Name: Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a monitorear biopelículas de Candida albicans en ratones mediante imagen de bioluminiscencia. Este método permite cuantificar formación de biopelículas in vivo y evaluar terapias antifúngicas.

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Este trabajo fue apoyado por el KU Leuven PF 'IMIR', la comunidad de investigación de FWO en biología y ecología de biopelículas bacterianas y fúngicas (FWO: WO.026.11N) y por el proyecto FWO G.0804.11. SK agradece a KU Leuven por la beca PDMK 11/089 y a FWO por la beca postdoctoral. Agradecemos a Nico Vangoethem su ayuda en la preparación de las figuras. Queremos agradecer a Celia Lobo Romero por su asistencia técnica durante los procedimientos experimentales in vivo.

NOTA: Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el comité de ética de la Universidad Católica de Lovaina (proyecto número 090/2013). Mantener los animales, de acuerdo con las directrices de cuidado de animales KU Leuven. 1. C. Crecimiento albicans <ol><li> Veinticuatro horas antes de la iniciación del experimento animal, preparar placas de YPD mediante la adición de 10 g de extracto de levadura granulada, 20 g de peptona bacteriológica, y 15 g de agar granulado. Invente volumen a 900 ml con agua Milli-Q y autoclave. </li><li> Añadir 50 ml de 40% de glucosa estéril. Mezclar bien y verter en placas de Petri. Deja placas de agar se enfríe y solidifique. NOTA: En este estudio, utilizar dos cepas, es decir, de tipo salvaje C. albicans SC5314 - cepa Gluc negativo (denominado WT) y C. albicans SKCA23 cepa, que es un tipo salvaje C. albicans SC5314 transformada con el plásmido CLP10 :: Act1p-gLUC59 22 .En esta cepa (llamado SKCA23- ACTgLuc) Gluc se fusiona con el gen endógeno PGA59 bajo el control de ACT1 (actina) promotor (es este promotor activo en la levadura, así como la etapa de hifas de crecimiento de hongos). Esta cepa se puede solicitar desde el laboratorio del Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Lovaina, Bélgica. Plásmido plásmido CLP10 :: Act1p-gLUC59 22 fue cedida gentilmente por el profesor C. d&#39;Enfert, Instituto Pasteur, París, Francia. </li><li> Mantener ambas cepas en glicerol y se almacena a -80 ° C. </li><li> Antes de cualquier cepa experimento racha en una placa de YPD. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 2. Catéter Preparación Piezas <ol><li> Antes del experimento, determinar el número de catéteres se necesitan. Es posible implantar hasta 6 piezas de catéter por ratón (3 catéteres en la izquierda y 3 del catéter en el lado derecho del animal (Figura 2A). </li><li> Veinticuatro horas antes de la cirugía animal, abra el paqueteedad que contiene catéter de triple lumen bajo la cabina de seguridad biológica. Quite todas las partes innecesarias con pinzas estériles y cortar la parte unida al catéter con un bisturí estéril. Coloque gobernante bajo el paquete de plástico y cortar piezas de catéter de poliuretano de exactamente 1 cm de acuerdo con la escala de la regla (Figura 1). NOTA: Es importante mencionar que este tipo de pieza catéter no es fosforescente y por lo tanto adecuado para BLI 18,19. </li><li> Coloque un máximo de 15 piezas catéter corte (paso. 2.2) en 2 ml tubos de microcentrífuga. Siempre prepare 3 piezas extra, que se usan para enumerar la cantidad de células de Candida adjuntos en el dispositivo después de que el periodo de adhesión. </li><li> Suplemento catéteres con aproximadamente 1,8 ml de suero bovino fetal 100% (FBS). </li><li> Vigorosamente vórtice y añadir 100-200 l adicional de 100% de SFB. Cubra completamente todas las piezas del catéter con suero. </li><li> Incubar a 37 ° C durante la noche. </li&gt; </ol> 3. Los animales y la supresión del sistema inmune <ol><li> Mantenga hembra BALB / c ratones (aproximadamente 8 semanas de edad) en jaulas ventiladas individualmente superiores de filtro con libre acceso al alimento estándar y agua ad libitum. </li><li> Iniciar supresión del sistema inmune 24 hr antes de la cirugía de los animales mediante la adición de dexametasona (0,4 mg / L) al agua de bebida de los animales. Con el fin de evitar cualquier contaminación bacteriana del anfitrión, complementar el agua potable con antibióticos, por ejemplo, polvo de ampicilina de sodio (0,5 g / L). </li><li> Mantenga la inmunosupresión de los animales durante todo el experimento (hasta 6 días). </li></ol> 4. Los sustratos de poliuretano Ex vivo C. albicans Adherencia sobre FBS recubiertas- <ol><li> Transferir cada pieza catéter suero recubierto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos. </li><li> Raspe algunos C. albicans células cultivadas en placas de YPD (Paso 1) y suspender en 1 ml de PBS. </li><li> Diluir Cancélulas dida (1: 100) en un tubo de microcentrífuga independiente. Tomar 10 l de la muestra diluida y aplicarlo en una cámara de recuento celular. Contar al menos 16 pequeños cuadrados. </li><li> Preparar las células de Candida (cada cepa por separado) en medio RPMI 1640 a una concentración final de 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Añadir 1 ml de suspensión celular a cada pieza del equipo de suero-revestido. </li><li> Vortex vigorosamente y asegurar que los catéteres están sumergidos en el medio y no flotando en la superficie. </li><li> Incubar