Una guía para la moderna cuantitativa fluorescente Western Blot con las estrategias de solución de problemas

El objetivo de este procedimiento es detectar y cuantificar con precisión la abundancia relativa de proteínas específicas dentro de una muestra biológica compleja mediante torsión cuantitativa fluorescente y transferencia. Esto se logra mediante los primeros extractos de proteínas separados electrofluorescentemente utilizando un gel de gradiente prefabricado. En el segundo paso, se verifica la carga de proteína equivalente en todos los carriles de muestra mediante la aplicación de una tinción de proteína total, y luego se utiliza el sistema de transferencia rápida semiseco de bloqueo ocular para transferir las muestras a la membrana A-P-V-D-F.

Por último, las proteínas se sondean con anticuerpos primarios específicos seguidos del anticuerpo secundario marcado con fluorescencia adecuado para facilitar su detección sensible, robusta y lineal en longitudes de onda infrarrojas y rojas lejanas. En última instancia, el florecimiento occidental fluorescente cuantitativo se puede utilizar para detectar, visualizar y cuantificar con precisión de manera reproducible un gran número de proteínas solubles y unidas a la membrana en una amplia gama de muestras de tejido. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las imágenes basadas en ECL, es que permite una mayor sensibilidad con mayor precisión en una amplia escala lineal para una lectura verdaderamente cuantitativa. Comience por macerar manualmente la muestra de tejido, seguido de la homogeneización en un tampón de extracción recién preparado a aproximadamente uno a 10 de peso de tejido por volumen de tampón hasta que se produzca un homogeneizado suave y consistente.

A continuación, centrifugar el lisado celular durante 20 minutos a 20.000 veces G a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el estado que contiene las proteínas solubilizadas a un tubo de microcentrífuga limpio y almacene las fracciones de pellet y sobrenadante S a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. Después de determinar la concentración de proteína del supinado, transfiera 15 microgramos de proteína por muestra a nuevos tubos de microcentrífuga.

A continuación, aumente el volumen final de cada muestra a 10 microlitros con agua destilada y añada cinco microlitros de tampón de carga de Forex. Agite completamente las soluciones celulares mediante vórtice y luego caliente las muestras a 98 grados Celsius durante dos minutos para desnaturalizar las proteínas. Después de la desnaturalización, agregue tres microlitros de un estándar de peso molecular apropiado en el primer pocillo de cada uno de los geles de control experimentales y de carga.

A partir de entonces, cargue 10 microlitros de cada muestra en los pocillos posteriores apropiados después de la electroforesis. Utilice un cuchillo de gel para liberar los geles del casete y retire los pocillos y el pie del gel. Marque el gel para ayudar en la orientación posterior.

Luego, para determinar la carga de proteína equivalente, decanta aproximadamente 30 mililitros de tinción de proteína en una placa de Petri cuadrada de 12 por 12 centímetros y coloca el gel de control de carga en la tinción, asegurándote de que la solución cubra todo el gel. Agite suavemente el gel durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente, y luego deseche la mancha de proteína y lave el gel tres veces en agua destilada antes de la visualización del bloqueo ocular. Después de la electroforesis, prepare la pila de transferencia inferior quitando la cubierta de aluminio y humedeciendo previamente la membrana con tampón de funcionamiento directamente desde el tanque de gel.

Vuelva a humedecer el papel de filtro con agua destilada en este momento también. A continuación, coloque el gel experimental en la pila de transferencia inferior preparada y, a continuación, coloque el papel de filtro previo al trabajo sobre el gel y enrolle ambos para asegurarse de que no queden burbujas atrapadas entre las capas. Coloque la pila superior encima del papel de filtro y la pila inferior.

Luego enrolle el sándwich de la pila de transferencia para eliminar las burbujas de aire. Inserte la esponja del kit de pila de transferencia en la almohadilla absorbente y coloque el sándwich de pila de transferencia en el espacio dedicado. A continuación, cierre bien la tapa y ponga en marcha el bloque I dos, transfiriendo las proteínas durante siete minutos en el programa tres.

