Name: Un alto contenido de imágenes de Ensayo para la Identificación de la neurotoxina botulínica Inhibidores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo de cribado fenotípico con imágenes de alto contenido en neuronas motoras de ratón para identificar moléculas pequeñas que inhiban la neurotoxina botulínica. Este método permite detectar compuestos que restauran la liberación de neurotransmisores.

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La financiación fue proporcionada por la Oficina Conjunta de Ciencia y Tecnología - Defensa Química Biológica (JSTO-CBD), la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA) bajo el número de proyecto patrocinador CCAR# CB3675 y los Institutos Nacionales de Salud (1 R21 AI101387-01 y 5 U01AI082051-05).

Placa 20000 diferenciado células ES de ratón (MES) / pocillo en placas de 96 una lisina recubiertos con poli-D así y mantener en la neurona motora medios diferenciación terminal durante 5-7 días. Administración 1. El compuesto y la intoxicación con BoNT / A Lleve a cabo todos los trabajos siguientes en un recinto BSL2 para mantener el cumplimiento con las pautas de los CDC / NIH. <ol><li> Preparar soluciones madre 10 mM de cada compuesto de la biblioteca en 100% de DMSO en placas de 96 pocillos de polipropileno. Utilice el stock de 10 mM para preparar una placa de dilución intermedia que es 10 veces mayor que la concentración de detección deseado. Preparar 100 uM placa intermedia mediante la supresión de stock 10 mM en placa de 96 pocillos y se diluye a 100 uM usando medios de cultivo. Dispensar 10 l de los compuestos sobre a 90 l de los medios de comunicación sobre las células 11. Prueba de los compuestos a 10 uM concentración final y asegurar el porcentaje final de DMSO no sea superior al 0,5%. </li><li> Realizar todos espárragos que utilizan células vivas y toxina activa bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones. Reemplazar los viejos medios de comunicación en las placas de 96 pocillos con 80 l de los medios de comunicación fresca diferenciación terminal utilizando una pipeta manual de 12 canales. Llevar a cabo la aspiración y dispensar pasos por filas para evitar la exposición de las células sin medios de comunicación para el aire ambiente. </li><li> Pretratar las células con compuestos antes de la aplicación de la toxina mediante la adición de 10 l de 10x compuestos a partir de la placa de fuente utilizando una pipeta de 12 canales, seguido de mezclado por aspiración (dos veces). Para cada placa de 96 pocillos, tratar dos columnas de 6 pozos con 10x DMSO diluido en los medios de comunicación para servir como señal alta y los controles de señal bajos. La columna sin tratamiento BoNT exhibe el nivel más alto de la longitud completa SNAP-25 (control alto de la señal). Tratar la otra columna con BoNT solo (sin ningún compuesto) como el control de señal baja. Utilice baja de control para observar la eficacia de escisión de BoNT SNAP-25 y su detección con el anticuerpo BACS (Figura 2). </li><li> Se incuban las células con los compuestos durante 30 min a 37 ° C y 6% de CO 2 en la incubadora de cultivo celular. </li><li> Preparar neurotoxina botulínica A partir de un 1 mg / fuente comercial ml en tampón fosfato salino (PBS) a una final 10x madre de trabajo diluyendo con medios diferenciación terminal. </li><li> Iniciar la intoxicación mediante la adición de 10 l de 10x BoNT / A de stock en los pocillos designados para los controles de tratamiento y baja señal usando una pipeta multicanal (Figura 2). Tratar a los pocillos designados como alto control con medio solo. </li><li> Descontaminar todos los artículos de plástico y otros materiales desechables que entra en contacto con BoNT / A durante el estudio por inmersión en solución de hipoclorito de 0,825% en agua durante al menos 20 min. Lleve a cabo todos los procedimientos en los gabinetes de seguridad biológica y descontaminar las áreas de trabajo, tanto antes como después de los experimentos con 5% de detergente limpiador desinfectante como solución MicroChem. </li><li> Etiquetar las placas claramente para indicar