catéteres a 37 ° C durante 90 min (período de adhesión). </li><li> Eliminar catéteres con pinzas estériles y lavar dos veces con 1 ml de PBS. Durante esta etapa de asegurarse de que el fluido de lavado pasa a través del lumen, manteniendo el catéter en posición vertical, mientras que el lavado muy suavemente los catéteres. Es importante destacar que no utilice un fuerte flujo que puede llevar a la eliminación de las células unidas. </li><li> Traslado cada catéter se lava a un tubo de microcentrífuga limpio (una pieza per tuser). </li><li> Coloque sobre hielo y mantenerlo allí hasta la cirugía. </li></ol> 5. Anestesia <ol><li> Preparar la anestesia mediante la mezcla de 75 l de ketamina (100 mg / ml) con 100 l de medetomidina (1 mg / ml) y 825 l de solución salina estéril. Administrar por vía intraperitoneal (ip) 60-80 l de cóctel anestésico por 10 g de peso corporal, lo que resulta en una dosis de 45-60 mg / kg de ketamina y 0,6-0,8 mg / kg de medetomidina. </li><li> Para la recuperación de la anestesia, diluir 50 l atipamezol (5 mg / ml) en 4,95 ml de solución salina, administrar ip 100 l por 10 g de peso corporal como antídoto, resultando en una dosis de 0,5 mg / kg. </li><li> Después de la inyección de la anestesia, colocar al animal en una jaula separada y espere hasta que esté completamente dormido. </li><li> Confirme anestesia adecuada de los subproductos animales pizca de piel clara y una pizca dedo del pie, que no causa ningún daño a la piel. Cualquier movimiento observada indica que el animal no se anestesia suficiente para realizar la cirugía. Si esto sucede, espere un couple de minutos más hasta que el animal no muestra ningún signo de movimiento sobre la piel o del pie sujetador. </li></ol> 6. Cirugía Animal <ol><li> Transferencia anestesiado animal de la jaula en un pañuelo de papel limpio colocado sobre el cojín eléctrico, pre-calentado a 37 ° C (Figura 2, (1)). NOTA: Una alternativa más barata es usar mantas eléctricas. También es posible usar almohadillas isotérmicas, que deben ser calentados en el microondas antes de la cirugía animal. </li><li> Aplique un ungüento oftálmico en los ojos. </li><li> Afeitarse la parte trasera inferior del animal con una rasuradora eléctrica. Retire todos los pelos de animales y traslado de los animales en un pañuelo de papel limpio. Desinfectar la piel (por ejemplo, con 1% de isopropanol yodo o 0,5% de clorhexidina en 70% de alcohol) y dejar el área desinfectada secar durante aproximadamente 1 min (Figura 2A, (2)). </li><li> Hacer una pequeña incisión en la piel (uno a la izquierda y uno en el lado derecho del animal) (aproximadamente 0,5 y# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)). </li><li> Diseccionar el tejido subcutáneo con una tijera para crear dos túneles subcutáneos. Cada túnel debe ser de aproximadamente 1,5 cm de largo y 1 cm de ancho. </li><li> Inserte tres piezas de catéteres, previamente infectados con Candida, en cada túnel. Asegúrese de que los catéteres se encuentran uno junto al otro en una disposición horizontal y que no cubren entre sí para permitir la implantación de seis fragmentos de catéteres en total (Figura 2A, (4)). </li><li> Cerrar las incisiones con suturas. Como alternativa, utilice Dermabond para cerrar la herida. </li><li> Desinfectar la herida suavemente con un 0,5% de clorhexidina en alcohol al 70% o con isopropanol yodo (1%). </li><li> Aplicar anestésico local (gel de xilocaína, 2%) directamente sobre la herida. </li><li> Administrar reversión de la anestesia (protocolo 5, etapa 2): por vía intraperitoneal 100 l por 10 g de peso corporal. </li><li> Transferencia animal a una jaula limpia previamente colocada en una placa calefactora. Mantenga al animalindependiente y caliente hasta que el animal está completamente despierto. Mientras tanto, continuar con la operación y el implante de la siguiente animal. Una vez que todos los animales operados son completamente despierto. Transferencia a una jaula. Monitorear los animales regularmente. </li></ol> Imagen 7. bioluminiscencia: Preparación de coelenterazina (CTZ), el sustrato para G. luciferasa princeps <ol><li> Preparar coelenterazina fresca solución madre (CTZ) por disolución de 5 mg / ml CTZ en etanol acidificado o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar la solución de trabajo mM 1,2 por dilución de la solución madre 1:10 en PBS estéril. NOTA: Inyectar 100 l CTZ soluciones de trabajo por vía subcutánea en la zona que rodea a los catéteres. Utilice jeringas de insulina para la inyección subcutánea de CTZ. </li><li> Siempre mantenga CTZ en la oscuridad (por ejemplo, cubrir tubos de microcentrífuga que contengan CTZ con papel de aluminio). Almacenar la solución madre a -80 ° C durante la duración de los experimentos. </li></ol&gt; 8. La bioluminiscencia Imaging <ol><li> Inicialice la cámara BLI. </li><li> Anestesiar a los animales utilizando una caja de inducción. Utilice una mezcla de gas de isoflurano en oxígeno, N 2 O / O 2, o aire a 2-3%. </li><li> Después de la inducción, mantener la anestesia en el cuadro de inducción y en la cámara de formación de imágenes en 1,5-2%. </li><li> Antes de comenzar la sesión de imágenes, coloque la placa de imagen en la posición A, que corresponde a un FOV de 10 cm. Asegúrese de que la posición correcta de los puntos de