25 y este fenotipo quiescente se observa también en el TGC 14. Aquí se describe la metodología para la elaboración y evaluación de la activación de células T en muestras de CMC derivados de cepillados cervicales por ex vivo citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td>100 &mu; Filtro de células m para tubo Falcon de 50 ml</td><td>BD</td><td>352360</td><td>Procesamiento</td></tr><tr><td>CMC RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td>Procesamiento</td>de</tr><tr><td>CMC Suero fetal bovino</td><td>Tecnología Life 16000044</td><td></td><td>Procesamiento de CMC</td></tr><tr><td>Tecnología Fungizone</td><td>Life</td><td>15290-018</td><td>Procesamiento de</td></tr><tr><td>CMC Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ml Procesamiento de</td><td>CMC</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 ml</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td>Procesamiento CMC</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia desechable para banco de sangre</td><td>Fisher</td><td>13-711-6M</td><td>Procesamiento CMC</td></tr><tr><td>Cytobrush plus</td><td>Cooper surgical</td><td>C0121</td><td>Toma de muestras CMC</td></tr><tr><td>Raspador cervical desechable</td><td>Quick medical</td><td>2183</td><td>Toma de muestras CMC</td></tr><tr><td>15 ml Tubo Falcon</td><td>Fisher</td><td>14-959-70c</td><td>Procesamiento de CVL</td></tr><tr><td>tubo de 1,5 ml Eppendorf</td><td>Fisher</td><td>05-402-18</td><td>Almacenamiento</td></tr><tr><td>CVL VIVO/MUERTO Kit de tinción de células fijables</td><td>Invitrogen</td><td>Varios</td><td>Reactivo de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Tampón de fijación (4% PFA)</td><td>BD</td><td>554655</td><td>Citometría de flujo regeant</td></tr><tr><td>Ratón IgG</td><td>Sigma</td><td>I8765</td><td>Citometría de flujo regeant</td></tr></tbody></table>

colección, aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales humano

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

A pesar de la importancia para la salud pública de los patógenos de las mucosas (incluido el VIH), se sabe relativamente poco sobre la inmunidad de las mucosas, particularmente en el tracto genital femenino (FGT). Debido a que la transmisión heterosexual representa ahora el mecanismo dominante de transmisión del VIH, y dada la continua propagación de las infecciones de transmisión sexual (ITS), es fundamental comprender la interacción entre el huésped y el patógeno en la mucosa genital. Las lagunas sustanciales en el conocimiento sobre la inmunidad a la FGT se deben en parte a la dificultad de recolectar y procesar con éxito muestras de mucosa. Con el fin de facilitar estudios con un tamaño de muestra suficiente, las técnicas de recolección deben ser mínimamente invasivas y eficientes. Para ello, se ha optimizado un protocolo para la recogida de muestras de citocepillado cervical y posterior aislamiento de células mononucleares cervicales (CMC). Mediante el uso de inmunofenotipado ex vivo basado en citometría de flujo, es posible cuantificar de forma precisa y fiable las frecuencias y fenotipos de la población de linfocitos/monocitos CMC. Esta técnica puede combinarse con la recolección de lavado cérvico-vaginal (CVL), que contiene mediadores inmunes solubles que incluyen citocinas, quimiocinas y antiproteasas, todos los cuales se pueden usar para determinar el entorno antiinflamatorio o proinflamatorio en la vagina.

Citometría de flujo multiparamétrica es una herramienta poderosa para diseccionar los fenotipos y las funciones de los subconjuntos de células en los tejidos previamente sin caracterizar. Análisis de muestras de CMC puede dar información tanto de linfocitos y monocitos poblaciones con estrategias apropiadas de compuerta. Una estrategia de activación periódica CMC representante, en comparación con un perfil de PBMC emparejado, se muestra en la Figura 2. El FSC-A frente a FSC-...

