Name: Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprende un método de manejo seguro para reducir el estrés en ratas del algodón durante la captura en estudios preclínicos. Esta técnica mejora el bienestar animal y la calidad de los resultados de investigación.

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Breanne Cuddington tiene una beca de la Fundación Canadiense de Cáncer de Mama. Este trabajo fue patrocinado por subvenciones operativas de la Sociedad de Investigación del Cáncer y el Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer (anteriormente la Alianza Canadiense de Investigación del Cáncer de Mama). Agradecemos a Ann Tollefson (Facultad de Medicina de la Universidad de Saint Louis) por las células LCRT y a la Dra. Kathleen Delaney y Marion Corrick por la asistencia técnica con el alojamiento y la sedación de ratas de algodón.

NOTA: Los protocolos utilizados han sido aprobados por nuestro Consejo de Ética de Investigación de Animales institucional de la Universidad McMaster de acuerdo con Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices. Los experimentos se realizaron en las instalaciones de la Universidad de McMaster Animal Central. 1. cultivar células LCRT <ol><li> Células LCRT cultivo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en frascos de cultivo de tejido T-150 a 37 ° C y 5% de CO 2. Células Passage cuando forman una monocapa 90% de confluencia (cada 2-3 días, Figura 1). </li><li> Pre-caliente 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x tripsina y medio en un 37 ° C baño de agua durante 10 min antes de la división de las células. </li><li> Aspirar medio del matraz y enjuagar las células con 5 ml de PBS 1x. </li><li> Después de enjuagar, aspirar PBS e incubarcélulas con 2 ml de 1x tripsina hasta que las células se disocian del matraz (~ 2 min). </li><li> Resuspender las células en 8 ml de medio (para un total de 10 ml de suspensión celular) y suavemente pipeta arriba y abajo para romper los grumos de células. </li><li> Mantener células en un matraz T-150 mediante la siembra de 1 ml de suspensión de células en un medio de 24 ml (para un total de 25 ml por T-150) y el frasco de roca suavemente de un lado a otro. Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta el próximo partido. </li></ol> 2. La evaluación de la replicación del virus y la citotoxicidad en células LCRT <ol><li> La replicación del virus NOTA: virus de constructos que expresan un marcador fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP), bajo el control de promotores virales endógenos facilitar la visualización de la infección y propagación del virus usando lectores de placas de fluorescencia. <ol><li> Semilla células LCRT en placas de cultivo, dejando un pozo para el conteo. Células de semillas tales que serán 80-90% confluentes un día después. Utilice una concentración de 10 5 cells / ml (100 l por pocillo) para producir la confluencia deseada un día después en placas de 96 pocillos de fondo plano. </li><li> El día siguiente, pre-caliente PBS 1x, 1x tripsina, medio completo y libre de suero en un baño de agua C 37 ° durante 10 min antes de iniciar el experimento. </li><li> Aspirar medio de las contando bien y enjuague células con 5 ml de PBS 1x oscilando por encima de la superficie del pozo. </li><li> Después de enjuagar, las células aspirado de PBS y se incuban con 2 ml de tripsina hasta que las células se disocian 1x del matraz (~ 2 min). </li><li> Resuspender las células en el volumen apropiado de medio completo para dar una densidad celular dentro de la gama contable utilizando un hemocitómetro. Para asegurar un recuento celular exacto, mezclar bien la suspensión celular antes de la inoculación del hemocitómetro pipeteando arriba y abajo. </li><li> Determinar el volumen del stock de virus necesaria para la infección en la multiplicidad deseada de infección (MOI). Requerido Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células sembradas * MOI(Pfu / célula) Volumen de reserva de virus requerido = pfu / virus requerida stock título (pfu / ml) </li><li> Preparar inóculo de virus en medio libre de suero en tubos. Mezclar bien con un vórtex o pipetear antes de añadir el inóculo a las células. </li><li> Infectar las células durante 1 hora a 37 ° C, después de lo cual se aplica un recubrimiento de mantenimiento de DMEM + 1% FBS. </li><li> Placas de escaneo uno y después de la infección de dos días (pi) para visualizar la fluorescencia de GFP. </li></ol></li><li> La citotoxicidad Virus NOTA: Realizar el ensayo de citotoxicidad resazurina en condiciones de poca luz como el compuesto es fotosensible. Un medio que contenía solamente debe ser incluido para corregir la fluorescencia de fondo. <ol><li> Preparar una solución de