el uso de la toxina y incubcomieron placas tratadas con 1 nM / L de BoNT / A durante 4 horas a 37 ° C y 6% de CO2 en un incubador de cultivo celular. Pantalla de señalización apropiado para informar a los colegas que la toxina está en uso en el laboratorio. </li><li> Detener BoNT / A escisión proteolítica por la fijación de metanol. Retire los medios de comunicación que contienen toxinas y compuestos de cada pocillo con una pipeta multicanal y desechar en una solución de lejía al 10%. Añadir metanol enfriado con hielo (100 l) directamente a cada pocillo. </li><li> Incubar las placas durante 15 min a temperatura ambiente (RT) para permitir que se produzca la fijación. </li><li> Después de la fijación, manejar de forma segura los reactivos desechados (considerado neutralizados) con protocolos de nivel de bioseguridad 1 y descartar en consecuencia. </li><li> Descartar metanol y el uso de 100 l de PBS para lavar las células y rehidratar ellos antes de la inmunotinción. Realizar dos lavados con PBS adicionales. </li><li> Después del lavado final, deje de PBS en los pozos, placas de sellado con película adhesiva de microplacas y se almacena a 4 ° C hasta su análisis. Placas se almacenan a 4 ° C for varios días. </li></ol> 2. La inmunotinción El procedimiento de inmunotinción es una operación de múltiples pasos de trabajo intensivo que incluye ciclos de dosificación de reactivos / aspirado repetitivas y extensa de lavado de placas que pueden conducir a la posible introducción de una variabilidad significativa intraplaca y Interplate. Un enfoque semi-automatizado se aplica para ahorrar el tiempo del personal de laboratorio, aumentar el rendimiento del ensayo, y minimizar la variabilidad inmunotinción. <ol><li> Utilice una estación de trabajo automatizada equipada con un cabezal de 96 pocillos capaz de transferir volúmenes de hasta 250 l e integrado con un brazo robótico de agarre para mover el material de laboratorio en diferentes lugares de la cubierta modular (ver Material y Equipo) para este protocolo. <ol><li> La cubierta modular está diseñado para acoger diferentes tipos de material de laboratorio y puede soportar hasta 11 artículos en un momento dado. El manejador de microplacas automatizado está equipado con un cargador de doble apilador de microplacas con el fin de sostener ymanipular hasta 50 placas por ciclo. </li><li> La estación de trabajo automatizada se encuentra en el interior de una cabina de bioseguridad de Clase II diseñado para equipos de automatización de laboratorio para asegurar la esterilidad y seguridad. Para la inmunotinción automatizada, la cubierta está dispuesto como se muestra en la Figura 3 para permitir el acceso del reactivo según sea necesario y sin intervención humana. </li></ol></li><li> Placas pre-carga que contienen células fijadas en la revista placa y la transferencia a la cubierta, según sea necesario para las operaciones de manejo de líquidos. Use la cabeza 96 de la pipeta provista de 250 consejos para aspirar mu l de PBS a partir de los pozos de hasta 10 l. Permeabilizar las membranas celulares para facilitar la unión del anticuerpo a dianas intracelulares con tampón de permeabilización (0,1% Triton X-100). Dispensar tampón de permeabilización (100 l) en cada pocillo antes de regresar las placas a la segunda cargador de almacenamiento del apilador de microplacas para una incubación de 15 min a temperatura ambiente (RT). </li><li> Retire permeabilización de amortiguación y PElavado de placas rforma con PBS (dos veces), como se describe anteriormente en el paso 1.13. </li><li> Después de la última etapa de lavado, eliminar el tampón PBS y dispensar 100 l de tampón de bloqueo que contenía 1% de suero de caballo y 0,1% de Tween 20 en PBS en todo microplacas antes de devolverlos a la revista placa durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente. </li><li> Use dos anticuerpos primarios para la inmunotinción: un anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón de anticuerpos BACS, para la detección de longitud completa SNAP-25 monoclonal de ratón y un anti-III tubulina de anticuerpos para