Name: Una guía para la moderna cuantitativa fluorescente Western Blot con las estrategias de solución de problemas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende Western Blot fluorescente cuantitativo para detectar y cuantificar proteínas con alta sensibilidad y precisión lineal. Este método mejora la reproducibilidad en análisis de muestras biológicas complejas.

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Nos gustaría dar las gracias lo siguiente para apoyo financiero: BBSRC Instituto de Financiación de Programas Estratégicos - CF &amp; TMW; Financiación BBSRC Oriente Bio DTP - LG; El Darwin Fideicomiso de Edimburgo - MLH. También nos gustaría dar las gracias a Dr. Barry McColl permiso para incluir la optimización TREM2 en este manuscrito.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La debida consideración y la planificación es esencial antes de cualquier experimento y en última instancia pueden determinar el éxito de la técnica utilizada. Los avances en la detección de proteínas utilizando WB puede presentar una gran cantidad de posibles obstáculos cuando se trata de elegir los anticuerpos, métodos de transferencia y visualización adecuadas para su uso. Afortunadamente, el uso de una lista de verificación cuidadosa y medidas de control apropiadas QFWB puede ser utilizado de forma rutinaria para determinar la presencia de proteínas y las diferencias de expresión cada vez más sutiles entre las muestras. Este protocolo ofrece una guía completa sobre el Western Blot cuantitativa fluorescente, así como algunas estrategias de solución de problemas para evitar y / o resolver algunos de los muchos errores comunes asociados a ella. Los pasos críticos usadas para mantener la sensibilidad y obtener verdaderamente mediciones cuantificables y comparables incluyen: 1) robusta extracción de proteína a partir de muestras de tejido; 2) preparación de la muestra; 3) loadin proteína exactag determinó por análisis de proteína total; 4) la transferencia óptima de proteínas utilizando I-Blot; 5) la preparación de anticuerpos primarios y secundarios en tampón de bloqueo que contiene 0,1% de Tween 20, y 6) correcta visualización y análisis utilizando un generador de imágenes de infrarrojos y el software asociado. Detección fluorescente infrarrojo es verdaderamente cuantitativo y proporciona una mayor sensibilidad en comparación con las técnicas más tradicionales de detección ECL 3,11. Este sistema de detección es de múltiples facetas, y como tal no se limita a QFWB. Este sistema es capaz de obtención de imágenes de etiquetado inmunohistoquímico en baja potencia que permite la visualización y cuantificación de las secciones de tejido 12 enteros. Esta es un área de potencial de desarrollo futuro en términos de resolución, que podría ver imágenes rojo lejano que rivaliza con la captura de inmunofluorescencia convencional con microscopios convencionales en términos de evaluación cuantitativa. Sin embargo, con una mayor sensibilidad a los cambios sutiles en protein expresión es fundamental para garantizar la variabilidad se reduce al mínimo y las medidas de control son muy estrictos con los protocolos robustos. Esto comienza con la extracción de proteínas rigurosa de la muestra de tejido seguido por la producción de geles de proteínas totales se tiñeron para proporcionar la seguridad de que la carga de muestra es uniforme, la optimización de anticuerpos primarios y secundarios para determinar si la detección es real y prueba de las directrices del fabricante con respecto a la transferencia veces para obtener la proteína de transferencia eficiente. Sin embargo, incluso cuando se optimizan las condiciones para WB, es posible que aún los problemas asociados con el funcionamiento de los westerns que pueden no haber sido plenamente exploradas aquí. Estos incluyen, pero no se limitan a factores que incluyen la solubilización de proteínas y la elección de tampón de extracción. Algunos tampones pueden interferir con ensayos de concentración de proteína, y algunos tejidos son particularmente difíciles de solubilizar, lo que requiere técnicas más robustas tales como el uso de macera automatizadoting envases sellados, tales como tubos de M junto con un disociador Macs. Además, las medidas de control sencillas para el almacenamiento de material extraído no extraídos y a -80 ° C pueden ser la diferencia entre la obtención de etiquetado óptimo inmediatamente después de la extracción y que tiene resultados pobres semanas más tarde. Métodos QFWB modernos han demostrado ser más sensibles para captar las diferencias sutiles en la expresión de proteínas y están permitiendo que más versátil de doble etiquetado simultáneo de 3, en comparación con las técnicas más antiguas como la ECL. Es de vital importancia que los protocolos de Western Blot son robustos y fácilmente repetible para la cuantificación precisa y el análisis estadístico. Este protocolo es sensible y lo suficientemente robusto como para ser utilizado de forma rutinaria para la detección de proteínas a través de una variedad de diferentes muestras de tejidos y especies 3 y permite la cuantificación de las proteínas de baja y alta abundancia dentro de la misma QFWB por lo tanto reduciendo el uso de consumibles así como el tiempo por experimento 1. 1 Además, el aumento de la sensibilidad de esta técnica permite la validación de cada vez más popular - estudios ómicas 9,14 embargo exactitud es crucial y la inclusión de medidas de control apropiadas deben ser respetados evitando de este modo la adquisición de datos erróneos.

