Name: Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprende a realizar inyecciones subretinales en roedores para administrar células epitelio pigmentario retiniano con mínimo trauma. Este protocolo permite evaluar la supervivencia e integración celular mediante histología e imagen in vivo.

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Deseamos agradecer a Alison Dorsey por ayudar a desarrollar la técnica de inyección subretiniana. También agradecemos al Instituto Nacional del Ojo (subvenciones del NEI EY11254 y EY021416), al Instituto de Medicina Regenerativa de California (subvención CIRM TR1-01219) y al Instituto de Investigación Médica Lowy (LMRI) por su generosa financiación para este proyecto.

NOTA: Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps. 1. Preparación de los materiales para la inyección (~ 20 min) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Solución de disociación celular Pre-caliente (preferiblemente uno que se inactiva a través de la dilución, no con suero), PBS estéril y medios de cultivo (Tabla 1). </li><li> Esterilizar la jeringa con una aguja de punta roma por el desmontaje y hervir las partes en agua durante 15 min. </li></ol> 2. Preparación de las células del EPR para inyección (~ 30 min a 1 hr) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Separe las células del EPR utilizando solución de disociación de células pre-calentado por 5-8 minutos a 37 ° C. </li><li> Raspe las células suavemente para liberar cualquier que todavía esté conectado. </li><li> Diluir las células con un gran volumen de medios de cultivo (llenar un tubo de 15 ml) para inactivar la solución de disociación y contarlos. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar las células. </li><li> Resuspender las células a 200.000 células / l (para entregar 100.000 células en un volumen de 0,5 l) en PBS precalentado estéril y transferirlos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Opcionalmente, añada un marcador fluorescente transitoria de células vivas y se incuba a 37 ° C durante 30-45 min. </li><li> Cargar la jeringa con una aguja roma con 0,5 l de células. Inyectar las células tan pronto como sea posible. </li></ol> 3.-Sub retina Inyección (~ 5 min por inyección) NOTA: Si es posible, aprender la técnica con ratas albinas adultas desde los vasos del limbo son mucho más fáciles de visualizar. Inyectar solución verde cuando el aprendizaje rápido (antes de tratar de inyectar las células) para facilitar más fácilmente la visualización del sitio de la inyección. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Anestesiar el roedor. Utilice inyecciones intraperitoneales de 100 mg / ml de ketamina y 10 mg / ml de xilazina (20 l / 10 g cuerpo wocho) sobre la inhalación de isofluorano ya que es difícil de maniobrar el roedor y se inyecta en el ojo con el hocico en el inhalador. <ol><li> Asegúrese de que el animal se anestesió profundamente pellizcando una de sus patas. Si se estremece, esperar varios minutos y vuelva a intentarlo antes de comenzar la inyección subretiniana. </li></ol></li><li> Coloque el roedor a su lado para que el ojo que se inyecta se enfrenta el techo. </li><li> Bajo un microscopio de disección estirar suavemente la piel para que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (proptosis temporal) y se vuelve más accesible mediante la celebración de su cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por su mandíbula y estirar suavemente la piel en paralelo a los párpados por lo que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (Ver Figura 1 C). No agarre el roedor demasiado cerca de la garganta. </li><li> Con una aguja previamente esterilizada desechable afilada 30 G, hacer un agujero justo debajo del limbo (si los vasos son golpeados, sangrado bE significativa y ser difícil de encontrar el agujero más adelante) y en un ángulo para evitar tocar la lente con la aguja (Figura 1D). Evite tocar la lente con la aguja (o roma) o la formación de cataratas inmediata va a producir. NOTA: Las inyecciones funcionan mejor con dos personas. De esta manera una persona puede pasar a la jeringa con la aguja roma a la persona que realiza la inyección después de haber creado el primer agujero con la aguja desechable afilado para mantener la atención en el dónde está el agujero. </li><li> Retraer la aguja desechable desde el ojo mientras se mantiene el agarre en la cabeza. Recuerde exactamente dónde está el agujero. </li><li> Después de cualquiera de montar la jeringa precargada con una aguja roma en un micromanipulador o sosteniéndolo con la mano, inserte la punta de la jeringa con la aguja roma a través del agujero, cuidando de nuevo de no tocar la lente, y empuje suavemente a través del ojo muy suavemente hasta sentir resistencia (Figura 1D). </li><li> Keeping todos los movimientos a un mínimo, inyectar cuidadosamente las células del EPR lentamente en el espacio subretiniano. NOTA: desprendimiento del EPR / retina se inducirá; esto es inevitable. Sin embargo, una inyección limpio minimiza el desprendimiento y mejora en gran medida las posibilidades de una reparación (Figura 1E). Cualquier movimientos exagerados pueden mover la aguja de nuevo en la retina, y movimientos laterales pueden dañar la retina. El uso de una bomba de inyección es opcional, pero permite una entrega muy precisa. </li><li> Retraer la jeringa lentamente. Aplicar hidratante gotas para los ojos para mantener el ojo hidratado. </li><li> Continúe controlando el animal hasta que recupera decúbito esternal. No deje de animales sin vigilancia o volver a una jaula con otros animales de alerta hasta que recupera decúbito esternal. </li></ol>

