Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

El objetivo general del siguiente experimento es validar el uso de una cepa que expresa luciferasa para el monitoreo no invasivo de la formación de biopelículas in vivo por células de Candida albican. Esto se logra mediante la implantación de fragmentos de catéter colonizados con una luciferasa que expresa una cepa de Candida albicans en la espalda de un ratón. Durante el segundo paso, se permite que la levadura crezca hasta convertirse en una capa gruesa de células incrustadas dentro de una matriz extracelular, generando una biopelícula madura en el interior de los catéteres.

A continuación, se añade un sustrato que será convertido por la enzima luciferasa. Esta reacción produce luz medible: Las imágenes bioluminiscentes o BLI se utilizan para registrar y cuantificar la formación de la biopelícula dentro del huésped vivo. La principal ventaja de esta técnica frente a otras técnicas existentes, como el sistema central Venmo, es que podemos testear hasta seis biofilms dentro de un animal, reduciendo así en gran medida el número de animales que requerimos para el análisis estadístico.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la formación de biopelículas de Candida albicans, ya que nuestro método permite probar fácilmente los componentes antifúngicos existentes y nuevos. Además, este método puede proporcionar información sobre las biopelículas fúngicas de Candida albicans. También se puede aplicar a otros microbios como bacterias u otras especies divertidas.

Los procedimientos propuestos son fáciles de implementar en cualquier laboratorio que tenga acceso a un animalario 24 horas antes del procedimiento quirúrgico abierto el paquete que contiene los catéteres de triple lumen dentro de un gabinete de seguridad biológica. Use pinzas estériles para quitar todas las partes innecesarias y un bisturí estéril para cortar la parte unida al catéter. Luego coloque una regla debajo del paquete de plástico y corte el catéter de poliuretano en trozos de un centímetro de largo.

A continuación, llene cada catéter con aproximadamente 1,8 mililitros de suero bovino 100% fetal e incube las piezas a 37 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera cada pieza de catéter recubierta de suero a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros y raspe C. albicans de una placa YPD a un mililitro de PBS en un tubo de microcentrífuga separado en una dilución de uno a 100. Después de contar, diluya la suspensión celular a una concentración final de cinco veces 10 a la cuarta celdas por mililitro.

Y añadir un mililitro de células a cada una de las piezas del catéter recubierto de suero. Deje que las células se adhieran a los catéteres durante 90 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, sujetando los tubos en posición vertical con pinzas estériles.

Enjuague suavemente cada pieza a través del lumen dos veces con un mililitro de PBS para colocar los catéteres. Comience afeitando la parte inferior de la espalda de una rata anestesiada de ocho semanas de edad colocada en una almohadilla térmica. A continuación, desinfecte la piel y haga una pequeña incisión de 0,5 a un centímetro a cada lado del animal.

A continuación, disecciona el subcu con unas tijeras para crear dos túneles subcutáneos de aproximadamente 1,5 centímetros de largo y un centímetro de ancho. Inserte tres piezas de catéter en cada túnel asegurándose de que las piezas queden una al lado de la otra en una disposición horizontal sin superponerse. Cierre las incisiones con suturas y luego limpie las heridas muy suavemente con un desinfectante.

A continuación, aplique un anestésico local directamente sobre las incisiones y administre un agente reversor de la anestesia para vigilar a los animales hasta que se recuperen por completo. Para obtener imágenes de la formación de la biopelícula en el momento experimental apropiado, inyecte 100 microlitros de espiral y terezina recién preparados por vía subcutánea en cada área que contiene los catéteres en un animal anestesiado. A continuación, adquiera escaneos consecutivos con tiempos de adquisición que oscilan entre 20 y 60 segundos hasta alcanzar la intensidad máxima de la señal.

Durante la adquisición del siguiente fotograma, coloque una región de interés sobre cada trío de catéteres para medir la imagen bioluminiscente o la intensidad de la señal BLI de los fotogramas adquiridos previamente. Coloque una región rectangular de interés de tamaño fijo en una región de control para medir la señal de fondo en el software de imagen viva. Mida el flujo de fotones a través de las regiones de interés para cada trío de catéteres, así como para el fondo.

Después de repetir estas mediciones para cada animal y en diferentes puntos de tiempo durante la formación de la biopelícula, el informe de la intensidad de la señal BLI de cada catéter se expresa como flujo de fotones por segundo. Los datos se pueden copiar y pegar directamente en un programa de hoja de cálculo. Al final del experimento longitudinal, sacrifica cada animal que corta el tejido subcutáneo y utiliza pinzas estériles para retirar los fragmentos del catéter uno por uno.

Lave los catéteres dos veces en un mililitro de PBS como se acaba de demostrar. A continuación, sonicar las piezas en un nuevo tubo de microcentrífuga en un mililitro de PBS fresco a 40.000 hercios en un baño de agua. Sonicar después de 10 minutos, colocar los tubos que contienen los catéteres en hielo y colocar 100 microlitros de las muestras originales en diluciones de uno a 10 y de uno a 100 en placas de agar YPD.

por duplicado. Por último, represente la media y la desviación estándar de las unidades formadoras de colonias. Y la señal BLI para cada animal en una escala logarítmica.

En esta imagen, se muestra un animal representativo que muestra la señal de bioluminiscencia junto con una región de interés denotada seis días después del desarrollo de la biopelícula. Nótese la falta de señalización en el área de fondo de control que confirme la limitación de la biopelícula a las áreas inmediatamente adyacentes a los catéteres recubiertos de cándida. En este experimento representativo, se puede observar una clara señal BLI producida por la luciferasa que expresa biopelículas, mientras que solo la señal de fondo parece ser producida por la cepa de tipo salvaje.

Este aumento de la señal sigue la misma tendencia que el aumento de las unidades formadoras de colonias por biopelícula y las mediciones del flujo de fotones para cada grupo de animales en conjunto. Estos datos ilustran que BLI es una técnica poderosa para monitorear y cuantificar in vivo la formación de biopelículas de C. albicans maduro en un modelo de ratón subcutáneo. Una vez dominada, la infección de los dispositivos con células de cándida puede tardar dos horas, mientras que el implante del catéter se puede realizar en 10 minutos por ratón.

Las imágenes BLI se pueden realizar en cinco minutos por ratón. La gran ventaja de usar BLI es que se puede monitorear el desarrollo de biomasa y biopelícula repetidamente en el mismo animal. Con el tiempo Después de este procedimiento, otros métodos como la resonancia magnética o la tomografía computarizada pueden proporcionar información sobre la posición exacta de la catedral.

Esta información se puede utilizar para la cuantificación en modelos más complejos como el modelo de la catedral de la veta profunda. Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo realizar biopelícula subcutánea in vivo, ss en ratones, y esto puede formar la base para un análisis más profundo de las interacciones entre el huésped y el patógeno.