la detección de las neuronas (ver Material y Equipo). Después de 60 min de incubación, retirar el tampón de bloqueo y dispensar 50 l de 4UG / ml de anticuerpo BACS y 0,5 mg / ml de III-tubulina en tampón de bloqueo en todas las placas. </li><li> Incubar durante 1 hora a RT a eliminar los anticuerpos primarios y lavar 3 veces con 100 l de PBS que contenía 0,05% de Tween (PBST). </li><li> Utilice una IgG anti-ratón marcado con Alexa Fluor 647 para visualizar el -III tubulina y anti-IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 568 para visualizar el anticuerpo BACS. Preparar ambos anticuerpos como una dilución / ml 2 g en tampón de bloqueo y dispensar 50 l de la mezcla en cada pocillo. NOTA: Los anticuerpos secundarios seleccionados para la inmunotinción se etiquetan con diferentes fluoróforos para permitir la detección de la luz fluorescente emitida en longitudes de onda distintas que utilizan diferentes canales dentro del detector del Alto Imager contenido. </li><li> Incubar durante 1 hora a RT. Aspirar los anticuerpos secundarios y lavar 3 veces con 100 l de PBST. </li><li> Después del lavado final, añadir 100 l de PBS que contiene el colorante Hoechst (32 mM) para teñir el ADN para la detección de los núcleos. </li><li> Sellar las placas con una película impermeable ligera para proteger los fluoróforos de photobleaching. Las placas pueden almacenarse a 4 &#160; ° C durante semanas sin pérdida significativa de la señal. </li></ol> 3. Imaging NOTA: Lleve a cabo la adquisición de imágenes usando contenido de alta Imaging System (Ver Materiales y Equipo). <ol><li> Especificación de alto contenido Imager Definiciones: <ol><li> Seleccione el tipo de placa, diseño, número de campos, objetivo: Greiner u claro, formato de 96 pocillos, 16, 20X agua respectivamente. </li><li> Seleccione los canales: núcleo de excitación EX: 405 nm como el canal 4; citoplasma EX: 644 nm como el canal 2; antígeno específico EX canal anticuerpo: 561 nm como el canal 3 y Configurar potencia de excitación de cada láser, experimento Configuración como dos exposiciones, exposición 1 con una excitación a 644 nm, la exposición 2 con dos excitaciones a 405 nm y 561 nm. Seleccione hurgar en la basura como BIN2. </li><li> Utilice los pocillos de control de alta para la optimización de la exposición con la máxima intensidad como canal de SNAP-25 y bajo control de los pozos de intensidad mínima. </li><li> Ajuste la exposición, de modo que la intensidad de cada canal es aproximadamente la mitad del nivel de saturación (2.000-2.500 unidades relativas). </li><li> Identificar el plano Z óptima en el canal máscara celular utilizando delta script de corrección. Ver Figura 5 para resultados después de inmunotinción y de imagen. Exportar datos al servidor donde el software de análisis de imágenes está residiendo. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de Imágenes (Figura 6) NOTA: Los siguientes pasos describen la aplicación de los algoritmos de software Columbus. <ol><li> Seleccione un algoritmo apropiado para segmentar los objetos primarios (núcleos). Si es necesario, ajustar el umbral de fondo y los parámetros de contraste. El software de Colón proporciona 4 métodos de detección de los núcleos. Seleccione el método que los núcleos de segmentos con precisión mediante la inspección visual de los núcleos segmentados (en F igura método 6a M se selecciona). </li><li> Seleccione el algoritmo de neuritas (CSIRO neuritas Análisis 2) al segmento de las neuritas Si es necesario, ajustar los parámetros de umbral y contraste de fondo para eliminar el fondo. Véase la figura 6b para los parámetros utilizados para detectar las neuritas. </li><li> Identificar las regiones neuritas (segmentos) neuritas based en los objetos secundarios (neuritas) utilizando una expansión pixel -3 del canal de tubulina β-III (Alexa Harina 640) como máscara (Figura 6c). </li><li> Calcular la intensidad de los canales de señal (SNAP-25, (Alexa Harina 568) para la región de las neuritas y el canal de la tubulina β-III (Figura 6d y 6e). </li><li> Seleccione los parámetros deseados para la exportación, tales