<ol><li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJong%2C+PT+%22Age-related+macular+degeneration%22">Age-related macular degeneration</a>. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto+iris+pigment+epithelial+cell+transplantation+in+patients+with+age-related+macular+degeneration%3A+short-term+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+Of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results.</a> The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+retina+for+management+of+subfoveal+choroidal+neovascularization+II%3A+a+preliminary+report+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans.</a> Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Joussen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+complete+is+successful+%27Autologous+retinal+pigment+epithelium+and+choriod+translocation+in+patients+with+exsudative+age-related+macular+degeneration%3A+a+short-term+follow-up%27+by+Jan+van+Meurs+and+P.R.+van+Biesen%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).</li>
<li>Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+outcomes+following+macular+translocation+with+360-degree+peripheral+retinectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy.</a> Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).</li>
<li>Machemer, R., Steinhorst, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+separation%2C+retinotomy%2C+and+macular+relocation%3A+II.+A+surgical+approach+for+age-related+macular+degeneration%3F+Graefes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes.</a> Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).</li>
<li>MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+transplantation+of+the+retinal+pigment+epithelium+and+choroid+in+the+treatment+of+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration.</a> Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa).</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+embryonic+stem+cell+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration.</a> Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+from+iPS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e50932(2014).</li>
<li>Huber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+mouse+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).</li>
<li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mouse+retinal+degeneration+with+high-resolution+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vision%22%5BJournal%5D)">Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography.</a> Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).</li>
<li>Pennesi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+retinal+degeneration+in+rd1+and+rd10+mice+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).</li>
<li>Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+remodeling+in+mammalian+retina%3A+results+from+studies+of+experimental+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment.</a> Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Diniz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene divulgaciones comerciales que declarar.

En este artículo se describe un método relativamente simple para realizar inyecciones subretinianas de células del EPR en suspensión en ratas y ratones. El protocolo es fácil de aprender y más experiencia con la técnica se traducirá en un menor número de traumas (Figura 3, lo que representa uno de los mejores inyecciones), especialmente si se utiliza un micromanipulador (Figura 1A). Cualquier trauma se puede monitorizar in vivo con un sistema de cSLO y OCT (Figura 2)</s...

