Procedimiento para safena humana Venas Ex Vivo Perfusión y refuerzo externo

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la influencia de la presión, el estrés puro y el refuerzo externo en la hiperplasia íntima humana. Esto se logra mediante la perfusión simultánea a alta presión de dos segmentos de la misma veta. Mientras que un segmento se refuerza con una malla externa, los segmentos de la vena se cortan en secciones para el análisis histológico y molecular.

Estos análisis se utilizan para evaluar el efecto de un refuerzo externo en la hiperplasia intimal. Los resultados muestran que un refuerzo externo puede reducir la hiperplasia íntima que normalmente se observa después de siete días de perfusión. El injerto de derivación de Seno van es uno de los tratamientos de elección en pacientes que padecen enfermedad arterial periférica.

Sin embargo, el desarrollo de hiperplasia t que conduce al fracaso del injerto es el principal factor limitante en este tipo de artes. Esta remodelación se debe a la adaptación de la furgoneta al entorno arterial para desarrollar nuevas terapias. La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en este fenómeno es esencial.

Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo ex vivo de perfusión. Una de las principales ventajas de nuestro sistema es que permite el estudio de los parámetros hemodinámicos sin ningún otro factor inmunológico o endocrino de confusión. Un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio demostrará la técnica.

Las muestras de venas humanas se obtienen de pacientes que se someten a una cirugía de bypass de miembro inferior. La vena se recoge y se lleva al laboratorio en condiciones estériles y se coloca bajo una campana de flujo laminar. El tamaño mínimo de dichas vetas es de nueve centímetros de largo.

El diámetro interno es superior a 2,5 milímetros y el diámetro externo superior a cuatro milímetros. La vena se divide en tres. Incluso los segmentos de vetas cosechadas se almacenan en medios helados RPMI 1640 glut max complementados con 12.5%FBS, enjuague un segmento en PBS.

Es el control dividido de nuevo en tres partes. Fije una parte en formina para morpho y congele las otras dos partes para el análisis molecular. El EVPS debe estar hecho de material impermeable que no lixiviará productos químicos como polimetilacrílico, metilpolioxietileno y acero.

La cámara de perfusión debe tener al menos 2,5 centímetros de profundidad para una flexión y dilatación mínimas del vaso y facilitar los cambios de medio. El soporte de la vena es una varilla de acero conectada a accesorios en forma de L de arriba a abajo. Los conductos de conexión en la columna de presión permiten ajustes de presión de entrada y salida a la vena y cambios de medios para determinar la dirección normal del flujo.

Los dos segmentos restantes para la perfusión se inyectan suavemente con el medio. Si el segmento tiene válvulas, el flujo será más lento. La vena debe invertirse en el EVPS para que las válvulas no obstaculicen el flujo.

Conecte la vena a los dos cilindros metálicos. Un extremo a la vez. Asegure los cilindros con Vicryl alrededor de las hendiduras con un nudo apretado.

A continuación, transfiera la vena a la cámara de perfusión cargada con medios. Para el tercer segmento de la vena, conecte un extremo de la vena al cilindro como se muestra anteriormente. A continuación, deslice suavemente la malla sobre la vena.

A continuación, asegure la malla y la vena en el cilindro con suturas. Finalmente, ajuste la longitud de la malla y asegure el otro extremo de la vena y la malla al cilindro. Mueva el conjunto a la segunda cámara de perfusión.

El EVPS se ensambla en un circuito cerrado con tubos de silicona. Conecte cada cilindro de salida a un divisor en Y usando un segmento de tubo de silicona tratada con peróxido. Haga lo mismo para cada cilindro metálico de entrada.

A continuación, conecte el divisor de flujo de salida a un segundo divisor Y. De este divisor Y. Conecte un flujo de salida al tubo conectado al transductor de presión, y para conectar el otro flujo de salida a la columna de presión, use un tubo de un metro para conectar la columna de presión a la bomba.

Complete la configuración conectando la bomba al divisor de entrada y divisor. Con otro medidor de tubería, conecte los tubos restantes a la columna de presión. El conducto más bajo sirve para el cambio de medios.

Después de ensamblar el EVPS, llene la columna con medio hasta justo debajo del conducto de salida de la vena. Ahora, mueva el sistema a la incubadora, que está configurada a 37 grados Celsius usando dióxido de carbono. Mantenga el pH constante de 7,4 fuera de la incubadora.

Conecte los cabezales de los engranajes de la bomba a la transmisión de engranajes para controlar la presión. Conecte la salida de presión del EVPS al transductor de presión. Compruebe que el tubo esté completamente lleno y no tenga burbujas.

A través del software del ordenador, que pilota de forma independiente la bomba de engranajes, se configura una señal de cardio ital ital a 60 pulsos por minuto con amplitud constante. El caudal resultante es de unos 160 mililitros por minuto. La presión se configura y regula de forma independiente mediante una bomba centrífuga en serie con un regulador de presión ajustable controlado por el ordenador.

Después de tres a siete días, termine la perfusión para cada segmento perfundido. Retire cinco milímetros de cada extremo para desechar la parte ligada de las venas. A continuación, corta un anillo de cinco milímetros para la fijación de la sección central de la vena.

Congele los fragmentos restantes para su análisis molecular. Incruste el tercer segmento en formina para histología y análisis molecular. Después de siete días de perfusión a alta presión, se prepararon secciones de venas para el análisis histológico.

Para todas las condiciones, la tinción h y e reveló núcleos de células endoteliales que recubren la luz y núcleos de SMC en la capa media. Cuando el tejido se tiñó con gel V para ver la elastina, las venas perfundidas mostraron un engrosamiento de la íntima, una remodelación externa patológica y un adelgazamiento de los medios fue evidente. La tinción de tricomas de Masson muestra que solo una de las tres capas musculares persistió con células musculares lisas acumuladas en la capa interna.

Por el contrario, el refuerzo externo de la vena preserva la distribución de SMC y la estructura del medio Esta técnica requiere trabajar bajo una sepsis rigurosa. Una vez dominado, se puede realizar en menos de dos horas utilizando este sistema. Otras condiciones como el flujo turbulento se pueden probar para responder preguntas adicionales, como la eficiencia del refuerzo de la malla en el flujo no lanar.