venta de anestesia y de los animales mediante la colocación de un animal que duerme en la caja. </li><li> Tome algunas fotografías hasta animal está en la posición de imagen deseada, en el FOV justo debajo de la cámara. </li><li> Preparar dos jeringas de insulina que contienen cada uno 100 l de la solución de trabajo CTZ. </li><li> Coloque un animal en el banco y mantenerlo dormido por medio de un cono de la nariz que proporcionan anestesia gas. </li><li> Llevar las agujas de las jeringas en un lugar que rodea catéteres por vía subcutánea e inyectarla CTZ simultáneamente en la parte superior de los catéteres. </li><li> Inmediatamente después de la inyección, coloque el animal en el plato caliente en la caja de la cámara y comenzar la adquisición de imágenes de bioluminiscencia. </li><li> Adquirir exploraciones consecutivas con tiempos de adquisición de 20 a 60 segundos (dependiendo de la intensidad de la señal) hasta que se alcanza la intensidad máxima de la señal. Durante la adquisición de la trama siguiente, medir la intensidad de la señal BLI de las tramas previamente adquiridos mediante la colocación de un ROI sobre cada trío catéteres y midiendo el flujo de fotones a través de esta ROI. </li><li> Repita desde el paso 7 para el siguiente animal (s). </li><li> Después de las imágenes, vuelva animales a su jaula. Repita BLI durante el curso de un experimento para longitudinal, no invasivo de seguimiento de la formación de biopelículas. </li><li> Analizar los datos de BLI utilizando Vivir software de imagen. Coloque un ROI rectangular de tamaño fijo sobre cada trío catéter y medir el flujo de fotones (radiación) a través de cada ROI. Repita esto para cada animal. </li><li> Informela intensidad de la señal BLI de cada trío catéter como flujo de fotones por segundo. Representar los datos de BLI en una escala logarítmica por el trazado de la media y la SD de la flujo de fotones por segundo para cada grupo. Realizar un análisis estadístico de los registro de 10 datos transformados. </li></ol> 9. Catéter Explante <ol><li> Preparar tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de PBS, uno para cada dispositivo de catéter y mantenerlos en hielo. </li><li> La eutanasia a los animales por dislocación cervical (Figura 2B, (1)). </li><li> Desinfectar la piel de la espalda con 0,5% de clorhexidina en 70% de alcohol o de yodo con isopropanol (1%). </li><li> Hacer una incisión (aproximadamente 3 cm) por encima de los catéteres. </li><li> Cortar tejido subcutáneo y retire los fragmentos de catéter uno por uno desde debajo del tejido subcutáneo utilizando pinzas estériles (Figura 2B, (2)). </li><li> Manejar catéter suavemente en posición vertical y lavar dos veces con 1 ml de PBS estéril. Coloque cada catéterpieza en un tubo de microcentrífuga separado (preparado en el Paso 1). </li></ol> 10. Las células asociadas a Biofilm Cuantificación de formadoras de colonias por Conde Unidades (UFC) y análisis estadístico de los resultados <ol><li> Catéteres Sonicar colocados previamente en 1 ml de PBS durante 10 minutos a 40.000 Hz en un baño de ultrasonido agua y colocarlos en hielo. </li><li> Después de la sonicación y agitar vigorosamente durante 30 segundos y lugar de nuevo en el hielo. </li><li> Prepare dos tubos de microcentrífuga adicionales que contienen 900 l de PBS. </li><li> Haga 1:10 y 1: 100 diluciones de la muestra original (la que contiene el catéter) y mantener todos los tubos de microcentrífuga en hielo. </li><li> Plate 100 l de las muestras originales, 1:10 y 1: 100 diluciones en placas de agar YPD en duplicado. </li><li> Incubar las placas durante 2 días a 37 ° C y contar UFC. </li><li> Contar las colonias cultivadas en placas de agar YPD (cantidad numerable de colonias, máximo 300 colonias / placa) y multiplicarlos por el Dilu adecuadafactor de la (1x-original, 10x o 100x dilución). Además multiplicar cada pieza catéter por 10 veces, lo que se corresponde con el importe final de las colonias en el tubo 1 ml que contiene el catéter. Llevar el importe final de las colonias para registrar 10 células / pieza catéter con una desviación estándar (DE). Expresar datos como media ± desviación estándar. </li><li> Coloque todos los valores para cada catéter y grupo específico en una y / o programa estadístico hoja de cálculo, para realizar los cálculos y análisis estadísticos mencionados anteriormente. Indique grupos específicos para comparar, es decir, WT vs. mutante o 2 días frente. 6 días de formación de biofilm y realizar la prueba t no pareada y ANOVA con Tukey post-test en los datos log10-transformado. <ol><li> Expresar el nivel de significación por un valor de p. En este estudio indican significación si p &lt;0.05, representada de la siguiente manera: * p &lt;0.05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El uso de modelos animales, y especialmente los modelos de roedores, los estudios dedicados a las biopelículas microbianas es muy importante ya que el sistema inmune del huésped es un factor esencial en la formación de biopelículas que los modelos in vitro no pueden explicar. En este estudio, se describe un relativamente sencillo subcutánea C. albicans biofilm modelo de ratón, que puede ser fácilmente adoptada en un laboratorio de investigación y no requiere fuertes habilidades técnicas. Este modelo se...