Western Blot (WB) es una técnica analítica desarrollado originalmente en la década de 1970 para determinar la presencia o ausencia de una proteína de interés en una muestra biológica compleja, tal como un homogeneizado de tejido 1. Comúnmente conocido como la inmunotransferencia de proteínas, debido a la interacción anticuerpo-antígeno clave, la metodología consiste en 5 pasos distintos: 1) la separación electroforética de las proteínas por su punto isoeléctrico; 2) la transferencia a un nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana; 3) marcar usando un anticuerpo primario específico para la proteína de interés; 4) la incubación con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario; y 5) la visualización. Visualización metodología ha evolucionado con el tiempo para mejorar la seguridad y la sensibilidad. Algunos de los primeros WB se llevaron a cabo utilizando etiquetas de radio etiquetadas que luego progresaron a los métodos quimioluminiscentes más ampliamente utilizado (ECL) colorimétrico y luego. RadioactiviTy se marcó directamente en sondas para antígenos específicos mientras que las metodologías colorimétricas y ECL utilizan una técnica indirecta etiquetado con una enzima tal como reportero alcalina fosfatasa o estreptavidina peroxidasa de rábano picante (HRP) 2. La intensidad de etiquetado del producto cromógeno o luminiscente se mide utilizando densitometría por lo que la intensidad de la señal, fuerte o débil, más o menos indica la presencia de la proteína de interés en la muestra. ECL es la metodología más sensible y, por tanto, favorecido 2, pero los 3 métodos se desarrollaron inicialmente en la película de rayos X con técnicas de imagen digital más sofisticados posteriormente establecidas 3. El avance de la imagen digital de WB no sólo permite a un investigador para determinar la presencia o ausencia de su proteína de interés, pero también permitió una inferencia con el nivel de expresión de una proteína seleccionada cuando se compara con otras muestras y por lo tanto puede ser denominado &quot;semi-cuantitativa &amp; #8221 ;. Recientemente, una tecnología de transferencia de western verdaderamente cuantitativo y más sensibles ha sido desarrollado por el cual el nivel de fluorescencia medido está directamente relacionada con la cantidad y la expresión de una sola proteína dentro de una muestra: cuantitativa fluorescente Western Blot (QFWB). Al comparar con el etiquetado QFWB ECL, el uso de un anticuerpo secundario fluorescente genera un perfil de detección lineal 4. Esto está en contraste con las técnicas ECL donde la linealidad de la señal generalmente se produce con cargas bajas de proteínas por debajo de 5 mg y la saturación de señal directamente relacionados con la expresión de la proteína, es decir, con genes de limpieza ubicuamente expresadas 5,6. Esta disparidad es muy probablemente causado por un mayor número de sitios de unión disponibles para un sustrato ECL avidina para unirse a un secundario biotinilado, que resulta en una mayor probabilidad de potencial de saturación de la señal. Esta es una de las principales razones de inmunotransferencia ECL base que se conoce como only &quot;semi-cuantitativa&quot; 7. El punto de saturación de la señal es de importancia crítica en la medición de las diferencias sutiles en los niveles de expresión y puede dar lugar a mediciones inexactas. En los últimos años el advenimiento de técnicas proteómicas generalizadas detallando cada vez mayor sensibilidad y la identificación de las diferencias sutiles de expresión ha dado lugar a una confianza cada vez mayor en la transferencia Western cuantitativa verdaderamente para los experimentos de validación de 8,9. La aplicación de la metodología sensible, robusto y verdaderamente cuantitativo es por lo tanto crucial. Muchas metodologías Western Blot &quot;optimizados&quot; han sido utilizados por los laboratorios independientes, que con frecuencia resultan difíciles de establecer o reproducir debido a los ajustes metodológicos sutiles que pueden no estar reflejados en los protocolos documentados formales. Se trata de un protocolo establecido y robusto para QFWB y, además, ofrece valiosas estrategias para solucionar problemas comunes that puedan surgir durante la ejecución. Este protocolo se optimizó originalmente para su uso con homogenados de cerebro murino, pero desde entonces ha sido utilizado con eficacia en una amplia gama de muestras de tejidos y especies 4,9,10. Variaciones del protocolo potenciales necesarios para la solución de problemas específicos se incluyen.