resazurina 5% (v / v) en PBS 1x. Mezclar la solución con la pipeta. </li><li> Aspirar medio de las células y se aplica la solución de resazurina 5%. Incluir un medio que contenía solamente para corregir la fluorescencia de fondo. </li><li> Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C, después deque lee la fluorescencia usando un lector de placas de fluorescencia (excitación 530 nm, emisión 595 nm). </li><li> Analizar la información relativa a los controles no infectados corrección para el fondo de fluorescencia. </li></ol></li></ol> 3. Vivienda y Manejo <ol><li> Vivienda y Dieta <ol><li> Las ratas del algodón Casa individual para disminuir las luchas internas en jaulas de ratas de policarbonato que contienen ropa de cama de roedores (1/8 &quot;ropa de cama de mazorca de maíz), una sección de tubo de PVC no más de 8 pulgadas y nestlets como el enriquecimiento (Figura 2). </li><li> Use una canasta de acero asegurable para sentarse overtop de la jaula y contener alimentos de roedores y una botella de agua. Nota: esta configuración permitirá jaula para la captura segura y fácil de los animales, con la colocación del tubo de enriquecimiento contra el extremo de la jaula de ser de la mayor importancia. </li></ol></li><li> Manejo <ol><li> Manejar las ratas del algodón de la mañana, antes de las rondas de los técnicos de las instalaciones de los animales para evitar emocionante antesun procedimiento. </li><li> Durante todos los procedimientos, use guantes de cuero gruesos de protección. </li><li> A medida que los animales permanecen principalmente en los tubos de enriquecimiento, los utilizan para transferir las ratas en una nueva jaula durante la limpieza de rutina. Alternativamente, abra la jaula ligeramente para permitir que el manejador de llegar en su mano, el animal puede entonces ser restringido por scruffing la piel justo por encima de los hombros y empujando hacia abajo. Cuidado de Práctica no utilizar fuerza excesiva ya que el animal puede morder la lengua. </li><li> Sea paciente y utilizar una mano firme ya que los animales tienen una fuerte respuesta de huida o lucha y tratarán de evitar ser capturado por correr y saltar fuera de la jaula. Es importante destacar que no se ocupan de los animales por la cola como ocurrirá degloving. </li><li> Trampa los animales en sus tubos enriquecimientos más de manipulación directa. Esto disminuye drásticamente las lesiones y escapar. </li></ol></li></ol> 4. Captura y Anestesia <ol><li> Captura <ol><li> Use guantes de cuero gruesos para protegerion durante todos los procedimientos. </li><li> Utilice un recipiente grande de plástico transparente con agujeros para el aire y una tapa, una cámara de inducción de anestesia lo suficientemente grande para encajar el recipiente y un cono de nariz montado en el tubo de salida de gas (Figura 3). </li><li> Trabajar en parejas para hacer el procedimiento más eficiente y disminuir el tiempo de exposición de los animales al isoflurano, un anestésico de inhalación. Asegúrese de que un investigador es responsable de la apertura y la sustitución de la cubierta de acero de la jaula y la tapa de la cámara de inducción (controlador # 1) y su asociado es responsable de la captura del animal en el tubo y el transporte a la cámara de inducción (controlador # 2). </li><li> Colocar la jaula en una superficie plana y quitar la tapa exterior. Levante la bandeja de alimentación de acero ligeramente y lentamente maniobrar el tubo de enriquecimiento de manera que quede paralelo con los lados de la jaula y contra la parte posterior. Si es necesario, utilizar un objeto para maniobrar el tubo de enriquecimiento sin necesidad de abrir la jaula para evitar agitar el animal (manejarr # 1). </li><li> Si el animal se vuelve agitado y sale del tubo, dar tiempo suficiente para que el animal se relaje y una vez más se instalan en el tubo (manejador # 1). </li><li> Lentamente y deliberadamente levantar el borde más alejado de la cubierta de acero del tubo de enriquecimiento, manteniendo el otro extremo en contacto con la jaula. Hacer un espacio lo suficientemente grande para que el recipiente de plástico (controlador # 2). </li><li> En un movimiento suave y rápido, empuje el recipiente de plástico overtop del tubo de enriquecimiento. Mantener el contacto del recipiente con el lado de la jaula, atrapando el animal en el tubo. Realice los pasos 4.1.6 y 4.1.7 lo antes posible (manejador # 2). </li><li> Retire la bandeja de alimentación de acero y dar la tapa de plástico contenedor al controlador # 2 (controlador # 1). Deslice la tapa de plástico entre el lado de la jaula y el contenedor, siendo consciente de apéndices del animal atrapado en el proceso. No selle el envase, ya que esto hará que el siguiente paso más difícil (manejador # 2). </li></ol></li><li> AnesthesIowa <ol><li> Asegúrese de que el contenedor permanece cerrado y el transporte de los animales a la cámara de inducción. Colocar rápidamente el animal en la cámara y retirar la tapa del recipiente en un movimiento fluido (controlador # 2). Abra y vuelva a colocar inmediatamente la tapa de la cámara de inducción (manejador # 1). </li><li> Encienda el flujo de isoflurano a la cámara de inducción (5 L / min) y monitorear el animal para detectar signos de letargo, en cuyo punto se deslizan rápidamente el animal desde el tubo y el recipiente, la eliminación tanto de la cámara de inducción para facilitar la circulación de gas. </li><li> Cuando la rata está totalmente anestesiado, moverlo a la superficie de trabajo y colocar la nariz y la boca en el cono de la nariz (Figura 3). La rata está totalmente anestesiado cuando no responde a una pizca dedo contundente. </li><li> Coloque vaselina veterinario pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad y abrasiones. Este es un paso esencial como las ratas del algodón cuentan con grandes ojos que pueden ser propensos a la infección si se produce una lesión. </li> &lt;li&gt; monitorear cuidadosamente y mantener una tasa de respiración constante y asegúrese de que la nariz del animal permanece en la instalación durante todo el procedimiento cono de la nariz. Ajustar la velocidad de flujo de isoflurano adecuadamente. La cantidad de isoflurano requiere para anestesiar a cada animal variará. </li><li> Después del procedimiento, devolver el animal a su jaula y asegúrese de que recupere la movilidad completa y decúbito esternal. </li></ol></li></ol> 5. Preparación de las células LCRT para la formación de tumores subcutáneos NOTA: Una T-150 frasco de LCRT (90% de confluencia) produce aproximadamente 2 x 10 7 células. Basar el número de T-150 frascos requeridos sobre el número total de células necesarias. Semillas frascos adicionales para asegurar el número total de células requerida se obtiene y para acomodar las células perdidas durante la preparación y los necesarios para inyecciones adicionales. Mantener las células en hielo siempre que sea posible para prolongar la viabilidad celular. <ol><li> Para cosechar las células, medio aspirado desde el un matrazd células enjuague con 5 ml de PBS 1x. </li><li> Aspirar PBS e incubar las células con 2 ml de 1x tripsina hasta que las células se disocian del matraz (~ 2 min). </li><li> Resuspender las células en 8 ml de medio (para un total de 10 ml de suspensión celular) y suavemente pipeta arriba y abajo para romper los grumos de células. Continuar para cosechar las células de los matraces adicionales. </li><li> Piscina todo suspensiones de células en un tubo cónico, aproximadamente 4 T-150 por cada 50 ml tubo cónico. </li><li> Centrifugar el tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar medio y volver a suspender el sedimento celular en el volumen apropiado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para producir una densidad celular dentro de la gama contable utilizando un hemocitómetro. Para asegurar un recuento celular exacto, mezclar bien la suspensión celular antes de cargar el hemocitómetro pipeteando arriba y abajo. </li><li> Calcular el número total de células: Número total de células recogidas = recuento de células (células / ml) x resuspensión volumen (ml) </li><li> Determinarel volumen de suspensión de células requerido para todas las inyecciones. Hacer 2-3 dosis adicionales por experimento. Un total de 5 x 10 5 células inyectadas subcutáneamente LCRT formará tumores palpables dentro de 3-4 días. Número total de células requeridas = 5 x 10 5 células x número total de dosis Suspensión de células volumen requerido (ml) = (células totales requeridos * suma de los volúmenes de inyección) / (número total de células recogidas) </li><li> Pipetear el volumen requerido de la suspensión celular en un tubo cónico que contenía PBS y mezclar bien. Alícuotas inyecciones individuales (100 l) en tubos Eppendorf. Mantener los tubos en hielo durante el procedimiento de inyección. </li></ol> 6. Inyecciones NOTA: Realizar procedimientos con dos investigadores, uno para realizar las inyecciones, mientras que los otros monitores de la tasa de respiración del animal y el estado general, mientras que bajo anestesia. Utilice jeringas de insulina (29 G x 2.1 &quot;, 0.3 ml) para todas las inyecciones y una aguja nueva paracada animal. <ol><li> Las inyecciones subcutáneas <ol><li> Captura y anestesiar al animal (sección 4). </li><li> Afeitar el sitio de la inyección usando las podadoras. Piel de rata algodón es gruesa y requiere un condensador de ajuste afilado para obtener una superficie lisa para inyecciones. Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70%, utilizando un hisopo de algodón y deje que se evapore antes de proceder. </li><li> Jeringas de carga (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) con las células mediante la elaboración lenta y constantemente. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje el émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja. </li><li> Levante la piel en el lugar de la inyección (denominado persistencia del pliegue cutáneo) e inserte el bisel de la aguja hacia arriba. Asegúrese de que la aguja se mueve libremente debajo de la piel para evitar la inyección intramuscular. </li><li> Expulsar el contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente. Retirar el lado bisel de la aguja hacia abajo. </li></ol></li><li> Inyecciones intratumorales <ol><li> Captura de unad anestesiar al animal (sección 4). </li><li> Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70%, utilizando un hisopo de algodón y deje que se evapore antes de proceder. </li><li> Jeringas de carga (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) con el inóculo de virus mediante la elaboración lenta y constantemente mientras se mantiene la aguja en posición vertical. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje entonces émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja. </li><li> Insertar el lado bisel de la aguja hacia el tumor y expulsar el contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente mientras se mueve la aguja en un patrón en forma de abanico, retirando parcialmente la aguja antes de cada movimiento para evitar laceración del tumor. Retirar el lado bisel de la aguja hacia abajo. NOTA: Los tumores subcutáneos son LCRT, alcanzando aproximadamente 100 mm 3 en 5-7 días de rápido crecimiento. Además, los centros necróticos y hemorrágicos a menudo se forman en la superficie del tumor dentro de varios días y requieren camonitoreo REFUL (Figura 4). </li></ol></li><li> Las inyecciones intraperitoneales <ol><li> Captura y anestesiar al animal (sección 4). </li><li> Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70% utilizando hisopos de algodón y deje que se evapore antes de proceder. </li><li> Jeringas de carga (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) con la droga mediante la elaboración lenta y constantemente. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje entonces émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja. </li><li> Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen. Tire hacia atrás del émbolo para asegurarse de que la sangre o las heces no son aspirados, esto indica una incorrecta colocación de la aguja. Si esto ocurre, retire la aguja y preparar una nueva jeringa. Cuando la aguja se coloca correctamente, expulsar contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente. </li></ol></li></ol> 7. Tumor Escisión y Necropsia <ol><li> Recoger y limpiar all herramientas con etanol al 70% antes de la eutanasia del animal. </li><li> La eutanasia a los animales por el método deseado, se recomienda inhalación de CO2 (2 l / min durante 5 a 10 minutos). Examine el animal para detectar cualquier anormalidad en la condición corporal. </li><li> Colocar el animal en decúbito dorsal sobre una tabla de disección y limpiar el animal con etanol al 70%. </li><li> Utilice las pinzas para levantar la piel en la parte inferior del abdomen. Corte a través de la piel y el músculo con unas tijeras y hacer una incisión medial que recorre la longitud del animal (ano a la barbilla). </li><li> Cortar la caja torácica haciendo dos cortes, uno lateralmente por el lado de la caja torácica y uno a través del esternón para exponer el corazón y los pulmones. Examine los lóbulos del pulmón para cualquier metástasis 27,29. </li><li> Examinar todos los órganos de anomalías y registrar cualquier cambio en el color, tamaño y consistencia. Si es necesario, los órganos incisión con un escalpelo para examinar los tejidos internos. Específicamente, examinar el hígado, los riñones, el bazo y el tracto gastrointestinal. </li><li> Inspeccione los ganglios linfáticos de las metástasis y la ampliación 27,29. </li><li> Para recoger el tumor, hacer incisiones flanco encima y debajo del tumor de tal manera que la piel puede ser arrancada del cuerpo con pinzas. Mientras sujeta firmemente la piel con pinzas, utilizar un bisturí para quitar cuidadosamente el tumor cortando entre el tumor y la dermis (Figura 5). </li><li> Colocar inmediatamente el tumor en un recipiente etiquetado de 10% de formalina tamponada neutral. </li><li> Dependiendo del tamaño del tumor, de 1-2 días (≤ 2 mm, pequeñas) o 5-6 días (&gt; 2 mm, grande) para la fijación de las secciones antes de preparar para el análisis histológico (Figura 6). </li></ol>

