Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar un enfoque proteómico combinado para identificar posibles marcadores pronósticos y/o dianas terapéuticas en enfermedades humanas. Esto se logra aislando las células leucémicas primarias de la sangre periférica del paciente, con buen o mal pronóstico, y expresando los marcadores de superficie CD 19 y CD 5 para su uso en el análisis proteómico como segundo paso. Los lisados de células leucémicas se resuelven mediante electroforesis bidimensional o dos de, y la comparación de mapas proteómicos permite la identificación de manchas expresadas diferencialmente entre pacientes de buen y mal pronóstico, que posteriormente pueden ser identificadas por espectrometría de masas o MS.

A continuación, se pueden utilizar diferentes ensayos para validar y diseccionar el papel de las proteínas identificadas en la historia natural de la enfermedad. Los resultados muestran que el diferente estado de fosforilación de HS uno detectado por dos geles, se correlaciona con el resultado clínico de los pacientes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica ya que puede ayudar a identificar proteínas implicadas en la progresión de la enfermedad que pueden ser explotadas como marcadores pronósticos y/o dianas terapéuticas que demuestren este procedimiento serán de la mano de mí.

Pamela corrió a un técnico en el laboratorio y a un postdoc de un laboratorio externo Antes de comenzar este procedimiento, recolectó sangre periférica en tubos de recolección de sangre vacutainer con heparina de sodio. Transfiera la sangre a un tubo de 15 mililitros y agregue un cóctel de enriquecimiento de células B humanas a 50 microlitros por mililitro de sangre completa. Luego mezclar bien e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, diluir la muestra con un volumen igual de PBS más una mezcla de 2% de FBS suavemente y cubrir cuidadosamente la sangre sobre el canto de la mosca, asegurándose de no romper la interfaz. Centrifugar la muestra a 400 veces G a temperatura ambiente durante 20 minutos sin interrupción. Cuando termine, aspire cuidadosamente la interfaz para recuperar las células y colóquelas en un nuevo tubo.

Lave las células una vez con PBS después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante. Resus. Suspenda el pellet en el sobrenadante restante moviendo manualmente el tubo hacia adelante y hacia atrás después de la dilución. Con el medio RPMI completo, cuente las celdas utilizando el método de exclusión azul de Trian.

A continuación, agregue los siguientes anticuerpos a 100 microlitros de la suspensión celular purificada en un tubo de fax. Incubar la muestra durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de lavar la muestra con cuatro mililitros de PBS, comprobar la pureza mediante citometría de flujo.

Verifique el porcentaje de células de leucemia linfocítica crónica o LLC, que Coex expresa CD 19 y CD cinco en su superficie. Asegúrese de que las preparaciones estén prácticamente desprovistas de linfocitos y monocitos NK comprobando el porcentaje de CD 3, CD 14 y CD 1656 en la parcela, que debe estar cerca de cero en este punto. Solubilice los gránulos de celda de CLL con un volumen final de 380 microlitros de tampón de electroforesis bidimensional.

Aplique un miligramo de las muestras de proteína a 18 tiras de IPG para realizar el electroenfoque iso. Después de la ejecución, equilibrar las tiras en dos mililitros de tampón de equilibrio, suplementado con un 2% de TDT fresco durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar la solución, agregue dos mililitros de tampón de equilibrio, suplementado con 2,5% de I oto acetamida.

A continuación, incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante. A continuación, seque las tiras sobre papel sin tocar el gel para eliminar el exceso de solución. Una vez seco, cargue cada tira encima de un gel de página SDS con un gradiente de nueve a 16%.

Agregue un pequeño volumen de tampón de electroforesis SDS en la parte superior del gel para facilitar la carga de la tira. A continuación, selle el gel añadiendo aproximadamente cinco mililitros de solución de agar al 0,8% para evitar que la tira flote. Una vez que se haya ensamblado la unidad de electroforesis, llénela con tampón de electroforesis SDS.

A continuación, realice la carrera a 60 miliamperios por gel durante cuatro horas, cuatro grados centígrados, o utilizando un sistema de refrigeración. Después de retirar el gel de la unidad electroforética, colóquelo en la caja de tinción adecuada. Prepara unos 200 mililitros de cada solución.

Agregue con cuidado cada solución a la caja de tinción que contiene el gel. Realice todas las incubaciones en una plataforma mecedora. Después de la tinción, retire la solución de parada y deje el gel en una solución de ácido acético al 1% hasta su adquisición.

Para el ensayo de migración, resus suspende las células previamente purificadas. En RPMI completo, prepare la cámara de transpodura inferior agregando 600 microlitros de RPMI completo con o sin los estímulos específicos. Para medir la migración inducida y espontánea respectivamente, coloque la cámara superior en la parte superior y deje que el sistema se equilibre durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora.

Al terminar, siembre de 10 a las seis celdas por cada 200 microlitros en la cámara superior e incube la placa durante cuatro horas a 37 grados centígrados en la incubadora. Después de la incubación, retire la cámara superior y recoja los medios en la cámara inferior. A continuación, lave la cámara inferior una vez con un mililitro de PBS.

Después de recoger el PBS en un tubo, centrifugar la muestra durante cinco minutos a 300 veces G después de la extracción del sobrenadante. Resuspender la muestra en 500 microlitros de PBS por citometría de flujo. Cuente el número de celdas migradas después de un minuto de adquisición.

Verifique el número de celdas en un diagrama de puntos bidimensional considerando las dispersiones laterales de las celdas y el número de eventos visualizados en un minuto, que es el número a usar para el cálculo. Las muestras aisladas de células leucémicas primarias de pacientes con LLC se agruparon en dos subgrupos principales en función de las características clínicas de cada paciente y se analizaron mediante dos masas de DE y EM dentro de una cierta tolerancia de masas. Se asignaron a secuencias peptídicas en la base de datos y luego se ensamblaron en una proteína que se considera identificada si pasa una cierta puntuación de probabilidad.

Mediante este análisis, se identificaron entre estas proteínas las proteínas implicadas principalmente en la actividad del citoesqueleto y los procesos metabólicos. Linaje hematopoyético, proteína específica de la célula o hs. Uno cuya fosforilación diferencial fuertemente asociada con el curso clínico de la enfermedad se expresó diferencialmente.

En particular, los pacientes portadores de una sola mancha experimentan un mal resultado clínico, mientras que los pacientes con dos manchas tienen un buen pronóstico. Se encontró que las células de LLC portadoras de HS una como un punto, tenían una actividad citoesquelética alterada en términos de migración, adhesión y polimerización de actina en comparación con la HS hipofosforilada. Una, dos muestras puntuales. Explicando así un comportamiento clínico diferente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la proteómica para identificar candidatos biológicos involucrados en la progresión de la enfermedad que pueden usarse como marcadores pronósticos y/o dianas terapéuticas.