<table><tbody><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubos</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Pila de transferencia de iBlot, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>LC5602</td><td>Uso en gel 1 para Western blot</td></tr><tr><td>SeeBlue Estándar de proteínas preteñidas</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Uso en gel 2 Gel teñido de proteína total</td></tr><tr><td>NuPAge LDS Tampón de muestra 4x</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (solo para geles Bis-Tris) (20x)</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 pocillos</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tableta salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Kit de ensayo de proteínas</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Tampón bloqueante Odyssey</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>N/P 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-conejo para cabras (H+L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Burro anti-ratón IgG (H+L), 0,5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-Conejo para cabras (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Burro anti-IgG para cabras (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Generador de imágenes por infrarrojos</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Convocatoria de presupuesto</td></tr><tr><td>Sistema de transferencia de 7 minutos iBlot</td><td>Life technologies, Reino Unido</td><td></td><td>Este modelo ya no está en producción</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein stain</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot Western blot stripping buffer&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

una guía para la moderna cuantitativa fluorescente western blot con las estrategias de solución de problemas

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Los finales de los años 1970 vio el primer uso informado públicamente de la transferencia de western, una técnica para evaluar la presencia y abundancia relativa de las proteínas específicas dentro de muestras biológicas complejas. Desde entonces, la metodología de transferencia de western se ha convertido en un componente común de los biólogos moleculares el repertorio experimental. Una búsqueda superficial de PubMed utilizando el término &quot;western blot&quot; sugiere que más de doscientos veinte mil manuscritos publicados han hecho uso de esta técnica para el año 2014. Es importante destacar que, en los últimos diez años se ha producido avances técnicos de imagen, junto con el desarrollo marcadores fluorescentes de sensibles que han mejorado la sensibilidad y arrojado aún mayores rangos de detección lineal. El resultado es una fluorescencia ahora verdaderamente cuantificable basado Western Blot (QFWB) que permite a los biólogos para llevar a cabo el análisis de expresión comparativo con mayor sensibilidad y precisión que nunca antes. Muchos Western Blot &quot;optimizado&quot;Existen metodologías y se utilizan en diferentes laboratorios. Estos a menudo resultan difíciles de implementar debido a la exigencia de modificaciones procesales sutiles pero indocumentados. Este protocolo proporciona una descripción completa de un método QFWB establecido y robusto, completo con las estrategias de solución de problemas.