como la longitud de las neuritas, las intensidades medias de SNAP-25, β-tubulina III, número de núcleos, número de segmento de neuritas, etc. (Figura 6f). </li><li> Placas de transferencia de apiladores de placas utilizando el robot y la carga en el Alto de imágenes de contenido para la adquisición de imágenes. </li></ol> 5. Análisis de Datos: Para evaluar la robustez del ensayo diseñado, calcular los siguientes parámetros del experimento basado en la placa. <ol><li> La señal (S) a fondo (B): S / B = intensidad de la señal de control de alta media) / intensidad media de un buen control de la señal </li> &lt;li&gt; Coeficiente de Variación (CV) de la señal y el fondo (para medir la uniformidad de la señal específica): CV = (desviación estándar (SD) / media de la muestra) * 100 (%), para determinar la variabilidad en el manejo de líquidos, reactivos, etc. </li><li> Señal a ruido: S = (intensidad de la señal significa - intensidad media de un buen control de la señal) / SD de control de baja <ol><li> Calcular el factor de la Z &#39;con la intoxicación de una mitad de una placa de 96 pocillos y un simulacro de la intoxicación de la otra mitad. Z &#39;= 1 - 3 * (SD de alta control de señal + SD de bajo control de la señal) / (media de alto control de la señal - media de un buen control de la señal). Para el análisis posterior de los datos de cribado, normalizar algunos de los parámetros primas primarias sobre una base placa para permitir la comparación entre las placas y entre los diferentes días de experimentos. </li></ol></li><li> Porcentaje de escisión, lo que refleja la reducción de la señal asociada con la longitud completa SNAP-25 detectado por el anticuerpo específico (BACS): Cleavage% = 100% * (mean intensidad de la señal de control de alto - intensidad de la muestra) la intensidad de la señal de control de alta / media. </li><li> Porcentaje de inhibición de la escisión:% de inhibición = 100% * (intensidad de la muestra - significa la intensidad de un buen control de la señal) / (intensidad de la señal de control de alta significar - intensidad de un buen control de la señal de media). </li></ol>

<ol><li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+most+poisonous+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li>
<li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li>
<li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+ground%3A+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li>
<li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li>
<li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li>
<li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+Research%22%5BJournal%5D)">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets%3A+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain%2C+P.+falciparum+malaria%2C+and+the+Ebola+filovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+2%2C5-bis%284-amidinophenyl%29thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li>
<li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+targeting%2C+internalization%2C+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li>
<li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel%2C+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li>
</ol>

Krishna P Kota es un empleado de Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, que produce instrumentos y software utilizados en este manuscrito. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., el Departamento de Defensa de los EE. UU., el Departamento del Ejército de los EE. UU. o las instituciones y empresas afiliadas a los autores.

La alta potencia de las neurotoxinas botulínicas y la relativa facilidad de su militarización ha dado lugar a su clasificación en la categoría A (la más alta prioridad) agentes biothreat por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Desafortunadamente, no existen terapias aprobadas por la FDA para contrarrestar BoNT después de la intoxicación por toxina ha sido interiorizado por las neuronas motoras. Cualquier mecanismo druggable que promueve la recuperación neuronal de BoNT intoxicación podría conduc...

