Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades
1 de marzo de 2015
Este estudio adaptado con éxito videofluoroscópico tragar estudio (VFSS) métodos humanos para su uso con modelos de enfermedad murinos con el fin de facilitar la investigación traslacional disfagia.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la función de la deglución en roedores que se comportan libremente, lo que se conoce primero como estudio de deglución videofluoroscópico o VFSS. Se construye una cámara de alimentación para confinar a los roedores en un espacio pequeño durante las pruebas. El segundo paso es realizar el acondicionamiento conductual con una solución de prueba para garantizar la máxima participación.
El siguiente paso es realizar pruebas VFSS con los ratones preacondicionados. Por último, los vídeos se someten a un análisis fotograma a fotograma para cuantificar los parámetros de deglución. En última instancia, esta novedosa herramienta de evaluación se puede utilizar para detectar y caracterizar la disfagia en modelos de enfermedad espejo y proporcionar biomarcadores funcionales para su uso en ensayos preclínicos.
Primero tuvimos la idea de usar cámaras de observación porque las pruebas de VFSS en humanos son voluntarias y sin restricciones, y queríamos imitar de cerca el procedimiento clínico humano. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos similares existentes es que provoca rápidamente comportamientos de alimentación voluntarios en roedores para permitir pruebas rápidas de todas las etapas de la deglución. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el análisis de video porque los movimientos pequeños y rápidos de la deglución y los ratones son difíciles de discernir.
Comience ensamblando las cámaras de observación a continuación, ensamble un sistema de administración de jeringas para administrar la solución a los tazones de clavijas durante la prueba. Una vez montada, coloque la cámara de observación en un elevador de tijera motorizado para su posicionamiento remoto. La principal ventaja de la mesa elevadora de tijera con control remoto es la mejora de la seguridad radiológica para los investigadores, al tiempo que mantiene a los roedores que se comportan libremente en el campo de visión de la fluoroscopia.
Prepare a los ratones habituándolos a la cámara de observación y sometiéndolos a un período de regulación del agua durante la noche. Cuando esté listo para la prueba, retire la cámara de la jaula y límpiela a fondo. Use un marcador de borrado en seco para etiquetar cada tubo limpio antes de volver a colocarlo en la jaula de casa.
A continuación, prepare la solución de iohexol con sabor a chocolate para configurar el entorno de fluoroscopia. Utilice una cámara de observación de repuesto y un recipiente de clavijas para determinar la altura y la posición óptimas dentro del haz del fluoroscopio que permiten la visualización de la bebida en el plano lateral. Establezca la velocidad de fotogramas de la fluoroscopia en 30 fotogramas por segundo.
Se pueden utilizar velocidades de fotogramas más altas si están disponibles. Asegúrese de que un marcador de calibración radiopaco esté colocado adecuadamente en la cámara del fluoroscopio para que sea visible en la pantalla durante toda la prueba. Este paso es necesario para permitir la calibración de las mediciones de longitud para reducir el estrés debido a la manipulación.
Observa la jaula hasta que un ratón entre libremente en la cámara de observación. Una vez dentro, levante la cámara fuera de la jaula y coloque suavemente la segunda tapa del extremo. Con pruebas repetidas, se puede persuadir fácilmente a los ratones para que ingresen a la cámara cuando se coloca frente a ellos dentro de la jaula, o cuando están suspendidos por la cola sobre la abertura de la cámara.
Coloque la cámara de observación dentro de la máquina de fluoroscopia para comenzar la prueba VFSS en el plano lateral. A continuación, use un sistema de administración de jeringas para llenar el recipiente de clavijas con una solución de iohexol con sabor a chocolate. Inicie la grabación de la videofluoroscopia.
Cuando el ratón empiece a beber durante la prueba, utilice la mesa elevadora con mando a distancia para ajustar la posición de la cámara de observación de modo que el mecanismo de deglución sea visible en el campo de visión. Pausa la grabación cada vez que el ratón se aleje del recipiente para minimizar la duración de la exposición a la radiación. Reanude la grabación cuando el mouse regrese al tazón de clavijas, vuelva a llenar el tazón de clavijas según sea necesario.
El objetivo es registrar varios episodios largos de bebida continua, que es típico de la mayoría de los ratones. Dentro de los primeros dos minutos de la prueba, detenga la prueba si el ratón no bebe dentro de los cinco minutos, devuelva los ratones que no cumplan con la prueba a la jaula doméstica para volver a realizar la prueba en un momento posterior el mismo día. No exceda una regulación de agua de 24 horas.
Al probar varios ratones de la misma jaula doméstica. Limpie el recipiente de clavijas y el tubo con una toalla de papel seca entre ratones. Recorte la punta del tubo de PE según sea necesario.
Si se mastica durante la prueba, limpie la cámara de observación según sea necesario para eliminar cualquier salpicadura de iohexol en las paredes de la cámara. Enjuague la cámara con agua del grifo y séquela con una toalla de papel. Utilice un programa de software de edición de vídeo que permita el análisis fotograma a fotograma de las grabaciones de fluoroscopia de vídeo.
Para cuantificar los parámetros de deglución de interés, al menos dos revisores capacitados deben analizar cada video de manera ciega. El revisor principal ve cada video para identificar y analizar de tres a cinco episodios largos de bebida. Este criterio se basa en estudios de deglución no radiográficos publicados que muestran que este parámetro es suficiente para el análisis estadístico.