Como la sensibilidad QFWB y el rango lineal de detección es mayor que la detección convencional ECL, hay una serie de medidas de control que son cruciales para asegurar la recepción de datos precisa, ayudando de ese modo la interpretación efectiva. En primer lugar, la inclusión de muestras de control positivas como se muestra en la Figura 1. En segundo lugar, la optimización de la transferencia para garantizar una circulación equivalente de proteínas de alto y bajo peso molecular desde el gel a la membrana según lo exhibido en la figura 2. En tercer lugar, la optimización de anticuerpos, especialmente secundaria anticuerpos cuya optimización a menudo se pasa por alto, pero que pueden producir no específica bandas capaces de interferir con la interpretación correcta de la proteína (s) de interés. Véase la Figura 3. En cuarto lugar, también puede ser el caso cuando una proteína que aparece indetectable pero se espera que esté presente, esto también puede ser un problema de anticuerpo secundario que se puede corregir utilizando simplemente un rais secundariased en una serie de especies diferentes. Véase la Figura 4. En quinto lugar, el etiquetado de proteína total y el análisis es un método mucho más robusto y cuantificable en comparación con el uso de la proteína simple tradicional (s) que se expresa de forma ubicua para los estándares de referencia internos 3. Muchas de estas proteínas individuales se han encontrado para ser expresadas diferencialmente en modelos de enfermedades neurodegenerativas, así como entre las diferentes muestras de tejido y la uniformidad de expresión puede modificar dentro del mismo tejido 3. Por lo tanto, la producción de un gel de control de carga confirmará la uniformidad de la carga de la muestra cuando se combina con un análisis de proteína total mediante la comparación y la cuantificación de la carga de proteína en cada carril en varios rangos de pesos moleculares medidos contra cada muestra para indicar el error estándar como se demuestra en la Figura 6 . Es importante destacar que todas estas técnicas y controles de solución de problemas sólo son tan eficaces como la sensibilidad y la coherencia del análisis terramientas aplicadas por el operador (Figura 5). Finalmente esta técnica se presta a la extracción y re-sondeo de las membranas con más flexibilidad que ECL debido a factores incluyendo, pero no limitado a aumento de la sensibilidad, la reducción de fondo, la detección de doble color y estabilidad de la membrana en condiciones de almacenamiento a largo plazo. Véase la Figura 7.

El avance de la transferencia occidental mediante fluorescencia ha permitido la detección de cambios sutiles en la expresión de proteínas, lo que permite realizar análisis cuantitativos. Aquí describimos una metodología robusta para la detección de una variedad de proteínas en una variedad de especies y tipos de tejidos. También se proporciona una estrategia para superar problemas técnicos comunes.

Una guía para la moderna cuantitativa fluorescente Western Blot con las estrategias de solución de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