La bacteria Clostridium botulinum produce la neurotoxina botulínica, una de las toxinas biológicas más potentes conocidos por el hombre 1. Hay 7 diferentes serotipos de BoNT (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induce parálisis en la unión neuromuscular debido a la proteolisis complejo SNARE 2,3. SNARE proteolisis evita neurotransmisor-vesícula de la membrana de fusión y por lo tanto bloquea la exocitosis de neurotransmisores 4. El objetivo SNARE específica depende del serotipo particular, BoNT involucrado en el proceso de intoxicación. BoNT / A y BoNT / E escinden SNAP-25 mientras que escinde BoNT / C ambos SNAP-25 y sintaxina 5. El sinaptobrevina cleave restantes serotipos (también llamada asociada a vesículas de proteína de membrana (VAMP). BoNT / A fue elegido para el desarrollo del ensayo, ya que es responsable de una alta proporción de botulismo de origen natural y tiene la duración más larga de acción 6. Desarrollo de molécula pequeña la terapéutica contra la BoNT / A es una meta importante paranuestro programa de descubrimiento de fármacos y ha utilizado métodos por objetivos tradicionales para identificar inhibidores proteolíticas sitio activo hace 7, 8-10. Sin embargo, la creación de los inhibidores del sitio activo con actividad de amplio espectro contra múltiples serotipos y eficacia después de la exposición es probable que sea un reto. Por ello, hemos implementado un enfoque innovador, fenotípica descubrimiento de fármacos que utiliza BoNT SNAP-25 de la escisión como un criterio de valoración funcional para identificar pequeñas moléculas que pueden bloquear mediada por BoNT intoxicación de las neuronas motoras. SNAP-25 se requiere para la liberación de neurotransmisores, como la degradación de la SNAP-25 es predictivo de la parálisis y la letalidad in vivo. Por ejemplo, el cribado basado en células podría conducir al descubrimiento de nuevos moduladores de factores celulares responsables de la inactivación de la toxina o la inhibición de las vías de la toxina en el interior de las células diana. Un factor importante en el desarrollo del ensayo fenotípico es la selección de los modelos biológicos fisiológicamente relevantes. WE y otros han descrito madre embrionarias de ratón (ES) neuronas motoras derivadas de células que recapitular el carácter inmunológico de las neuronas motoras primarias, incluyendo la expresión de SNAP-25 11- 13. Es importante destacar que estos sistemas celulares son muy sensibles a BoNT / A intoxicación y demuestran la escisión dependiente de la dosis de la SNAP-25 en respuesta a concentraciones crecientes de toxina 11,12. Las neuronas motoras diferenciados también se producen en cantidades que son suficientes para el análisis basado en la placa de alto rendimiento y permitieron el diseño de una serie de ensayos celulares. El ensayo fenotípico es un método de inmunofluorescencia utilizando dos anticuerpos diferentes para cuantificar la escisión de longitud completa expresado de forma endógena SNAP-25 durante la BoNT / A intoxicación de la cultura de ratón de la neurona motora. Un terminal carboxilo de BoNT / A (BACS) de anticuerpos de escisión sensible que reconoce sólo de longitud completa SNAP-25 permite la evaluación de la BoNT / A proteolisis mediada de SNAP-25expresión en las neuronas del motor del ratón 10. Un diagrama esquemático del ensayo de HCI se representa en la Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Neurotoxina botulínica A&nbsp;</td><td>Metabiológicos</td><td>NA</td><td>Sin número de catálogo</td></tr><tr><td>Placas de microtitulación</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>Placas de poli-D-lisina de 96 pocillos</td></tr><tr><td>BACs anticuerpo</td><td>Lampire Biological</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National&nbsp;</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT Mini estación de trabajo automatizada</td><td>Perkin Elmer</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII anticuerpo de tubulina</td><td>R& D Systems</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Antiratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Anti conejo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Software de análisis de imágenes</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Lejía Clorox</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>Pila de placas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un alto contenido de imágenes de ensayo para la identificación de la neurotoxina botulínica inhibidores

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

La proteína-25 asociada al sinaptosómico (SNAP-25) es un componente del complejo soluble del receptor de proteína de unión NSF (SNARE) que es esencial para la liberación de neurotransmisores sinápticos. La neurotoxina botulínica serotipo A (BoNT/A) es una metaloproteasa de zinc que bloquea la exocitosis del neurotransmisor mediante la escisión del componente SNAP-25 del complejo SNARE. Actualmente no existen medicamentos autorizados para tratar la intoxicación por NTBo/A después de la internalización de la toxina por las neuronas motoras. El desarrollo de medidas terapéuticas eficaces para contrarrestar la intoxicación por NTBo/A ha sido limitado, debido en parte a la falta de ensayos sólidos de alto rendimiento para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas. En este trabajo describimos un ensayo de imagen de alto contenido (HCI) útil para la identificación de inhibidores de la NTBo/A. Los esfuerzos iniciales de optimización se centraron en mejorar la reproducibilidad de los resultados entre placas en múltiples experimentos independientes. Se descubrió que la automatización de la inmunotinción, la adquisición y el análisis de imágenes aumentaba la consistencia del ensayo y minimizaba la variabilidad, al tiempo que permitía la evaluación multiparamétrica de compuestos experimentales en un sistema de neuronas motoras murinas.