Candida albicans es un organismo comensal, que se puede encontrar en diferentes sitios de individuos sanos, por ejemplo sobre la piel o como una parte de la flora gastrointestinal y vaginales. Sin embargo, en hospitalizados, y sobre todo pacientes inmunodeprimidos, puede causar una amplia gama de infecciones 1. En estos individuos, el sistema inmunológico debilitado permite que las células de Candida para difundir en el torrente sanguíneo y que invaden los tejidos más profundos que causan las infecciones que amenazan la vida. Además, la presencia de sustratos abióticos tales como catéteres venosos centrales y urinarios, válvulas cardíacas artificiales y las articulaciones puede proporcionar un nicho para Candida fijación 2. La adhesión a tales sustratos es un requisito previo para el desarrollo de biopelículas, que representa una capa de células de levadura y de hifas embebidos en el material polimérico extracelular, que consiste principalmente de polisacáridos 2. C. infecciones por catéter -asociado albicansestán asociados con una alta tasa de mortalidad. Una característica general de las biopelículas es su disminución de la susceptibilidad a los antifúngicos conocidos, tales como azoles 3,4. Sólo nuevas clases de fármacos antifúngicos, tales como las equinocandinas y la formulación liposomal de anfotericina B demostraron ser activos contra las infecciones asociadas al catéter 5-7. Debido a la resistencia a los antifúngicos biofilm, los enfoques terapéuticos son muy limitados, a menudo conduce a la retirada de la sonda y su posterior reemplazo como solución única. La mayor parte de nuestra comprensión actual de C. desarrollo de la biopelícula albicans origina a partir de los estudios in vitro sobre sustratos abióticos tales como poliestireno o plásticos utilizados para la fabricación de los dispositivos anteriormente mencionados, es decir, silicona, poliuretano 2. Estos modelos son bastante avanzada y tratar de imitar la situación in vivo tan estrechamente como sea posible. Sin embargo, estos sistemas no implican el flujo de sangre continuo y tque el sistema inmune del huésped. Esto resultó en el desarrollo de sistemas de modelos in vivo, tales como el modelo de catéter venoso central (CVC) 8-10, el modelo estomatitis protésica de la candidiasis oral 11 y un modelo murino para asociada al catéter candiduria 12. Adicionalmente, C. desarrollo de la biopelícula albicans se estudió in vivo en las superficies de las mucosas, tales como las de la vagina 13 y la cavidad oral 14. Nuestro laboratorio contribuyó con la creación de un C. subcutánea modelo de biofilm albicans, que se basa en el implante de piezas catéter infectado en la parte posterior de las ratas Sprague Dawley 15. Este modelo fue utilizado con éxito en nuestro laboratorio para probar la susceptibilidad biofilm al fluconazol y equinocandina drogas 5,16, para estudiar el efecto de la terapia combinatoria de diclofenaco y caspofungina 17. Más recientemente, se adaptó este sistema para su uso en ratones BALB / c 18,19. Encomparación con otros modelos in vivo, la principal ventaja de este modelo subcutánea es la posibilidad de estudiar múltiples biofilms por animal desarrollado en el interior del lumen de piezas catéter implantado. Para reducir el número de animales de laboratorio, hemos adaptado este modelo para estudiar el desarrollo de C. albicans biofilms no invasiva mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) 18,19. Este método ha demostrado ser una técnica poderosa, que puede ser utilizado para cuantificar las biopelículas mediante la medición de la señal específica BLI en la región de interés (en nuestro caso, el área de catéteres implantados), evitando el sacrificio de animales. En comparación con las bacterias, que puede expresar tanto el gen y el sustrato necesario para la reacción de bioluminiscencia debido a la introducción de un operón lux específica 20, la mayoría de los organismos eucariotas, incluyendo C. albicans, son dependientes de la expresión heteróloga de un gen de la luciferasa, junto con eladministración externa de un sustrato específico, tal como D-luciferina o coelenterazina 21. Probablemente debido a la presencia de la pared celular fúngica y C. morfogénesis albicans, el suministro intracelular del sustrato para la enzima luciferasa fue un reto principal 21. A fin de resolver este problema, Enjalbert et al. 22 diseñado una cepa donde un C. sintética albicans versión codón optimizado del gen para la secretada de forma natural Gaussia princeps luciferasa (gluc) se fusionó a la C. gen albicans PGA59, un GPI- anclado proteínas de la pared celular. Debido a la presencia de la luciferasa en la pared celular, los problemas relativos a la disponibilidad intracelular del sustrato podrían evitarse. Este sistema fue utilizado en particular para estudiar infecciones superficiales causadas por C. 22 albicans. Muy recientemente, BLI también fue utilizado para seguir la progresión de la candidiasis orofaríngea y su possible tratamiento 23. Estos hallazgos apoyan el uso de BLI como una técnica prometedora para estudiar infecciones causadas por las células de vida libre, sino también las infecciones asociadas a dispositivos. En este estudio, se describe la C. el desarrollo del biofilm albicans en piezas de catéter de poliuretano en ratones Balb / C y su cuantificación mediante BLI. Proporcionamos un protocolo detallado de la colonización in vitro de los catéteres de poliuretano durante el período de adherencia seguida de la implantación en ratones y el desarrollo de biopelículas posterior de animales vivos. Además de la medición de la señal emitida por el BLI C. albicans células, que también determinan el unidades formadoras de colonias para la comparación con la técnica estándar para la carga fúngica biofilm cuantificación.

