Name: El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a aislar subpoblaciones de células madre adiposas humanas con potencial osteogénico mejorado mediante citometría de flujo. Este método avanza la medicina regenerativa para aplicaciones en reconstrucción craneofacial.

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Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de Investigación de subvención R01-DE021683-01 y los Institutos Nacionales de Salud de Investigación de subvención R01-DE019434 a MTL; Instituto Médico Howard Hughes de Becas de Investigación para MTCDCW fue apoyado por la AEC Franklin Martin Facultad de Becas de Investigación, El Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa, y el Premio Académico Facultad Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford.

NOTA: Todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con consentimiento informado, y los protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de la Junta de Revisión Institucional de Stanford (Protocolo # 2188 y # 9999). 1. Aislamiento de células y Cultura: <ol><li> Obtener tejido adiposo subcutáneo humano a partir de pacientes de sexo femenino sanos sometidos a lipoaspiración electiva del abdomen, flanco, y / o la región del muslo bajo anestesia local / general. Asegúrese de que la Junta de Revisión Institucional (IRB) haya obtenido la aprobación para el protocolo de aislamiento de ASC a partir de tejidos humanos, y siga las precauciones de seguridad institucionales mientras se trabaja con este tipo de materiales. </li><li> Para obtener el SVF del tejido adiposo lipoaspirated, primero lavar el lipoaspirado tres veces con volúmenes iguales de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Aspirar con cuidado y desechar la fase acuosa inferior. </li><li> Preparar el tampón de digestión colagenasa: 0,075% colagenasa tipo I en HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampón FACS: 2% de SFB, el 1% y el 1% P188 Pen-Strep en PBS. Filtra ambas soluciones utilizando un tamaño de poro de flujo rápido del filtro de polietersulfona 0,22 micras disponible en el mercado. </li><li> Para digerir el tejido adiposo lavado, añadir un volumen igual de tampón de digestión con colagenasa y colocar recipiente de digestión de forma segura en un baño de agua en agitación durante 60 min a 37 ° C (aproximadamente 180 batidos / min). NOTA: Lo mejor es usar un recipiente de digestión volumen más grande de lo necesario, ya que esto permite la digestión máxima durante la agitación (es decir, 250 ml de tampón de digestión con colagenasa, 250 ml de tejido adiposo lavado en un matraz estéril 1L). </li><li> Neutralizar la actividad enzimática mediante la adición de un volumen igual de tampón de FACS y permitir sentarse a TA durante 5 min. A continuación, se centrifuga a 233 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el pellet SVF de alta densidad. </li><li> Resuspender el precipitado en 5 a 10 ml de RT rojoTampón de Lisis Celular, basado en el tamaño del pellet. Deje la solución para sentarse a TA durante 5 min y se centrifuga a 233 xg durante 5 min a TA. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado mediante la adición de 5-10 ml de medio de crecimiento tradicional, basado en el tamaño de pellet (medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] / 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina solución de [pen-strep]). </li><li> Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 100 micras de nylon para eliminar los desechos celulares. </li><li> Centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Resuspender el precipitado en 5 a 10 ml de medio de cultivo tradicionales, basados ​​en el tamaño de pellets. </li><li> Coloque 2 x 10 6 células en una placa de cultivo de 15 cm estándar y establecer cultivos primarios O / N a 37 ° C / 21% O 2, 5% de CO 2. Mantener a niveles sub-confluente para prevenir diferenciación espontánea a 37 ° C / 21% O 2, 5% de CO2 en medio de crecimiento. La densidad celular en un totalmente: NOTAconfluente placa de 15 cm es de aproximadamente 6.4 x 10 6 células. </li></ol> 2. La tinción <ol><li> ASC Cultura en medio de cultivo tradicional a 37 ° C / 21% de O 2, 5% de CO2, durante 36 horas antes de la tinción / clasificación. </li><li> ASC Ascensor de placas de cultivo utilizando Accutase (según el protocolo del fabricante). </li><li> Lave las células una vez con tampón FACS (PBS con FBS al 2% y 1% pen-strep). </li><li> Centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Resuspender las células en 0,5-1 ml de tampón FACS (dependiendo del número de células y la cantidad de anticuerpo deseado). NOTA: El volumen de la suspensión de células, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante anticuerpo FACS, determina la concentración de anticuerpo. Sin embargo, la valoración de la concentración de anticuerpo, utilizando una concentración de partida de 1: 100, se aconseja por lo general si es la primera vez que utiliza un anticuerpo. </li><li> Cuente el número total decélulas utilizando un hemocitómetro. </li><li> Reserva alícuotas de 100 ul de 1,5 ml tubos de centrifugación que se utilizarán para una muestra sin mancha y los controles de un solo color (según el número de anticuerpos fluorescentes usados). </li><li> Añadir los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia-apropiados (en concentraciones predeterminadas, según las instrucciones