Cuando finalice el programa, retire la pila de transferencia de la máquina de bloques de ojo y retire la pila de transferencia superior y las capas de papel de filtro que exponen el gel en la pila de transferencia inferior. Use un bisturí para cortar alrededor del gel teniendo cuidado de hacer un corte triangular con fines de orientación en la membrana después del recorte de la membrana para verificar la eficiencia de la transferencia de la proteína, el gel como se acaba de demostrar, y luego movió rápidamente la membrana a un tubo limpio de 50 mililitros que contiene cinco mililitros de PBS para el primero de tres, Cinco minutos de lavado en un rodillo mecánico. Después del tercer lavado, deseche el tampón de lavado e incube la membrana en un tampón de bloqueo sin diluir durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, incubar la membrana en anticuerpo primario diluido en cinco mililitros de tampón bloqueante y 0,1 entre 20 durante la noche a cuatro grados centígrados con agitación constante. A la mañana siguiente, después de desechar la solución de anticuerpo primario, lave la membrana seis veces durante cinco minutos en PBS, como se acaba de demostrar. A continuación, incubar la membrana en la oscuridad con un anticuerpo secundario marcado con fluorescente, dilatado en cinco mililitros de tampón de bloqueo y 0,1% entre 20 con agitación constante, seguido de seis lavados de PBS de cinco minutos para todas las imágenes.

Primero, inicie sesión en la computadora y en el generador de imágenes. A continuación, abra el software de diagnóstico por imágenes para obtener una imagen de la Western blot. Primero, abra la tapa del generador de imágenes y vierta una pequeña cantidad de PBS en el vidrio.

En la esquina inferior izquierda del generador de imágenes, coloque la membrana encima del PBS asegurándose de que esté cuadrada con el eje del generador de imágenes y de que quede un espacio de un centímetro entre la membrana y el eje de la cuadrícula. Enrolle la membrana para asegurarse de que no queden burbujas atrapadas entre el vidrio y la membrana, y luego cuente el número de cuadrados que ocupa la membrana en los ejes x e y. A continuación, cierre la tapa del generador de imágenes e introduzca el número de cuadrados en el software de la computadora.

Seleccione el canal infrarrojo adecuado y la intensidad adecuada, e inicie la exploración para visualizar la tinción total de proteínas del gel de control de carga. Repare el gel y el generador de imágenes como se acaba de demostrar para la membrana experimental y, a continuación, seleccione el canal 700. Establezca la intensidad en cinco y comience el escaneo.

Para cuantificar los datos de escaneo. Comience ajustando los botones de brillo y contraste del archivo escaneado para producir la mejor calidad de imagen, rotando las imágenes necesarias para lograr la orientación deseada. A continuación, selecciona un rectángulo del menú de formas y úsalo para dibujar un rectángulo alrededor de todo el carril.

En el carril de muestreo uno. Copie y pegue la forma alrededor del carril uno para muestrear el carril dos. Después de confirmar que la medición de fondo no incorpora una señal en el siguiente carril, dibuje un rectángulo alrededor de cada carril para el resto de los carriles de muestra.

A continuación, muestre la señal de la tabla de formas para cada rectángulo dibujado en unidades fluorescentes arbitrarias y guarde la imagen como una bilis tiff. Hay una serie de medidas de control que son cruciales para garantizar que se recopilen datos precisos durante la transferencia cuantitativa fluorescente de Western. Por ejemplo, es deseable incluir muestras de control positivo.

En segundo lugar, es importante optimizar el tiempo de transferencia para garantizar un movimiento equivalente de proteínas de alto y bajo peso molecular desde el gel hasta la membrana. En tercer lugar, se deben determinar las diluciones adecuadas de anticuerpos primarios y secundarios para evitar la interpretación incorrecta de las proteínas de interés debido a bandas inespecíficas como se ilustra en estas imágenes. En cuarto lugar, es importante considerar si puede ser necesario un anticuerpo secundario generado en una especie huésped diferente, particularmente en los casos en que no se detecta una banda de proteína esperada.

En quinto lugar, la producción de un gel de control de carga puede confirmar la uniformidad de la carga de muestra. Cuando se combina con un análisis de proteína total, el gel se puede utilizar para comparar y cuantificar la carga de proteína en cada carril en varios rangos de peso molecular medidos en cada muestra. Finalmente, esta técnica se presta para el pelado y resondeo de membranas con más flexibilidad que la luminiscencia kemi debido a factores que incluyen, entre otros, una mayor sensibilidad, un fondo reducido, detección de color dual y estabilidad de la membrana en condiciones de almacenamiento a largo plazo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el trazado occidental fluorescente cuantitativo para detectar y cuantificar con precisión proteínas de interés, así como cómo solucionar problemas comunes que pueden ocurrir al realizar esta técnica.