El objetivo de este procedimiento es detectar y cuantificar con precisión la abundancia relativa de proteínas específicas dentro de una muestra biológica compleja mediante torsión cuantitativa fluorescente y transferencia. Esto se logra mediante los primeros extractos de proteínas separados electrofluorescentemente utilizando un gel de gradiente prefabricado. En el segundo paso, se verifica la carga de proteína equivalente en todos los carriles de muestra mediante la aplicación de una tinción de proteína total, y luego se utiliza el sistema de transferencia rápida semiseco de bloqueo ocular para transferir las muestras a la membrana A-P-V-D-F.Por último, las proteínas se sondean con anticuerpos primarios específicos seguidos del anticuerpo secundario marcado con fluorescencia adecuado para facilitar su detección sensible, robusta y lineal en longitudes de onda infrarrojas y rojas lejanas. En última instancia, el florecimiento occidental fluorescente cuantitativo se puede utilizar para detectar, visualizar y cuantificar con precisión de manera reproducible un gran número de proteínas solubles y unidas a la membrana en una amplia gama de muestras de tejido. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las imágenes basadas en ECL, es que permite una mayor sensibilidad con mayor precisión en una amplia escala lineal para una lectura verdaderamente cuantitativa. Comience por macerar manualmente la muestra de tejido, seguido de la homogeneización en un tampón de extracción recién preparado a aproximadamente uno a 10 de peso de tejido por volumen de tampón hasta que se produzca un homogeneizado suave y consistente.A continuación, centrifugar el lisado celular durante 20 minutos a 20.000 veces G a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el estado que contiene las proteínas solubilizadas a un tubo de microcentrífuga limpio y almacene las fracciones de pellet y sobrenadante S a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. Después de determinar la concentración de proteína del supinado, transfiera 15 microgramos de proteína por muestra a nuevos tubos de microcentrífuga.A continuación, aumente el volumen final de cada muestra a 10 microlitros con agua destilada y añada cinco microlitros de tampón de carga de Forex. Agite completamente las soluciones celulares mediante vórtice y luego caliente las muestras a 98 grados Celsius durante dos minutos para desnaturalizar las proteínas. Después de la desnaturalización, agregue tres microlitros de un estándar de peso molecular apropiado en el primer pocillo de cada uno de los geles de control experimentales y de carga.A partir de entonces, cargue 10 microlitros de cada muestra en los pocillos posteriores apropiados después de la electroforesis. Utilice un cuchillo de gel para liberar los geles del casete y retire los pocillos y el pie del gel. Marque el gel para ayudar en la orientación posterior.Luego, para determinar la carga de proteína equivalente, decanta aproximadamente 30 mililitros de tinción de proteína en una placa de Petri cuadrada de 12 por 12 centímetros y coloca el gel de control de carga en la tinción, asegurándote de que la solución cubra todo el gel. Agite suavemente el gel durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente, y luego deseche la mancha de proteína y lave el gel tres veces en agua destilada antes de la visualización del bloqueo ocular. Después de la electroforesis, prepare la pila de transferencia inferior quitando la cubierta de aluminio y humedeciendo previamente la membrana con tampón de funcionamiento directamente desde el tanque de gel.Vuelva a humedecer el papel de filtro con agua destilada en este momento también. A continuación, coloque el gel experimental en la pila de transferencia inferior preparada y, a continuación, coloque el papel de filtro previo al trabajo sobre el gel y enrolle ambos para asegurarse de que no queden burbujas atrapadas entre las capas. Coloque la pila superior encima del papel de filtro y la pila inferior.Luego enrolle el sándwich de la pila de transferencia para eliminar las burbujas de aire. Inserte la esponja del kit de pila de transferencia en la almohadilla absorbente y coloque el sándwich de pila de transferencia en el espacio dedicado. A continuación, cierre bien la tapa y ponga en marcha el bloque I dos, transfiriendo las proteínas durante siete minutos en el programa tres.Cuando finalice el programa, retire la pila de transferencia de la máquina de bloques de ojo y retire la pila de transferencia superior y las capas de papel de filtro que exponen el gel en la pila de transferencia inferior. Use un bisturí para cortar alrededor del gel teniendo cuidado de hacer un corte triangular con fines de orientación en la membrana después del recorte de la membrana para verificar la eficiencia de la transferencia de la proteína, el gel como se acaba de demostrar, y luego movió rápidamente la membrana a un tubo limpio de 50 mililitros que contiene cinco mililitros de PBS para el primero de tres, Cinco minutos de lavado en un rodillo mecánico. Después del tercer lavado, deseche el tampón de lavado e incube la membrana en un tampón de bloqueo sin diluir durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, incubar la membrana en anticuerpo primario diluido en cinco mililitros de tampón bloqueante y 0,1 entre 20 durante la noche a cuatro grados centígrados con agitación constante. A la mañana siguiente, después de desechar la solución de anticuerpo primario, lave la membrana seis veces durante cinco minutos en PBS, como se acaba de demostrar. A continuación, incubar la membrana en la oscuridad con un anticuerpo secundario marcado con fluorescente, dilatado en cinco mililitros de tampón de bloqueo y 0,1% entre 20 con agitación constante, seguido de seis lavados de PBS de cinco minutos para todas las imágenes.Primero, inicie sesión en la computadora y en el generador de imágenes. A continuación, abra el software de diagnóstico por imágenes para obtener una imagen de la Western blot. Primero, abra la tapa del generador de imágenes y vierta una pequeña cantidad de PBS en el vidrio.En la esquina inferior izquierda del generador de imágenes, coloque la membrana encima del PBS asegurándose de que esté cuadrada con el eje del generador de imágenes y de que quede un espacio de un centímetro entre la membrana y el eje de la cuadrícula. Enrolle la membrana para asegurarse de que no queden burbujas atrapadas entre el vidrio y la membrana, y luego cuente el número de cuadrados que ocupa la membrana en los ejes x e y. A continuación, cierre la tapa del generador de imágenes e introduzca el número de cuadrados en el software de la computadora.Seleccione el canal infrarrojo adecuado y la intensidad adecuada, e inicie la exploración para visualizar la tinción total de proteínas del gel de control de carga. Repare el gel y el generador de imágenes como se acaba de demostrar para la membrana experimental y, a continuación, seleccione el canal 700. Establezca la intensidad en cinco y comience el escaneo.Para cuantificar los datos de escaneo. Comience ajustando los botones de brillo y contraste del archivo escaneado para producir la mejor calidad de imagen, rotando las imágenes necesarias para lograr la orientación deseada. A continuación, selecciona un rectángulo del menú de formas y úsalo para dibujar un rectángulo alrededor de todo el carril.En el carril de muestreo uno. Copie y pegue la forma alrededor del carril uno para muestrear el carril dos. Después de confirmar que la medición de fondo no incorpora una señal en el siguiente carril, dibuje un rectángulo alrededor de cada carril para el resto de los carriles de muestra.A continuación, muestre la señal de la tabla de formas para cada rectángulo dibujado en unidades fluorescentes arbitrarias y guarde la imagen como una bilis tiff. Hay una serie de medidas de control que son cruciales para garantizar que se recopilen datos precisos durante la transferencia cuantitativa fluorescente de Western. Por ejemplo, es deseable incluir muestras de control positivo.En segundo lugar, es importante optimizar el tiempo de transferencia para garantizar un movimiento equivalente de proteínas de alto y bajo peso molecular desde el gel hasta la membrana. En tercer lugar, se deben determinar las diluciones adecuadas de anticuerpos primarios y secundarios para evitar la interpretación incorrecta de las proteínas de interés debido a bandas inespecíficas como se ilustra en estas imágenes. En cuarto lugar, es importante considerar si puede ser necesario un anticuerpo secundario generado en una especie huésped diferente, particularmente en los casos en que no se detecta una banda de proteína esperada.En quinto lugar, la producción de un gel de control de carga puede confirmar la uniformidad de la carga de muestra. Cuando se combina con un análisis de proteína total, el gel se puede utilizar para comparar y cuantificar la carga de proteína en cada carril en varios rangos de peso molecular medidos en cada muestra. Finalmente, esta técnica se presta para el pelado y resondeo de membranas con más flexibilidad que la luminiscencia kemi debido a factores que incluyen, entre otros, una mayor sensibilidad, un fondo reducido, detección de color dual y estabilidad de la membrana en condiciones de almacenamiento a largo plazo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el trazado occidental fluorescente cuantitativo para detectar y cuantificar con precisión proteínas de interés, así como cómo solucionar problemas comunes que pueden ocurrir al realizar esta técnica.