del fabricante) y se incuba durante 20 a 30 minutos en hielo, protegida de la luz. <ol><li> Para etiquetar subpoblación osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-humana CD105 (endoglina)) en tampón FACS a una concentración de 1:50. </li><li> Para etiquetar otras poblaciones de células (por ejemplo, hematopoyéticas y células endoteliales): Diluir anti-CD45 (Anti-CD45 humano Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-CD34 humano APC), y / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) en tampón FACS a una concentración de 1:50. </li><li> Si no está usando anticuerpos conjugados directamente, utilizar un anticuerpo primario biotinilado con un segundo conjugada con estreptavidina apropiadoary anticuerpo, tal como estreptavidina PE-Cy7, a una dilución de 1: 100. </li></ol></li><li> Después de la incubación, se lavan las células dos veces: llenar tubos con tampón FACS y se centrifuga a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 400 a 500 muestras l FACS de amortiguación y filtrar a través de un 70 micras filtro de células de nylon para eliminar grupos de células. </li><li> Transferencia de células marcadas en tubos FACS con la parte superior del filtro y mantener las muestras en hielo durante la duración de análisis. </li></ol> 3. Clasificación células activadas por fluorescencia NOTA: Los siguientes pasos exigen conocimientos previos en células activadas por fluorescencia (FACS) o la ayuda de un técnico especializado. <ol><li> Utilizando el software FACS apropiadas, las parcelas de análisis de diseño para examinar dispersión frontal (FSC), la dispersión lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Rojo, Azul Pacífico, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Allophycocyanin (APC) y cualquier otro uso fluoróforod para etiquetar células. </li><li> Antes de cargar en el clasificador de células, vórtice brevemente cada muestra para resuspender las células. </li><li> Comenzar con el análisis de la muestra sin teñir para fijar puertas para la población total de células, para excluir los desechos celulares, y para determinar la autofluorescencia de línea de base. </li><li> Añadir yoduro de propidio (PI) a la muestra sin teñir y analizar con el fin de visualizar la población de células vivas dentro de la población total de células. Construir una puerta alrededor de esta población. </li><li> Analizar una muestra de control de un solo color para cada fluorocromo con el fin de ajustar la compensación de fluorescencia. </li><li> Analizar la muestra teñida para establecer la posición de las puertas para la clasificación. </li><li> Añadir PI a la muestra teñida con el fin de teñir las células muertas. </li><li> Ordena las poblaciones de células marcadas. Ordenar en cualquiera de 1,5 ml tubos de centrífuga o tubos cónicos (15 ml) que contenía medio de cultivo. </li><li> Cesar manualmente la clasificación una vez se ha obtenido la cantidad necesaria de células. </li><li> Nosotrosing FACS, realizar una comprobación de la pureza mediante el análisis de una pequeña fracción (por ejemplo., 500 células) de la población de células adquirida. NOTA: Este paso confirma la pureza de las poblaciones de células ordenados. Idealmente, la pureza debe ser mayor que el 90-95%. </li><li> Centrifugar las células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C inmediatamente después de la finalización de la clasificación y resuspender en 1 ml de medio fresco que contiene 10% de SFB. NOTA: La cantidad de los medios utilizados se puede aumentar en función del tamaño de la sedimento celular. </li><li> Placa en placas recubiertas con gelatina para mejorar la viabilidad celular. Dependiendo del rendimiento celular final, placa 300000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos, 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos. </li></ol>

<ol><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li>
<li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li>
<li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing%3A+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li>
<li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+vitamin+D%2C+retinoic+acid%2C+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li>
<li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2Festrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720(2009).</li>
<li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+human+adipose-derived+stem+cells%3A+separating+promise+from+clinical+need%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li>
<li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Information+Theoretic%2C+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211(2011).</li>
<li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585(2013).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li>
<li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+%28hADAS%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li>
<li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li>
<li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8(2014).</li>
<li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem%2Fprogenitor+cells%3A+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene un interés financiero en cualquiera de los productos, dispositivos o medicamentos mencionados en este manuscrito. Ninguno de los autores tiene ningún interés financiero en competencia reportar.

Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones homogéneos de ASC de la SVF de tejido adiposo humano sigue siendo un reto aunque objetivo deseable. El aislamiento de subpoblaciones ASC pro-osteogénicas es particularmente deseable, ya que tales células se pueden utilizar para estudiar la formación y la homeostasis de los tejidos esqueléticos. Sin embargo, el SVF del tejido adiposo alberga heterogeneidad significativa con respecto al vástago capacidad de la célula y el potencial de diferenciación. 11 La base ...

La naturaleza heterogénea de las poblaciones de células madre aún no se comprende completamente y sigue siendo un impedimento importante para el desarrollo de aplicaciones terapéuticas basadas en células madre clínicamente efectivas. Una de las formas más comunes de caracterizar una población heterogénea de células madre es emplear un método de clasificación celular, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), para separar las células en función de sus perfiles de expresión de marcadores de superficie. A medida que los métodos de clasificación se vuelven más complejos, es posible identificar subpoblaciones funcionales de células más distintas. Las tecnologías basadas en microfluídica se utilizan cada vez con más frecuencia en el análisis de la expresión génica a nivel de célula individual. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) multiplexada dentro de un chip microfluídico permite un análisis transcripcional de una sola célula de alta resolución eficaz y fiable. De 1 a 5 años
En un estudio previo que utilizó el perfil transcripcional de una sola célula de 48 genes, se observó una considerable heterogeneidad transcripcional entre las ASC. 6 Sin embargo, la distribución de los genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibió una fuerte asociación con un grupo de células que poseen perfiles transcripcionales altamente osteogénicos. Para aislar las células de acuerdo con este perfil de expresión génica osteogénica, los patrones de expresión de antígenos de superficie se correlacionaron con los patrones de transcripción y posteriormente se descubrió que la expresión del marcador de superficie de endoglina (CD105) se correlacionaba estrechamente con un mayor potencial de diferenciación osteogénica de las ASC. Independientemente de la expresión de CD105, la expresión del receptor de superficie Thy-1 (CD90), una proteína de membrana ligada a glicosil-fosfatidilinositol que Chen et al. había demostrado previamente que estaba asociada con las células osteoprogenitoras, también se correlacionó con la expresión génica osteogénica. 6,7 Estos hallazgos brindan la oportunidad de aislar prospectivamente subpoblaciones dentro del grupo heterogéneo más grande de ASC con mayor capacidad osteogénica para aplicaciones de ingeniería de tejido óseo basadas en células.

<table><tbody><tr><td>Tubos cónicos desechables de 250 ml</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - Solución antiséptica de povidona/yodo</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, origen estadounidense</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASA Solución de Desprendimiento de Células Madre</td><td>Tecnologías de Células Madre</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Ratón Anti-Humano CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-Humano CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD45 eFluor 450 (Azul Pacífico de reemplazo)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II instrument</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y enriquecimiento de human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Las células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSCs) se consideran el estándar de oro para las aplicaciones de ingeniería de tejidos basadas en células madre. Sin embargo, el proceso por el cual deben ser cosechados puede estar asociado con una morbilidad significativa en el sitio donante. Por el contrario, las células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) son más abundantes y fáciles de recolectar, lo que las convierte en una alternativa atractiva a las BM-MSC. Al igual que las BM-MSC, las ASC pueden diferenciarse en células de linaje osteogénico y se pueden utilizar en aplicaciones de ingeniería de tejidos, como la siembra en andamios para su uso en defectos esqueléticos craneofaciales. Las ASC se obtienen de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo digerido, que es una mezcla heterogénea de ASCs, células vasculares endoteliales y murales, células musculares lisas, pericitos, fibroblastos y células circulantes. El análisis de citometría de flujo ha demostrado que el perfil del marcador de superficie para las ASC es similar al de las BM-MSC. A pesar de varios informes publicados que establecen marcadores para el fenotipo ASC, todavía hay una falta de consenso sobre los perfiles que identifican las células osteoprogenitoras en esta población heterogénea. Este protocolo describe cómo aislar y utilizar una subpoblación de ASC con capacidad osteogénica mejorada para reparar defectos críticos de la pantorrilla.