<table><tbody><tr><td>Extracto de levadura granulado</td><td>Merck</td><td>MERC1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>Oxoid</td><td>LP037B</td><td></td></tr><tr><td>Agar granulado</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Fluka</td><td>49159-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Preparado en el laboratorio</td><td></td><td>para 1L de 10x PBS: 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4</sub</td></tr><tr><td>>RPMI1640 con L-glutamina y sin carbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R6504-1L</td><td>Prepare de acuerdo con el protocolo para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos de Candida albicans&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico (MOPS)</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>MOPS se utiliza para ajustar el pH del medio RPMI (pH 7.0)</td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Pieza de catéter intravenoso de poliuretano tripe-lumen (2,4 mm de diámetro, Certofix Trio S730)&nbsp;</td><td>BBraun</td><td>CV-15703</td><td>Pieza de poliuretano cortada en trozos de 1 cm</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Fagron SAS, Francia</td><td>611139</td><td>Inmunosupresor (solución madre 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Ampicilina&nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie, Países Bajos</td><td>A0104</td><td>Profilaxis antibacteriana</td></tr><tr><td>Ketamina 1000</td><td>Pfizer</td><td>804 119</td><td>Domitor anestésico</td></tr><tr><td></td><td>Pfizer</td><td>134737-1</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Antisedán</td><td>Pfizer</td><td>134783-2</td><td>Reversión de la anestesia</td></tr><tr><td>Gel de xilocaína (2%) - esto es Linisol</td><td>AstraZeneca</td><td>352 1206</td><td>Anestésico local para la piel</td></tr><tr><td>Terramicina / pomada oftálmica de polimixina-b</td><td>Para prevenir la sequedad y la infección de los ojos</td>Celenterazina&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prolume (Nanolight)</td><td>NF-CTZ-FB</td><td>Agente sensible a la luz (debe mantenerse en la oscuridad)</td></tr><tr><td>Yodo isopropanol (1%)</td><td>3M&trade; DuraPrep&trade; &nbsp;</td><td></td><td>Desinfectante para la piel</td></tr><tr><td>0,5 % de clorhexidina en 70 % de alcohol. &nbsp;</td><td>Cedium</td><td></td><td>Desinfectante para la piel</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento</td><td></td><td></td><td></td>celular</tr><tr><td>Jeringas de insulina (0,3 ml)</td><td>Terumo Myjector 29G</td><td>324826</td><td>Para inyección de celenterazina</td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar</td><td></td><td></td> eléctrica <td>Para animales pequeños</td></tr><tr><td>Herramientas</td><td></td><td></td> quirúrgicas <td>estériles Tijeras, 2 pares de pinzas, bisturí</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Leica</td><td>14042321474</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cutánea</td><td>Johnson& Johnson</td><td>K890H</td><td>Hilo quirúrgico, aguja</td></tr><tr><td>Sonicador de baño de agua</td><td>Branson 2210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara BLI (IVIS Spectrum)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td>IVISSPE</td><td></td></tr><tr><td>Living Image software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td></td> <td>(versión 4.2)&nbsp;</td></tr></tbody></table>