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</ol>

Los autores reconocen que no hay conflictos de intereses financieros relacionados con esta investigación.

Las ratas algodoneras son muy excitables y tienen una fuerte respuesta de vuelo. Por lo tanto, se debe tener especial cuidado para minimizar cualquier estrés indebido en el animal. La configuración de la jaula descrita permitirá la captura segura y fácil de los animales, siendo la colocación del tubo de enriquecimiento de suma importancia. Al configurar las jaulas, asegúrese de que los tubos de enriquecimiento cumplan con los requisitos de tamaño y forma, y estén colocados en la orientación adecuada en la jaula. También ...

Virus oncolíticos (OV) se replican selectivamente en las células tumorales mediante la explotación de las diferencias bioquímicas entre células normales y tumorales 1,2. Hay dos tipos de VO: aquellos que no requieren una mutación para lograr oncolisis selectivo, denominado naturales virus de tipo salvaje y aquellas que deben ser diseñados para lograr oncolisis selectiva. La colección de mutaciones dentro de un tipo de tumor dado determina la naturaleza de la ventaja de crecimiento selectiva sobre las células normales para un OV 2. La seguridad y el beneficio de utilizar VO se ha demostrado en ensayos clínicos 3-7. A pesar de los avances en el campo de la virotherapy oncolítico existen brechas entre los resultados preclínicos y clínicos, lo que sugiere que se necesitan mejores modelos para evaluar la eficacia antitumoral de VO. Virus del herpes bovino tipo 1 (BHV-1) es un miembro de la familia Herpesviridae, subfamilia y Alphaherpesviridae. BHV-1 iniates bovina complejo de la enfermedad respiratoria en ganado, que se manifiesta en una amplia variedad de síntomas similares a un resfriado 8,9. BHV-1 se une a receptores de fijación y de entrada utilizados por HSV-1, tales como el sulfato de heparán y nectin-1 10. Sin embargo, se une CD155 en el lugar de nectin-2 10. BHV-1 tiene una gama de huéspedes muy estrecha de tal manera que es incapaz de entrar e iniciar eficazmente la replicación en células murinas normales y transformadas 3,4,10. Esto hace que el uso de modelos murinos convencionales problemático. La capacidad oncolítico del BHV-1 se ha demostrado in vitro 11,12. BHV-1 se ha demostrado para iniciar la replicación en y matar células tumorales humanas de una variedad de orígenes histológicos, incluyendo las células de cáncer de mama y el cáncer de mama células iniciar 11,12. Sin embargo, la capacidad antitumoral de BHV-1 debe ser evaluado in vivo en el contexto de un huésped inmunocompetente. Adenovirus humano (Ad), para lo cualhay 57 serotipos identificados, más comúnmente causa enfermedades respiratorias en los seres humanos. Vectores de Ad oncolíticos han sido evaluados por su eficacia antitumoral con varios avanzar en ensayos clínicos 13-15. A pesar de los datos pre-clínicos prometedores, los resultados clínicos han estado a la altura de las expectativas. Modelos de xenoinjertos de tumores humanos se suelen utilizar para estudiar la eficacia antitumoral de vectores de anuncios, aunque presentan atenúan la respuesta inmune al virus 16,17. Además, los modelos murinos singénicos no son permisivas a la infección del anuncio, por lo que la evaluación de las respuestas inmunitarias del huésped que utilizan estos modelos impracticables 17,18. El sistema inmune del huésped ha sido identificado como el mecanismo más influyente por el cual VO provocan la muerte de las células tumorales 19. Respuestas antitumorales entre tolerizado y el antígeno asociado a tumor no tolerizado modelos (TAA) son diferentes y pueden afectar en gran medida el éxito de la terapia OV. El HSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 en 1814 20) 20,21 provocó la regresión del tumor en el 80% de los ratones portadores de tumor en un modelo de cáncer mamario de antígeno T medio del polioma murino 22. Sin embargo, en HER-2 modelos / neu, la eficacia antitumoral de KM100 varió entre el 20% de regresión completa en ratones singénicos y estasis del tumor en ratones transgénicos, los ratones HER2 hacer tolerante. En conjunto, estos datos ponen de relieve la importancia de evaluar plenamente VO utilizando modelos animales que mejor se recapitulan el paisaje inmunológico humano para entender completamente qué características determinan el éxito terapéutico. La rata algodonera (Sigmodon hispidus), indígena de Norte y Sur América, es más comúnmente utilizado como un modelo de infección por el virus sincitial respiratorio (tal como fue revisado en 5). Ratas del algodón también