El uso de CD90 como un marcador para las células con una mejora de los resultados de la osteogénesis en el aislamiento de una población altamente enriquecido de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC se tiñeron con Pacific Blue-CD45 conjugado anti-humano, conjugado con FITC anti-CD105 humano, y CD90 anti-humano conjugado con APC. Después de la clasificación, el nivel de pureza era mayor que 98%, cuantificada por análisis post-especie. Definición de grupos de células en base a perf...

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos. Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar subpoblaciones de células madre derivadas del tejido adiposo humano con un potencial osteogénico mejorado utilizando citometría asistida por flujo para lograr esto. Las células madre derivadas del tejido adiposo humano o ASC se extraen del lipoaspirado humano y se cultivan durante 36 horas. A continuación, las células se tiñen con anticuerpos seleccionados para marcar poblaciones protoosteogénicas y las poblaciones deseadas se aíslan mediante citometría asistida por flujo.En última instancia, la tinción con fosfatasa alcalina y azarina revela un mayor potencial osteogénico de las células aisladas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la medicina regenerativa y el desarrollo de nuevas terapias traslacionales, ya que describe cómo aislar una subpoblación de ASCs con osteogénesis mejorada. El siguiente procedimiento se realiza utilizando tejido adiposo subcutáneo humano de pacientes femeninas sanas que se han sometido a una lipoaspiración electiva del abdomen, el flanco y/o la región del muslo bajo anestesia local o general.Comience con 500 mililitros a un litro de tejido en un recipiente de succión tomado directamente del quirófano. Inmediatamente después de la recolección, comience el procedimiento de cosecha. Esto maximizará la viabilidad celular para obtener la fracción vascular estromal o SVF a partir del tejido adiposo lipoaspirado. Comience agregando PBS estéril en una proporción de uno a uno.A continuación, agite suavemente el recipiente para mezclar. Después de mezclar. Deje reposar la solución hasta que se separe en tres capas.La capa superior de aceite es transparente y amarilla. La capa de grasa intermedia es viscosa, opaca y amarilla, y la capa inferior de sangre es roja. Con cuidado, con un serológico, pipete, aspire y deseche la capa inferior de sangre, aspire la capa superior de aceite.A continuación, repita esto. Lavar dos veces más. Después de preparar el tampón de digestión de colagenasa y el tampón de fax como se indica en el documento adjunto, colóquelos en la campana junto con el tampón de lisis de glóbulos rojos para que puedan calentarse a temperatura ambiente.A continuación, transfiera el tejido adiposo lavado a un matraz grande y digiera con un volumen igual de tampón de digestión de colagenasa. Coloque el matraz de forma segura en un baño de agua agitado durante 60 minutos. A 37 grados centígrados.Es mejor utilizar un recipiente de digestión de mayor volumen que el necesario, ya que esto permite la máxima digestión durante la agitación. Por ejemplo, 250 de tampón de digestión de colagenasa y 250 ml de tejido adiposo lavado deben colocarse en un matraz estéril de un litro. Después de la incubación, neutralice la actividad enzimática añadiendo un volumen igual de tampón y dejando que el tejido se asiente a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, transfiera el tejido digestivo a un tubo de centrífuga cónico desechable de 250 mililitros y centrifugue a 233 Gs, o 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, aspire el supinato y vuelva a suspender el pellet de pel agregando de cinco a 10 mililitros de crecimiento tradicional. Medio, dependiendo del tamaño del pellet.A continuación, pipetee la suspensión a través de un colador de células de nailon de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros para eliminar cualquier residuo celular. Después de descartar el sobrenadante, la paleta debería aparecer como se muestra. Aquí, Reese, suspende el paladar a 10 mililitros de temperatura ambiente.Tampón de lisis roja. Deje reposar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego centrifugue a 233 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar a 233 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar la boquilla sin alterar el pellet.Luego Resus, suspenda el pellet en cinco a 10 mililitros de crecimiento tradicional. Medio, dependiendo del tamaño del pellet. Después de contar las células, coloque 2 millones de células en un plato de cultivo estándar de 10 centímetros y establezca cultivos primarios durante la noche.Mantenga las células SVF en niveles subconfluentes para evitar la diferenciación espontánea. 