Los datos de los controles alto y bajo crearon dos poblaciones distintas con la diferencia de dos medianas superiores a 3 desviaciones estándar (Figura 7A). El objetivo del proceso de selección es encontrar los compuestos dentro de la población de la muestra con los valores más cercanos a la población control positivo, suponiendo una distribución normal dentro de la población de la muestra (Figura 7B, (i)). Los puntos de datos que están más allá de 3 desviaciones estándar de la media se...

La neurotoxina botulínica es una de las toxinas más potentes entre los agentes de bioamenaza de categoría A, sin embargo, no se dispone de una terapéutica posterior a la exposición. El enfoque de imágenes de alto contenido es una metodología poderosa para identificar nuevos inhibidores, ya que permite el cribado multiparamétrico utilizando neuronas motoras biológicamente relevantes, el objetivo principal de esta toxina.

Un alto contenido de imágenes de Ensayo para la Identificación de la neurotoxina botulínica Inhibidores

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un ensayo de cribado fenotípico que medie la escisión de su sustrato SNAP 25 con el fin de identificar pequeñas moléculas que inhiben la función de la toxina durante la señalización nerviosa normal. El potencial de acción hace que SNAP 25 se una a la vesícula sináptica a la membrana plasmática de la terminal de la neurona motora, lo que resulta en la liberación de neurotransmisor. Sin embargo, cuando la neurotoxina botulínica está presente, es absorbida por endocitosis y liberada en la butona sináptica, donde escinde SNAP 25 y, por lo tanto, interfiere con la liberación de neurotransmisor causando parálisis.Este ensayo identifica moléculas que pueden inhibir la actividad de la toxina botulínica y, por lo tanto, prevenir la escisión de SNAP 25 en presencia de toxina botulínica y, por lo tanto, restaurar la liberación de neurotransmisores en la unión neuromuscular. Se utiliza un ensayo de imagen de alto contenido realizado con neuronas motoras de ratón para demostrar la preservación de SNAP 25, lo que resulta en la identificación de moléculas pequeñas que pueden inhibir la actividad metaloproteasa de la neurotoxina botulínica. La principal ventaja de esta tecnología o de los métodos existentes, como el ensayo bioquímico libre de células, es que se pueden capturar simultáneamente múltiples puntos finales fenotípicos de un solo pocillo que contiene neuronas motoras tratadas con compuestos de detección y toxinas.Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave que se encuentran durante el cribado en bibliotecas, como la cuantificación de la actividad celular y la citotoxicidad. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para la intoxicación botulínica, ya que puede identificar inhibidores que actúan directamente bloqueando su actividad de proteasa metálica o indirectamente a través de la prevención del procesamiento de la absorción de toxinas, o posiblemente otros mecanismos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la optimización de las condiciones de inmunotinción necesarias para la detección de SNAP 25 puede ser un desafío.La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de inmunotinción es difícil de perfeccionar ya que los motores alrededor de sí mismos son bastante delicados. Los pasos de reposo y lavado son la clave para desarrollar las imágenes de alta calidad necesarias para el análisis posterior. Todos los estudios que utilizan células vivas y toxinas activas se realizan bajo condiciones de nivel de bioseguridad dos, descontaminar las áreas de trabajo antes y después de estos experimentos con un limpiador desinfectante detergente al 5%, como una solución micro química.Después de diferenciar las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras como se describe en el protocolo de texto, utilice una pipeta manual de 12 canales para reemplazar el medio anterior. En las placas de 96 pocillos con 80 microlitros de medios de diferenciación terminales frescos, se llevan a cabo los pasos de aspiración y dispensación fila por fila para minimizar la exposición de las células al aire ambiente. A continuación, con una pipeta de 12 canales, añada 10 microlitros de 10 x de los compuestos de prueba de la placa de origen y, a continuación, aspire dos veces para