se utilizan en-BHV-1 Investigación de la vacunación contra, ya que recapitulan la patología asociada con la enfermedad respiratoria bovina complejo 6,23. Además, BHV-1 infección de ratas del algodónes inmunogénica, la inducción de la mucosa sostenido y respuestas inmunes sistémicas 6,23-25. Las líneas celulares se han derivado de fibrosarcoma espontánea y osteosarcomas de la glándula mamaria (LCRT) y el hueso (CCRT y VCRT), respectivamente 26. Ratas del algodón se han utilizado para evaluar la eficacia in vivo de vectores de Ad oncolíticos, ya que son susceptibles a la infección por Ad y exhiben patología similar a los seres humanos 27-29. El uso de modelos inmunocomprometidos para la evaluación preclínica de VO no sólo son menos indicativo de una respuesta clínica a la terapia pero no tienen en cuenta el papel del sistema inmune en virotherapy oncolítico 30,31. Por lo tanto, los modelos de rata de algodón tolerantes a tumores de carcinoma mamario y osteosarcoma singénico y son modelos pertinentes en los cuales evaluar la eficacia pre-clínica de VO, tales como BHV-1 y Ad que no puede ser estudiada usando modelos murinos convencionales.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Puede usar cualquier marca&nbsp;</td></tr><tr><td>1X solución salina tamponada con fosfato &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Puede preparar en el laboratorio, filtrar para esterilizar</td></tr><tr><td>200 mM de L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>100x Antibiótico-Antimicótico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>T-150cm2 matraz de cultivo</td><td>de tejidos Fisher Scientific</td><td>14-826-80</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>1X TypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 12 pocillos, fondo plano</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td>Puede usar cualquier marca, debe ser tratado con cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Life Tecnologías</td><td>DAL1025</td><td>Puede utilizar un reactivo alternativo para la determinación de la viabilidad celular</td></tr><tr><td>8640 Teklad 22/5 Dieta para roedores</td><td>Harlan&nbsp;</td><td>8640</td><td></td></tr><tr><td>1/8" lecho para roedores de mazorca de maíz</td><td>Harlan</td><td>7092</td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare-Hecho</td><td></td> <td>de fibra de algodón virgen despulpada, libre de polvo y esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>50 mL Tubos cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Puede usar cualquier marca, debe ser estéril</td></tr><tr><td>Isoflurano USP, 99.9 %, anestésico inhalatorio</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td>Puede preparar en laboratorio</td></tr><tr><td>10 % Formalina tamponada neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>NAPCO NapFlow 1200 Clase II A/B3 Bioseguridad Cabina de seguridad microbiológica (campana de cultivo celular)</td><td>NAPCO</td><td>Modelo usado no disponible actualmente</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific Baño de agua caliente de precisión</td><td>Fisher El modelo científico</td><td>utilizado no está disponible actualmente&nbsp;</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Typhoon Trio BioAnalyzer&nbsp;</td><td>El modelo de ciencias de la vida de GE Healthcare</td><td>utilizado no está disponible actualmente&nbsp;</td><td>Puede utilizar cualquier lector de placas de fluorescencia</td></tr><tr><td>Tecan Safire2 Lector de microplacas de detección múltiple Tecan Model</td><td></td><td>usado no disponible actualmente&nbsp;</td><td>Puede utilizar cualquier lector de placas de fluorescencia</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa Allegra 6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia de mesa</td><td>VetEquip</td><td>Modelo usado no disponible actualmente&nbsp;</td><td>Puede usar cualquier marca, debe ser portátil</td></tr><tr><td>Wahl Peanut Mini Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td>Puede usar cualquier marca de cortaúñas pequeñas</td></tr><tr><td>Jeringas de insulina 29 G x 1/2', 0.3 mL</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Puede usar cualquier marca. Se recomiendan las jeringas de insulina, ya que facilitan las inyecciones a través de la rata. s piel dura.&nbsp;</td></tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>MedPro</td><td>018-425</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Tijeras de disección de punta afilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Pinzas de tejido de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr></tbody></table>