La retina sensorial está organizada en niveles funcionales de neuronas, glía y células endoteliales. Los fotorreceptores en la parte posterior de la retina se activan con la luz; A través de la fototransducción, convierten los fotones en señales eléctricas que son refinadas por las interneuronas y transmitidas a la corteza visual en el cerebro. La fototransducción no puede ocurrir sin los esfuerzos coordinados de las células del epitelio pigmentario de la retina y la glía de Mueller (EPR). Los EPR están organizados en una monocapa directamente detrás de los fotorreceptores y realizan múltiples y diversas funciones integrales para la función y la homeostasis de los fotorreceptores. De hecho, el EPR y los fotorreceptores son tan codependientes que se consideran una unidad funcional. La muerte o disfunción del EPR produce efectos secundarios devastadores sobre los fotorreceptores y se asocia con la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de ceguera en los ancianos1,2.
Aunque no se ha descubierto una cura para la DMAE, varios estudios clínicos han demostrado que el reemplazo de células EPR puede ser una opción terapéutica prometedora3-13. Con el advenimiento de la tecnología de células madre, ahora es posible generar un gran número de células EPR in vitro a partir de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (hES y hiPS) que se parecen mucho a sus contrapartes somáticas funcional y anatómicamente14-26. También se ha demostrado que el EPR derivado de células madre funciona in vivo por múltiples grupos independientes, incluido el nuestro, para ralentizar significativamente la degeneración de la retina en líneas de ratas y ratones con degeneración espontánea de la retina16,18,21,22,25,28,29. Esta combinación de evidencia clínica y preclínica de apoyo es tan convincente que actualmente se están llevando a cabo varios ensayos clínicos para prevenir la degeneración de la retina utilizando células RPE derivadas de células madre30,31. 
RPE puede derivarse fácilmente de hES y/o hiPS e implantarse en el espacio subretiniano de los roedores utilizando diversas técnicas de derivación e inyección32,33. (Véase Westenskow et al. para un documento de métodos en formato multimedia que demuestra el protocolo de diferenciación dirigida que empleamos)34. Quedan preguntas críticas por resolver con respecto a la seguridad, la supervivencia y la capacidad funcional de las células EPR administradas exógenamente en el momento de la implantación, por lo tanto, la capacidad de realizar inyecciones subretinianas en roedores es una habilidad crítica16,18,21,29,36,37. La administración de RPE no es trivial y el campo se divide en la técnica de inyección más efectiva. El protocolo que describimos aquí es una forma sencilla y eficaz de administrar el bolo de células EPR por vía subretiniana, y se utilizó en el primer ensayo clínico para el trasplante de EPR derivado de células madre31. (El lector también puede consultar otro artículo de JoVE de Eberle et al. para una descripción alternativa de las inyecciones subretinianas en roedores. Artículo 38) 
La técnica descrita en este manuscrito no se puede visualizar y el trauma es inevitable (como con cualquier técnica de inyección subretiniana). Se realiza haciendo un orificio justo debajo de los vasos del limbo e insertando una aguja roma a lo largo de una ruta transescleral para inyectar un bolo de células debajo de la retina diametralmente opuesta. La persona que aplica la inyección sentirá resistencia cuando la aguja roma toque la retina. Sin embargo, las células se pueden visualizar directamente después de la inyección, y el grado de desprendimiento de retina inducido se puede determinar marcando las células del EPR con un marcador fluorescente transitorio y detectándolas con un oftalmoscopio de barrido confocal (cSLO). También se puede utilizar un sistema de tomografía de coherencia óptica (OCT) para controlar el traumatismo e identificar fácilmente el lugar de la inyección.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>50 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell Scapers</td><td>VWR</td><td>89260-222</td><td>Caja x 1</td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Sondas Moleculares</td><td>C34552</td><td>50 &micro; g x 20</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Verde Rápido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>25 g x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Gotas de gel gentiles Gotas lubricantes para los ojos de moderado a severo &nbsp;</td><td>Walmart</td><td>4060941</td><td>25 ml x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Modelo 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Jeringa x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Aguja Hamilton 33 G, 0.5", punto 3 (acero inoxidable 304)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Agujas x 6</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Reemplazo</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Soporte Magnético</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Soporte 39430216 x 1</td></tr><tr><td>MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 100X&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Manipulador de 3943001 x 1</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Jeringas de punta deslizante sin agujas BD&nbsp; (3 ml)&nbsp; &nbsp;</td>Paquete <td>de BD309656</td> <td>VWR</td><td>x 1</td></tr><tr><td>aguja de uso especial BD&nbsp; (30 G, 1")</td><td>VWR</td><td>BD305128</td><td>Caja x 1</td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1X), sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>100 ml x 1</td></tr></tbody></table>

realizar subretinal inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en suspensión

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

La conversión de la luz en impulsos eléctricos se produce en la retina externa y se lleva a cabo en gran medida por conos y bastones fotorreceptores y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE proporcionar apoyo crítico a los fotorreceptores y la muerte o la disfunción de las células del EPR es característico de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de la pérdida permanente de la visión en personas mayores de 55 años. Si bien no hay cura para la DMAE ha sido identificado, la implantación de RPE saludable en ojos enfermos puede llegar a ser un tratamiento efectivo, y un gran número de células del EPR puede generarse fácilmente a partir de células madre pluripotentes. Varias preguntas interesantes sobre la seguridad y eficacia de la entrega de células RPE todavía pueden ser examinadas en modelos animales, y los protocolos bien aceptados utilizados para inyectar RPE se han desarrollado. La técnica descrita aquí ha sido utilizado por varios grupos en diversos estudios y consiste en crear primero un agujero en el ojo con una aguja afilada. A continuación, una jeringa con una blunt aguja cargada con células se inserta a través del agujero y pasa a través del humor vítreo hasta que toque suavemente el RPE. El uso de este método de inyección, que es relativamente simple y requiere un mínimo de equipo, logramos la integración coherente y eficaz de las células RPE derivadas de células madre en entre el RPE host que impide cantidad significativa de degeneración de los fotorreceptores en modelos animales. Aunque no es parte del protocolo real, también se describe cómo determinar la extensión de la trauma inducido por la inyección, y cómo verificar que las células fueron inyectadas en el espacio subretiniano en el uso de técnicas de imagen in vivo. Finalmente, el uso de este protocolo no se limita a las células del RPE; puede utilizarse para inyectar cualquier compuesto o de células en el espacio subretiniano.