candida albicans biopelícula desarrollo de cuerpos extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea seguido por bioluminiscencia imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans desarrollo de biopelículas en superficies bióticos y / o abióticos representa una amenaza específica para los pacientes hospitalizados. Hasta ahora, C. biofilms albicans se han estudiado principalmente in vitro, pero hay una necesidad crucial para una mejor comprensión de este proceso dinámico en condiciones in vivo. Hemos desarrollado un modelo de rata subcutánea en vivo para estudiar C. la formación de biopelículas albicans. En nuestro modelo, múltiple (hasta 9) dispositivos infectados por Candida se implantan a la parte trasera del animal. Esto nos da una gran ventaja sobre el modelo de sistema de catéter venoso central, ya que nos permite estudiar varios biofilms independientes en un solo animal. Recientemente, hemos adaptado este modelo para estudiar C. el desarrollo del biofilm albicans en ratones Balb / c. En este modelo, madurar C. biofilms albicans se desarrollan dentro de 48 horas y demuestran la arquitectura de las biopelículas tridimensional típico. La cuantificación de biofilm fúngicaes tradicionalmente analizada post mortem y requiere sacrificio anfitrión. Debido a que este requiere el uso de muchos animales para llevar a cabo estudios cinéticos, se aplicó imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) longitudinalmente seguimiento in vivo madurar C. albicans biofilms desarrollar en nuestro modelo subcutánea. C. albicans células fueron diseñados para expresar el gen de la luciferasa Gaussia princeps (gluc) unido a la pared celular. La señal de bioluminiscencia es producido por la luciferasa que convierte la coelenterazina sustrato añadido a la luz que se puede medir. La señal de BLI parecía recuentos de células obtenidas de catéteres explantadas. Imagen no invasivas para la cuantificación de la formación de biopelículas vivo ofrece aplicaciones inmediatas para la selección y validación de fármacos antifúngicos en condiciones in vivo, así como para los estudios basados ​​en las interacciones huésped-patógeno, por este medio que contribuye a un mejor entenderción de la patogénesis de las infecciones asociadas al catéter.