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Este artículo técnico describe un estándar occidental-blot procedimiento que utiliza la electroforesis disponibles en el mercado NuPAGE Mini-Gel sistema de Invitrogen.

Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto.

Western Blot: Preparación de muestras para la detección

El video muestra una técnica de western blot basada en la normalización total de proteínas para cuantificar la expresión de la proteína objetivo en una muestra. Mediante la utilización de la tinción total de proteínas de la muestra, se realiza un análisis radiométrico para determinar el nivel de expresión relativa de la proteína objetivo.

Western Blotting cuantitativo para estimar los niveles de expresión de proteínas

Este video describe la transferencia occidental basada en quimioluminiscencia de lisados inmunoprecipitados. La técnica ayuda a determinar el procesamiento y la activación de proteínas. La señal quimioluminiscente detectada es proporcional al nivel de procesamiento de proteínas durante su activación.

Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

El flujo de trabajo V3 es un procedimiento de western blot que utiliza geles sin manchas. La tecnología libre de manchas permite a los investigadores visualizar la calidad de la separación de proteínas, verificar la eficiencia de la transferencia y, lo que es más importante, validar el cambio en la proteína de interés utilizando la cuantificación total de proteínas como un control de carga confiable.

Flujo de trabajo sin manchas V3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en Western Blotting

Este protocolo explora los últimos avances en la realización de análisis de Western blot. Estas nuevas modificaciones emplean un sistema de gel Bis-Tris con una electroforesis en tiempo de ejecución 35 min, un sistema de transferencia Blot seco 7 min, y detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo y formación de imágenes que genera una resolución más alta, la calidad, la sensibilidad, y la mejora de la precisión de los datos occidentales.

El más rápido de Occidente en la ciudad: un toque contemporáneo en el análisis clásico de Western Blot

Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.

Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

Aprende Western Blot fluorescente cuantitativo para detectar y cuantificar proteínas con alta sensibilidad y precisión lineal. Este método mejora la reproducibilidad en análisis de muestras biológicas complejas.

Una guía para la moderna cuantitativa fluorescente Western Blot con las estrategias de solución de problemas

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