Podemos entregar una suspensión de células del EPR en el espacio subretiniano de roedores rápida y consistente con la técnica descrita en este manuscrito. Aunque no es necesario, traumas pueden minimizar en gran medida el uso de la configuración se muestra con un micromanipulador en la figura 1A &amp; B. Mantenga el roedor como se muestra en la Figura 1C para proptosis temporal. Los pasos son los mismos si se realiza con el micromanipulador oa mano; éstas se representan en los dibujos a...

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

El objetivo general de este procedimiento es inyectar pigmento de la retina, epitelio o células EPR en el espacio subretiniano de los roedores mientras se minimiza el trauma. Esto se logra usando primero una aguja afilada para hacer un agujero en el ojo de un animal sedado. A continuación, las células se inyectan en el espacio subretiniano con una aguja roma.En el paso final, el ojo se cubre con crema hidratante para mantenerlo hidratado. En última instancia, la histología y las modalidades de imagen in vivo se pueden utilizar para controlar la eficacia de la inyección. Si bien el método que le hemos mostrado hoy se diseñó específicamente para la administración de células EPR en el espacio subretiniano, la técnica en sí es ampliamente aplicable a la administración de una variedad de otros tipos de células y productos químicos en el espacio subretiniano para ser utilizados en una variedad de estudios preclínicos.Por lo general, las personas que son nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil ver qué tan bien se realizó la inyección. Las demostraciones visuales de este método son críticas, ya que los pasos de la inyección son difíciles de aprender sin verlos realizad

performing-subretinal-injections-rodents-to-deliver-retinal-pigment

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

Fuente: Park, S. W., et al. Abordaje limbal-inyección subretiniana de vectores virales para terapia génica en el epitelio pigmentario de la retina de ratones. J. Vis. Exp. (2015)El video describe el método para la inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en un modelo de ratón. Detalla el procedimiento desde la anestesia y la preparación ocular hasta la administración precisa del vector lentiviral, asegurando la integración y expresión génica en el...

Inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina en un modelo de ratón

La inyección subretiniana es una técnica quirúrgica para la entrega efectiva de genes al epitelio pigmentario de la retina en el ojo del ratón.  Aquí describimos un método fácil y replicable para la inyección subretiniana de vectores virales al epitelio pigmentario de la retina en ratones experimentales.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

Las inyecciones subretinianas son la técnica más común para administrar grandes agentes terapéuticos, como proteínas y vectores virales, a los fotorreceptores y al epitelio pigmentario de la retina. Aquí se describe un método alternativo en ratones que se dirige con éxito al espacio subretiniano con un daño colateral mínimo y tiempos de recuperación rápidos.

Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i&gt; vía</i&gt; Un enfoque posterior transescleral

Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

La implantación subretiniana de epitelio pigmentado retiniano (EPR) es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina. Sin embargo, el rendimiento de los estudios preclínicos en modelos animales de ojo grande sigue siendo un desafío. Este informe presenta pautas para el trasplante subretiniano de EPR en un portador de células en minicerdos.

Implantación subretiniana de EPR en un portador en minicerdos: pautas para preparaciones preoperatorias, técnicas quirúrgicas y cuidados postoperatorios

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Este artículo describe los métodos para la inyección subretiniana en ratas, utilizando la visualización intraoperatoria para controlar tanto el sitio de la inyección como el área de desprendimiento de retina.

Visualización intraoperatoria de la inyección subretiniana y el desprendimiento de retina en ratas

Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Aprende a realizar inyecciones subretinales en roedores para administrar células epitelio pigmentario retiniano con mínimo trauma. Este protocolo permite evaluar la supervivencia e integración celular mediante histología e imagen in vivo.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

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