En este estudio, mostramos el procedimiento quirúrgico de implante de catéter y explante in vivo durante el desarrollo de C. albicans biofilm en un ratón. Además, se muestra la cuantificación de los biofilms maduros no sólo por la enumeración UFC clásica, sino también por BLI. Como se muestra en la Figura 1A, no fosforescentes piezas catéter de poliuretano se cortaron en dispositivos 1 cm y posteriormente recubiertas con suero. Este paso es muy importante p...

Presentamos un procedimiento experimental de desarrollo de biofilm de Candida albicans en un modelo subcutáneo de ratón. Las biopelículas fúngicas se cuantificaron determinando el número de unidades formadoras de colonias y mediante una imagen de bioluminiscencia no invasiva, donde la cantidad de luz que se produce se corresponde con el número de células viables.

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

El objetivo general del siguiente experimento es validar el uso de una cepa que expresa luciferasa para el monitoreo no invasivo de la formación de biopelículas in vivo por células de Candida albican. Esto se logra mediante la implantación de fragmentos de catéter colonizados con una luciferasa que expresa una cepa de Candida albicans en la espalda de un ratón. Durante el segundo paso, se permite que la levadura crezca hasta convertirse en una capa gruesa de células incrustadas dentro de una matriz extracelular, generando una biopelícula madura en el interior de los catéteres.A continuación, se añade un sustrato que será convertido por la enzima luciferasa. Esta reacción produce luz medible: Las imágenes bioluminiscentes o BLI se utilizan para registrar y cuantificar la formación de la biopelícula dentro del huésped vivo. La principal ventaja de esta técnica frente a otras técnicas existentes, como el sistema central Venmo, es que podemos testear hasta seis biofilms dentro de un animal, reduciendo así en gran medida el número de animales que requerimos para el análisis estadístico.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la formación de biopelículas de Candida albicans, ya que nuestro método permite probar fácilmente los componentes antifúngicos existentes y nuevos. Además, este método puede proporcionar información sobre las biopelículas fúngicas de Candida albicans. También se puede aplicar a otros microbios como bacterias u otras especies divertidas.Los procedimientos propuestos son fáciles de implementar en cualquier laboratorio que tenga acceso a un animalario 24 horas antes del procedimiento quirúrgico abierto el paquete que contiene los catéteres de triple lumen dentro de un gabinete de seguridad biológica. Use pinzas estériles para quitar todas las partes innecesarias y un bisturí estéril para cortar la parte unida al catéter. Luego coloque una regla debajo del paquete de plástico y corte el catéter de poliuretano en trozos de un centímetro de largo.A continuación, llene cada catéter con aproximadamente 1,8 mililitros de suero bovino 100% fetal e incube las piezas a 37 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera cada pieza de catéter recubierta de suero a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros y raspe C. albicans de una placa YPD a un mililitro de PBS en un tubo de microcentrífuga separado en una dilución de uno a 100. Después de contar, diluya la suspensión celular a una concentración final de cinco veces 10 a la cuarta celdas por mililitro.Y añadir un mililitro de células a cada una de las piezas del catéter recubierto de suero. Deje que las células se adhieran a los catéteres durante 90 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, sujetando los tubos en posición vertical con pinzas estériles.Enjuague suavemente cada pieza a través del lumen dos veces con un mililitro de PBS para colocar los catéteres. Comience afeitando la parte inferior de la espalda de una rata anestesiada de ocho semanas de edad colocada en una almohadilla térmica. A continuación, desinfecte la piel y haga una pequeña incisión de 0,5 a un centímetro a cada lado del animal.A continuación, disecciona el subcu con unas tijeras para crear dos túneles subcutáneos de aproximadamente 1,5 centímetros de largo y un centímetro de ancho. Inserte tres piezas de catéter en cada túnel asegurándose de que las piezas queden una al lado de la otra en una disposición horizontal sin superponerse. Cierre las incisiones con suturas y luego limpie las heridas muy suavemente con un desinfectante.A continuación, aplique un anestésico local directamente sobre las incisiones y administre un agente reversor de la anestesia para vigilar a los animales hasta que se recuperen por completo. Para obtener imágenes de la formación de la biopelícula en el momento experimental apropiado, inyecte 100 microlitros de espiral y terezina recién preparados por vía subcutánea en cada área que contiene los catéteres en un animal anestesiado. A continuación, adquiera escaneos consecutivos con tiempos de adquisición que oscilan entre 20 y 60 segundos hasta alcanzar la intensidad máxima de la señal.Durante la adquisición del siguiente fotograma, coloque una región de interés sobre cada trío de catéteres para medir la imagen bioluminiscente o la intensidad de la señal BLI de los fotogramas adquiridos previamente. Coloque una región rectangular de interés de tamaño fijo en una región de control para medir la señal de fondo en el software de imagen viva. Mida el flujo de fotones a través de las regiones de interés para cada trío de catéteres, así como para el fondo.Después de repetir estas mediciones para cada animal y en diferentes puntos de tiempo durante la formación de la biopelícula, el informe de la intensidad de la señal BLI de cada catéter se expresa como flujo de fotones por segundo. Los datos se pueden copiar y pegar directamente en un programa de hoja de cálculo. Al final del experimento longitudinal, sacrifica cada animal que corta el tejido subcutáneo y utiliza pinzas estériles para retirar los fragmentos del catéter uno por uno.Lave los catéteres dos veces en un mililitro de PBS como se acaba de demostrar. A continuación, sonicar las piezas en un nuevo tubo de microcentrífuga en un mililitro de PBS fresco a 40.000 hercios en un baño de agua. Sonicar después de 10 minutos, colocar los tubos que contienen los catéteres en hielo y colocar 100 microlitros de las muestras originales en diluciones de uno a 10 y de uno a 100 en placas de agar YPD.por duplicado. Por último, represente la media y la desviación estándar de las unidades formadoras de colonias. Y la señal BLI para cada animal en una escala logarítmica.En esta imagen, se muestra un animal representativo que muestra la señal de bioluminiscencia junto con una región de interés denotada seis días después del desarrollo de la biopelícula. Nótese la falta de señalización en el área de fondo de control que confirme la limitación de la biopelícula a las áreas inmediatamente adyacentes a los catéteres recubiertos de cándida. En este experimento representativo, se puede observar una clara señal BLI producida por la luciferasa que expresa biopelículas, mientras que solo la señal de fondo parece ser producida por la cepa de tipo salvaje.Este aumento de la señal sigue la misma tendencia que el aumento de las unidades formadoras de colonias por biopelícula y las mediciones del flujo de fotones para cada grupo de animales en conjunto. Estos datos ilustran que BLI es una técnica poderosa para monitorear y cuantificar in vivo la formación de biopelículas de C. albicans maduro en un modelo de ratón subcutáneo. Una vez dominada, la infección de los dispositivos con células de cándida puede tardar dos horas, mientras que el implante del catéter se puede realizar en 10 minutos por ratón.Las imágenes BLI se pueden realizar en cinco minutos por ratón. La gran ventaja de usar BLI es que se puede monitorear el desarrollo de biomasa y biopelícula repetidamente en el mismo animal. Con el tiempo Después de este procedimiento, otros métodos como la resonancia magnética o la tomografía computarizada pueden proporcionar información sobre la posición exacta de la catedral.Esta información se puede utilizar para la cuantificación en modelos más complejos como el modelo de la catedral de la veta profunda. Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo realizar biopelícula subcutánea in vivo, ss en ratones, y esto puede formar la base para un análisis más profundo de las interacciones entre el huésped y el patógeno.