manejo de la rata del algodón en estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Los virus oncolíticos son una novedosa terapia contra el cáncer con la capacidad de dirigirse a las células tumorales, dejando intactas las células sanas. Para que esta estrategia tenga éxito, estudios recientes han demostrado que la implicación del sistema inmunitario del huésped es esencial. Por lo tanto, la viroterapia oncolítica debe evaluarse en el contexto de un modelo inmunocompetente. Además, el estudio de las terapias antitumorales en modelos animales tolerados puede recapitular mejor los resultados observados en los ensayos clínicos. Las ratas algodoneras, comúnmente utilizadas para estudiar los virus respiratorios, son un modelo atractivo para estudiar la viroterapia oncolítica, ya que los modelos singénicos de carcinoma mamario y osteosarcoma están bien establecidos. Sin embargo, hay una falta de información publicada sobre el procedimiento de manejo adecuado para estos roedores altamente excitables. El enfoque de manejo y captura descrito minimiza el estrés de los animales para facilitar la experimentación. Esta técnica depende de la capacidad del investigador para mantener la calma durante el manejo y realizar los procedimientos de manera oportuna. Finalmente, describimos cómo preparar las células tumorales mamarias de rata algodonera para la formación consistente de tumores subcutáneos, y cómo realizar inyecciones intratumorales e intraperitoneales. Estos métodos se pueden aplicar a una amplia gama de estudios que promueven el desarrollo de la rata algodonera como un modelo preclínico relevante para estudiar la terapia antitumoral.

Debido a la naturaleza extremadamente excitable de las ratas del algodón, estar familiarizado con y utilizar procedimientos optimizados para reducir el estrés de los animales facilitará en su uso como un modelo animal preclínico. El uso de técnicas de manejo adecuadas también reducirá al mínimo el riesgo para el investigador. Al utilizar las ratas del algodón es imprescindible para mantener la calma. Las ratas son muy excitables y tratarán de escapar de su jaula. El uso de un tubo de enrique...

Las ratas de algodón son extremadamente excitables y tienen una fuerte respuesta de huida o lucha. Se describe un método de manejo optimizado para reducir el estrés de los animales que hará que las ratas de algodón sean más accesibles como modelo preclínico.

Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el manejo y la captura seguros de ratas algodoneras utilizando un método específico destinado a reducir el estrés experimentado por el animal. Esto se logra colocando primero un tubo de enriquecimiento contra el extremo de una jaula para ratas y una canasta de acero asegurable en la parte superior. En el segundo paso, se le coloca el equipo personal de protección adecuado y se permite que el mocoso de algodón se arrastre dentro del tubo de enriquecimiento.A continuación, el tubo se sujeta contra el lateral de la jaula y el animal atrapado se transfiere rápidamente a un recipiente de plástico con orificios de aire para su transporte a la cámara de inducción anestésica. En el paso final, se coloca sobre el animal un cono de nariz especial específicamente diseñado para el hocico de mocoso algodonero para facilitar la sedación completa. En última instancia, este procedimiento de captura se puede utilizar para manipular de manera segura a los mocosos de algodón de una manera que disminuya su estrés y aumente su seguridad.Cuando se utilizan estos roedores altamente excitables en estudios preclínicos, generalmente las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a las discrepancias en la literatura con respecto al manejo, alojamiento y comportamiento de la rata de algodón. La demostración visual de este método es fundamental para complementar los relatos escritos y preparar a los investigadores para los desafíos de comportamiento al trabajar con ratas de algodón. Para demostrar el procedimiento, Brianne Cuttington, una estudiante de posgrado, y Megan er, una becaria postdoctoral de mi laboratorio. Para disminuir las peleas, alojé a las ratas de algodón individualmente en jaulas de policarbonato que contenían un lecho de mazorca de maíz de un octavo de pulgada, una sección de tubo de PVC de no más de ocho pulgadas y niditos para el enriquecimiento para permitir la captura segura y fácil de los animales.Coloque el tubo de enriquecimiento contra el extremo de la jaula y luego coloque una canasta rancia asegurable sobre la parte superior de la jaula que contiene comida para roedores y una botella de agua. Ahora reúna un recipiente grande de plástico transparente con orificios para el aire y una tapa y una cámara de inducción de anestesia, lo suficientemente grande como para que quepa el recipiente y un cono de nariz colocado en la manguera de salida de gas. Tenga en cuenta que el mocoso de algodón tiene un hocico alargado que requiere una forma diferente para administrar el gas anestésico como se muestra en esta imagen de un cono de nariz, diseñado para adaptarse correctamente a una rata de algodón que trabaja en parejas.Los investigadores deben ponerse guantes de cuero gruesos para protegerse durante todas las partes del procedimiento. Cuando ambos investigadores estén listos, coloque la jaula del animal sobre una superficie plana y retire la tapa exterior. Luego, cuando el animal esté dentro del tubo de enriquecimiento, levante ligeramente la bandeja de alimentación de acero y maniobre lentamente el tubo hasta que quede paralelo a los lados de la jaula y contra la espalda.A continuación, levante lenta y deliberadamente el borde de la cubierta de acero más alejado del tubo de enriquecimiento, manteniendo el otro extremo en contacto con la jaula. Pida al segundo investigador que haga un espacio lo suficientemente grande para el recipiente de plástico. Luego, con un movimiento suave y rápido, empuje el plástico y el recipiente sobre el tubo de enriquecimiento.Mantenga el contacto del recipiente con el costado de la jaula atrapando al animal en el tubo. Al manipular las ratas de algodón, es importante tener paciencia y usar una mano firme, ya que los animales tienen una fuerte respuesta de huida o lucha, y tratarán de evitar ser capturados corriendo y saltando fuera de la jaula. Si un animal se escapa, evite manipularlo por la cola.Como puede ocurrir el desengrasado, retire la bandeja de alimentación de acero y entregue la tapa del recipiente de plástico al otro investigador. A continuación, deslice la tapa de plástico entre el lateral de la jaula y el recipiente. Estar atento a los apéndices del animal atrapado en el proceso y cerrar, pero no sellar el contenedor, asegurándose de que el contenedor permanezca cerrado.Transportar al animal a la cámara de inducción. Luego, haga que un investigador coloque rápidamente al animal en la cámara y retire la tapa del recipiente con un movimiento de fluido mientras el otro abre e inmediatamente reemplaza la tapa de la cámara de inducción. Finalmente, después de la administración de la anestesia, regrese a la rata a su jaula con monitoreo hasta que el animal recupere la movilidad completa y la recuperación esternal.La inyección de células tumorales viables es importante para la formación adecuada del tumor. En esta imagen, se muestra una monocapa sana de células LCRT que se pueden preparar para inyectar en mocosos de algodón. Por el contrario, estas células LCRT tienen una baja viabilidad y no deben utilizarse para inyecciones.Los tumores formados a partir de células LCRT son de crecimiento rápido y, como resultado, a menudo se forman centros necróticos como tales, la formación de tumores debe controlarse cuidadosamente para evitar ulceraciones. Si se produce ulceración, el animal debe ser sacrificado para evitar la infección y la posible muerte por sepsis. Mantener la integridad del tejido tumoral después de la escisión dará como resultado una muestra que es una representación más precisa del tumor in vivo.Por ejemplo, aquí, se muestra una técnica de escisión mediante la cual el tumor se separa cuidadosamente del tejido circundante con un bisturí y pinzas, como se muestra en esta imagen final. La estructura densa y altamente vascularizada del tumor se mantiene mediante esta técnica de escisión, que es importante para el análisis de los tratamientos que afectan a la vasculatura tumoral. Como es el caso de muchos virus oncolíticos, al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la calma y realizar cada paso lenta y deliberadamente para evitar agitar a las ratas de algodón.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar y manejar de manera segura a las ratas de algodón.

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Ataque a tumores hepáticos con virus oncolíticos a través de la arteria hepática

Este video muestra el procedimiento de inyectar virus quiméricos del VIH en la corteza del cerebro de una rata, donde el ARN del virus se integra en el genoma del huésped, se replica y se propaga para establecer una infección activa por el VIH en el modelo experimental.

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Este protocolo describe cómo silenciar temporal y remotamente la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras las ratas realizan tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma conductual (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre los diferentes componentes del aprendizaje.

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Las viroterapias oncolíticas están en desarrollo como nuevas terapias para el tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC).  En este trabajo describimos un método para el tratamiento locorregional del CHC mediante la administración arterial hepática de virus oncolítico.

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Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

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Aquí se describe un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para descubrir destinos host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos, específicamente rhabodvirus y vaccinia virus terapia, pero puede adaptarse fácilmente a otros oncolíticos plataformas de virus o para descubrir genes de host que modulan generalmente replicación del virus.

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Hemos desarrollado un protocolo para la generación y evaluación de un modelo de ratón NOG infectado por el virus de inmunodeficiencia humana y humanizado basado en el trasplante de células madre, la exposición al virus de inmunodeficiencia humana intravaginal y el ARN PCR digital de gotas Cuantificación.

Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un nuevo modelo de rata de infección activa por VIH usando VIH quimérico (EcoHIV), que es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro y ofrecer un sistema para estudiar los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y las comorbilidades asociadas (es decir, el abuso de drogas).

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Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

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