El uso de la toma de muestras por citocepillo para recolectar linfocitos y monocitos del endocérvix es una técnica mínimamente invasiva que proporciona muestras para el análisis de la inmunidad del tracto genital femenino. En este protocolo, describimos la recolección de muestras de citocepillo y el aislamiento de células inmunitarias para ensayos de citometría de flujo.

Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células mononucleares cervicales de un raspado endocervical utilizando un cepillo citológico. Una vez aisladas, estas células se pueden utilizar en múltiples ensayos, incluida la citometría de flujo, en la que se puede determinar el fenotipo y la función de las células inmunitarias en el tracto genital femenino. La recolección de muestras de cepillado y lavado cervical es un procedimiento no invasivo que debe ser realizado por un ginecólogo o un médico capacitado.Primero se realiza el lavado vaginal cervical, donde se lava el endocérvix con dos molinos de PBS, que luego se recoge del fórnix posterior después del lavado. El extremo cóncavo de un raspador cervical se coloca contra el cuello uterino y se gira para tomar muestras de la abertura cervical o del orificio cervical. A continuación, el cepillo citocervical se inserta en el OS endocervical y se gira 360 grados.El uso de una presión suave ayudará a garantizar que la muestra no se contamine con sangre. El cepillo citocitológico en el raspador se recoge en un tubo que contiene cinco milésimas de pulgada de PBS. Después de ser transportada en hielo, la muestra se agita rápid

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Investigación

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Describimos aquí un método de aislamiento para obtener linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos para el análisis de células T gamma delta intraepiteliales. Este protocolo puede ampliarse para la purificación de las células T gamma delta endocervicales mediante perlas magnéticas o mediante clasificación de células.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

Las células endoteliales tumorales son determinantes importantes del microambiente tumoral y el curso de la enfermedad. Aquí, se describe un protocolo para el aislamiento de las células endoteliales puras y viables de carcinoma colorrectal humano y colon normal para ser utilizado en la investigación de drogas pruebas y patogenesia.

Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Aquí presentamos un protocolo para la caracterización de subconjuntos de monocitos por citometría de flujo de sangre. Esto incluye delineando cómo los subconjuntos de la puerta y evaluar su expresión de marcadores de superficie y dando un ejemplo de la evaluación de la expresión de marcadores de M2 (antiinflamatorio) y M1 (inflamatoria).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Los lunares hidatidiformes son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas que se pueden clasificar según sus características morfológicas y la contribución parental a los genomas molares. Aquí, los protocolos de genotipado de ADN microsatélite multiplex y citometría de flujo de tejidos molares de parafina incrustados fijados por formalina se describen en detalle, junto con la interpretación e integración de los resultados.

Genotipado de ADN microsatélite y análisis de ploidía de citometría de flujo de tejidos molares de parafina incorporados en parafina-involuntaria-incrustadas

Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.

Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

El presente protocolo proporciona una solución práctica que permite medir la apoptosis, el potencial de membrana mitocondrial y el daño al ADN en espermatozoides humanos con un solo citómetro.

Análisis citométrico de flujo de biomarcadores para la detección de defectos funcionales en espermatozoides humanos

Este documento describe la aplicación de equipos automatizados para separar y recolectar sustancias de manera fácil y eficiente, como ADN libre de células y células tumorales circulantes, de sangre total.

Separación y recolección automáticas de sustancias relacionadas con el cáncer a partir de muestras clínicas

Este protocolo describe un método de un día para el aislamiento de células epiteliales de trompas de Falopio humanas. Las células epiteliales aisladas se pueden sembrar en cultivo bidimensional (2D) o disociarse en suspensiones unicelulares y utilizarse en experimentos posteriores, incluida la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular.

Un método eficiente para extraer epitelios de trompas de Falopio humanas para análisis de células individuales

Aprenda a aislar células mononucleares cervicales mediante citobrush y citometría de flujo para estudiar la inmunidad del tracto genital femenino. Este protocolo permite analizar fenotipo y función de linfocitos y monocitos de forma mínimamente invasiva.

Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

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