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Este video demuestra el desarrollo de un modelo de ratón in vivo para estudiar la formación de biopelículas de Candida albicans en tejido subcutáneo. El experimento consiste en implantar dispositivos infectados con Candida en la región posterior del animal para el desarrollo de la biopelícula.

Candida albicans Formación de biopelículas en un modelo de ratón in vivo

Aquí describimos un nuevo modelo murino diabético utilizando ratones sin pelo en tiempo real, no invasivo, vigilancia de infecciones de la herida del biofilm de bioluminiscente Pseudomonas aeruginosa. Este método puede adaptarse para evaluar infección de otras especies de bacterias y microorganismos modificados genéticamente, como los biofilms multiespecies y comprobar la eficacia de estrategias antibiofilm.

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

Este protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico automatizado personalizable para visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en condiciones fisiológicas de host.

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

El propósito de este protocolo es visualizar la forma de la célula candida albicans y la localización en el tracto gastrointestinal de los mamíferos.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Para ver y cuantificar las características internas de las biopelículas de Candida albicans, preparamos especímenes fijos intactos que se clarifican mediante la coincidencia del índice de refracción. A continuación, la microscopía de seccionamiento óptico se puede utilizar para obtener datos de imagen tridimensionales a través del espesor completo de la biopelícula.

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.

Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia

Este manuscrito describe un método para examinar bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamaño moderado para fenotipos de morfogénesis durante la infección activa en un huésped mamífero utilizando microscopía confocal no invasiva.

Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

La infección de la articulación periprotésica (PJI) causada por patógenos peligrosos es común en la ortopedia clínica. Los modelos animales existentes no pueden simular con precisión la situación real de la PJI. Aquí, establecimos un modelo de ratón PJI asociado a la biopelícula de Candida albicans para investigar y desarrollar nuevas terapias para la PJI.

Un modelo de infección por Candida albicans en una articulación periprotésica en ratones

Establecemos un modelo murino de infección relacionada con el catéter (IRC) asociada a C. albicans, en el que se forma una biopelícula en el catéter, y la interacción entre C. albicans y el huésped se correlaciona bien con el IRC clínico. Este modelo ayuda a cribar terapias para el IRC asociado a la biopelícula de C. albicans , sentando las bases para la transformación clínica.

Un modelo de infección por Candida albicans relacionada con catéteres en ratones

Este protocolo describe la aplicación de la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) en un modelo murino de candidiasis oral. La aPDT se realizó utilizando una mezcla soluble en agua de curcuminoides y luz LED azul.

Terapia fotodinámica antimicrobiana mediada por curcuminoides en un modelo murino de candidiasis oral

Este protocolo describe un modelo experimental único de infecciones relacionadas con implantes que permite la incubación simultánea de dos implantes con bacterias en condiciones idénticas dentro de un solo ratón. También permite una evaluación precisa de la formación de biopelículas en las superficies de los implantes utilizando métodos analíticos comparativos optimizados, demostrando técnicas avanzadas para evaluar las propiedades antimicrobianas de los biomateriales.

Un modelo de ratón único para la evaluación cuantitativa de la formación de biopelículas en implantes quirúrgicos en abscesos subcutáneos

Aprende a monitorear biopelículas de Candida albicans en ratones mediante imagen de bioluminiscencia. Este método permite cuantificar formación de biopelículas in vivo y evaluar terapias antifúngicas.

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging (Video) | JoVE Journal

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

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