36 horas después de la siembra, levante las células con Accutane de acuerdo con el protocolo del fabricante. Lave las celdas una vez con tampón de fax, luego centrifugue a 233 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después del giro, deseche la nariz sin interrumpir la bolita. Vuelva a suspender las células en 0,5 a un mililitro de efectos. Búfer. Cuente las células con un hemocitómetro.Asigne 1,2 millones de celdas a un grupo sin clasificar que se colocará por separado como control. Para este experimento, transfiera 100 cuartos de microlitro a un tubo de einor de 1,5 mililitros. Para cada muestra que se va a analizar, prepare una muestra sin teñir más controles de color individuales para cada uno de los anticuerpos que se vayan a utilizar y colóquelos en hielo.A continuación, para etiquetar la subpoblación osteogénica diluida anti CD 90 o anti CD 1 0 5 en tampón de fax para etiquetar las otras poblaciones celulares, como células hematopéyicas y endoteliales diluidas anti CD 45, anti CD 34 y o anti CD 31 en tampón de fax. Después de la incubación, lave las células dos veces llenando los tubos con tampón de fax y centrifugue a 233 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, el snat después del segundo lavado resuspende las células en 400 a 500 microlitros de efectos.Filtre las muestras a través de un colador de células de nailon de 70 micrómetros en un tubo de centrífuga para eliminar los grumos de células. Realice la clasificación de células activadas por fluorescencia como se detalla en el protocolo adjunto. Utilizando gráficos de análisis de diseño de software de hechos para examinar la dispersión hacia adelante, la dispersión lateral, el fico, el erino, el isotiocianato fluorescente azul del Pacífico rojo de Texas, el cianuro total y cualquier otro fluoruro utilizado para marcar las células.Es importante asegurarse de que los gráficos de análisis de hechos se dibujen adecuadamente para no excluir inadvertidamente las poblaciones celulares deseadas. Clasifique las poblaciones celulares etiquetadas en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros o tubos cónicos de 15 mililitros que contengan cultivo. Medio Cesa la clasificación manual.Una vez que se ha obtenido la cantidad requerida de células para este experimento, se necesitan aproximadamente 2 millones de células. A continuación, utilizando hechos, realice una comprobación de pureza analizando una pequeña fracción de unas 500 células de la población celular adquirida. Tenga en cuenta que este paso confirma la pureza de las poblaciones de células ordenadas.Idealmente, la pureza debe ser superior al 90 al 95% inmediatamente después de clasificar las celdas de centrífuga a 233 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro, medio fresco que contenga una placa de FBS al 10%, las células en placas recubiertas de gelatina para mejorar la viabilidad celular. Dependiendo de la placa de rendimiento final de la celda, 300.000 células por pocillo en una placa de seis pocillos, o 100.000 células por pocillo.En una placa de 12 pocillos para aislar el tejido adiposo humano llegan células estromales con mayor potencial osteogénico. Las ASC se tiñeron con CD 45 antihumano conjugado con azul del Pacífico, CD 1 0 5 conjugado conjugado con Fitz y CD 90 conjugado contra humanos A PC y se aislaron como se describe en este video como se muestra aquí, la clasificación en función de la alta expresión de CD 90 o baja de CD 1 0 5 produjo poblaciones altamente enriquecidas de ASC humanas para caracterizar el potencial osteogénico de las dos subpoblaciones. CD 90 positivo CD 1 0 5, ASCs bajas y no clasificadas se cultivaron en medio de diferenciación osteogénica durante 14 días como se puede observar en esta imagen.La tinción de fosfatasa alcalina, que sirve como indicador temprano de la formación ósea, aumentó en la población positiva para el cultivo CD 90 en relación con los otros grupos. La cuantificación mediante software de análisis de imágenes confirmó que la diferencia observada era significativa. Del mismo modo, en el día 14, la tinción de Aller y rojo, que se utiliza para detectar la mineralización de la matriz extracelular y sirve como métrica para la diferenciación osteogénica terminal final, se incrementó en la población CD 90 positiva en relación con otros grupos. La cuantificación mediante software de análisis de imágenes también confirmó que la diferencia observada era significativa.Estos datos indican que las ASC CD 90 positivas son capaces de mineralizar una cantidad significativamente mayor de matriz extracelular que las células no clasificadas, lo que sugiere que las ASC aisladas conservan la capacidad de experimentar diferenciación osteogénica después de la clasificación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una subpoblación de ASC con un potencial osteogénico mejorado. Al trabajar con muestras humanas como se describe en este protocolo, es importante usar siempre ropa protectora adecuada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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