mezclar x.Trate dos columnas de seis pozos con 10 X-D-M-S-O diluido en el medio para que sirvan como controles de señal alta y señal baja. Incubar las células con los compuestos durante 30 minutos a siete grados centígrados y 6% de dióxido de carbono. A continuación, diluir la neurotoxina botulínica A en PBS con medios de diferenciación terminal para obtener un material de trabajo final de 10 X utilizando una pipeta multicanal, añadir 10 microlitros de 10 x neurotoxina botulínica a los pocillos designados para el tratamiento y también a los pocillos de control de baja señal.Tratar los pozos designados como de alto control solo con medios, descontaminar todos los desechos de plástico y otros desechables que entren en contacto con la neurotoxina botulínica. A por inmersión en una solución de hipoclorito al 0,825% en agua durante al menos 20 minutos. Etiquete las placas claramente para indicar el uso de toxinas e incube las placas durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 6% de dióxido de carbono después de la incubación.Utilice una pipeta multicanal para eliminar los medios que contienen la toxina y los compuestos de cada pocillo y deséchelos en una solución de lejía al 10%. Luego agregue 100 microlitros de metanol helado directamente a cada pocillo para detener la neurotoxina botulínica. Un clivaje proteolítico.A continuación, incube las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir que se produzca la fijación. Después de la fijación, manipule los reactivos neutralizados desechados con protocolos de bioseguridad de nivel uno y deséchelos en consecuencia. Después de desechar el metanol, lave las células tres veces con 100 microlitros de PBS para rehidratarlas antes de la inmunotinción.La tinción inmunológica realizada en una cabina de bioseguridad de clase dos se realiza utilizando una estación de trabajo automatizada dispuesta para permitir el acceso al reactivo según sea necesario y sin intervención humana. Cargue las placas que contienen las celdas fijas en el almacén PLATE y transfiéralas a la plataforma según sea necesario para las operaciones de manejo de líquidos. Utilizando el cabezal de pipeta 96 equipado con puntas de 250 microlitros, la estación de trabajo aspira PBS desde los pocillos hasta 10 microlitros.La estación de trabajo dispensa 100 microlitros de tampón de bloqueo que contiene 1% de suero de caballo y 0,1% 20% de PBS en todas las microplacas. A continuación, regrese las placas al almacén de placas para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo y dispense 50 microlitros de cuatro microgramos por mililitro de anticuerpo BS y 0,5 microgramos por mililitro de beta tres tubulina en tampón de bloqueo en todas las placas.Incubar las placas durante una hora a temperatura ambiente y luego eliminar los anticuerpos primarios y lavar tres veces con 100 microlitros de PBST. Prepare diluciones de dos microgramos por mililitro, de anticuerpos secundarios marcados con diferentes fluorocuatro como se describe en el protocolo de texto. Dispensar 50 microlitros de la mezcla en cada pocillo e incubar durante una hora a temperatura ambiente Después de la incubación, aspirar los anticuerpos secundarios y lavar tres veces con 100 microlitros de PBST.A continuación, a los 100 microlitros de PBS que contiene 32 ganchos micromolares, se tiñe el ADN para la detección de núcleos. Por último, selle las placas con una película impermeable ligera para proteger los cuatro flúor del fotoblanqueo. Las placas pueden almacenarse a cuatro grados centígrados durante semanas sin pérdida significativa de señal.En el sistema de adquisición de imágenes, especifique el tipo de placa como grinder u. Borre el diseño como 96. Formatee el número de campos como 16 y el objetivo como 20 x agua.A continuación, seleccione los canales para la excitación del núcleo de 405 nanómetros. Seleccione el canal cuatro para la excitación del citoplasma de 640 nanómetros. Seleccione el canal dos para la excitación del canal de anticuerpos específicos del antígeno de 561 nanómetros, seleccione el canal tres.A continuación, configure la potencia de excitación de cada láser. El experimento tendrá dos exposiciones: exposición establecida, excitación una a una a 640 nanómetros y exposición establecida dos a dos excitaciones a 405 nanómetros y 561 nanómetros. Seleccione Benning como contenedor dos.Utilice los pocillos de control alto para la optimización de la exposición con la máxima intensidad como canal SNAP 25 y utilice los pocillos de control bajos para la intensidad mínima. Ajuste la exposición de modo que la intensidad de cada canal sea aproximadamente la mitad del nivel de saturación o aproximadamente 2000 a 2.500 unidades relativas. A continuación, identifique el plano Z óptimo en el canal de máscara de celda utilizando el script de corrección delta.En el software de análisis de imágenes, seleccione el algoritmo de neuritas para segmentar las neuritas. Identifique las regiones de neuritas en función de los objetos secundarios, las neuritas, utilizando una expansión de menos tres píxeles del canal de tubulina beta tres como máscara. Calcule la intensidad de los canales de señal para la región de la neurita y el canal de tubulina beta tres.Seleccione los parámetros deseados para la exportación, como la longitud de la neurita, las intensidades medias de SNAP 25 beta tres, el número de núcleos de tubulina y el número de segmentos de neurita. Con la configuración completa. Transfiera las placas de los apiladores de placas con el robot, cárguelas en el generador de imágenes de alto contenido y comience la adquisición de imágenes.Aquí se muestra un análisis de diagrama de caja del porcentaje de división calculado a partir de pozos de control. El rosa representa el control de alta señal que son los pozos con solo medios y sin toxinas. Se observa muy poca hendidura en estos pozos.El azul representa el control de señal baja que son los pozos con solo toxina y sin compuesto de muestra. Estos pozos registraron una importante hendidura. Estas distribuciones de histograma de los valores de control muestran la distancia entre las dos poblaciones de control.El objetivo del proceso de cribado es encontrar compuestos dentro de la población de la muestra con valores más cercanos a la población de control positivo. La distribución de 192 muestras tratadas con compuestos, que también contenían neurotoxina botulínica A, se muestra aquí en verde. La mayoría de estos pozos mostraron una división significativa.Sin embargo, hubo algunos valores atípicos estadísticamente significativos que no mostraron una división significativa en comparación con los controles. Los valores de control se muestran de nuevo mediante las barras rosa y azul en esta distribución de histograma. Las barras verdes mostraban la superposición de los valores de la muestra con los valores de control.Los valores de muestra considerados como aciertos se seleccionaron de los valores atípicos que tienen valores de escisión porcentual inferiores a tres desviaciones estándar de la mediana de la población de la muestra. Estos cuatro impactos tienen valores similares al control de señal alta y representan el mismo compuesto, que es una neurotoxina botulínica conocida, un inhibidor del synanon que bloquea la escisión de SNAP 25. Este inhibidor demostró una sólida protección de SNAP 25 contra la neurotoxina botulínica A, así como tanto la toxina como este inhibidor se comportaron de manera similar a los pocillos sin toxina y de manera diferente a los pocillos con toxina, pero sin el inhibidor una vez dominado.Esta técnica se puede realizar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir varios controles para calcular el rendimiento estadístico del ensayo y permitir una decisión de aprobación y reprobación para cada placa de detección individual siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos proteolíticos bioquímicos, para responder a preguntas adicionales, como una evaluación de los resultados de detección como inhibidores directos o indirectos de Bot.Después de ver este vídeo, debería tener una buena idea de cómo automatizar un ensayo de cribado fenotípico que utiliza la cuantificación de SNAP 25 mediante inmunotinción como criterio de valoración principal. No hay que olvidar que trabajar con neurotoxinas botulínicas puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones como el uso de equipos de protección personal y la implementación de los procedimientos adecuados de descontaminación y eliminación de botin. La neurotoxina siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.

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