A continuación, el revisor secundario analiza de forma independiente las tres a cinco medidas por parámetro de deglución para cada ratón que fueron identificadas y analizadas inicialmente por el revisor principal. A continuación, se identifican las discrepancias de los revisores para cada ratón y se vuelven a analizar hasta que se alcanza el 100% de consenso. A continuación, se promedian los valores indiscutibles de cada parámetro de deglución para obtener el valor medio de cada ratón.
Cuando se obtengan menos de tres medidas para un parámetro de deglución, introduzca un valor que falte en la base de datos estadístico para esa medida. Estos ejemplos se obtuvieron utilizando una posición del sistema de fluoroscopia de baja energía. Uno permite la visualización de toda la cabeza y la región torácica proximal.
El punto gatillo de la deglución está centrado dentro del campo de visión. La posición dos permite la visualización desde el punto gatillo de la deglución hasta la unión gastroesofágica. Obsérvese que el bolo pasa a través del esófago distal incluso en el ajuste de aumento más bajo.
Las estructuras óseas de la cabeza y el cuello son fácilmente visibles utilizando el sistema de fluoroscopia de baja energía. Las estructuras anatómicas también se examinan con mayor aumento para permitir la cuantificación de varios parámetros adicionales de la deglución. Esta figura muestra hallazgos preliminares representativos para dos parámetros de deglución de VFSS, la tasa de deglución y la tasa de deglución entre degluciones fue significativamente más lenta para los ratones SOD 1 en comparación con los C 57 años.
El intervalo entre deglución de ratones y controles no fue significativamente diferente entre los grupos. Una vez dominado, la captura de video se puede completar en poco menos de dos minutos por masa si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar la solución de prueba con sabor a chocolate a las pocas horas de la preparación para evitar cambios en la viscosidad y la palatabilidad que pueden resultar en comportamientos de evitación.
Esta nueva técnica está allanando el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren los comportamientos naturales de alimentación y deglución en roedores sanos y modelos de enfermedades. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar con éxito las pruebas VFSS de roedores que se comportan libremente. Para cuantificar los comportamientos típicos de alimentación y la función de deglución, no olvide que trabajar con equipos emisores de radiación puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben seguir las precauciones de radiación para el tiempo, la distancia y el blindaje mientras se realiza este procedimiento.
Visión general
Este estudio adaptó con éxito los métodos de estudio de deglución por videofluoroscopia (VFSS) en humanos para su uso en modelos de enfermedades murinas, facilitando la investigación translacional de la disfagia. El procedimiento tiene como objetivo evaluar la función de deglución en roedores que se comportan libremente, imitando de cerca las prácticas clínicas humanas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis conductual
- Investigación translacional
Antecedentes
- El VFSS es un método estándar para evaluar la deglución en humanos.
- Este estudio tiene como objetivo replicar las técnicas VFSS en modelos de roedores.
- El método permite la observación de comportamientos de alimentación voluntaria.
- Proporciona una plataforma para detectar disfagia en modelos de enfermedades.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para estudiar la deglución en roedores.
- Crear biomarcadores funcionales para ensayos preclínicos.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de disfagia en modelos de enfermedades.
Métodos utilizados
- Construcción de una cámara de alimentación para el confinamiento de roedores durante las pruebas.
- Acondicionamiento conductual con una solución de prueba para garantizar la participación.
- Análisis de fotograma por fotograma de los videos VFSS para cuantificar los parámetros de deglución.
- Uso de un elevador de tijeras controlado a distancia para mejorar la seguridad radiológica.
Principales resultados
- El método provocó con éxito comportamientos de alimentación voluntaria en roedores.
- El análisis cuantitativo de los parámetros de deglución se logró mediante el análisis de video.
- El consenso entre los revisores garantizó una medición precisa de los parámetros de deglución.
- La técnica demostró potencial para identificar disfagia en modelos murinos.
Conclusiones
- Esta nueva adaptación VFSS es efectiva para estudiar la disfagia en roedores.
- El método proporciona una herramienta valiosa para la investigación preclínico de la disfagia.
- Los estudios futuros pueden construir sobre este marco para explorar la disfagia en varios contextos de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Adapting human videofluoroscopic swallow study (VFSS) methods to murine models enables early detection of dysphagia phenotypes in preclinical disease models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative and neuromuscular drug development. This approach provides functional biomarkers that bridge behavioral assays with clinical endpoints, improving predictive confidence in lead identification and preclinical progression decisions. By quantifying swallow physiology in freely behaving rodents, the method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying swallow physiology as a functional readout of brainstem and neuromuscular circuit integrity.
- Operational Value: Enables behavioral conditioning and voluntary feeding in confined spaces, reducing stress-induced variability in murine phenotyping.
- Scientific Value: Supports biological de-risking of targets involved in swallowing control, such as SOD1 in ALS models, by linking genetic manipulation to measurable dysphagia phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by standardizing swallow parameter quantification via frame-by-frame video analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through blinded dual-reviewer consensus and defined drinking bout criteria.
- Scientific Value: Highlights screening readiness and scalability by enabling rapid testing of multiple mice per session with remote-controlled chamber positioning.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by detecting genotype-specific differences in swallow rate and inter-swallow interval in SOD1 mice versus controls.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by providing quantifiable VFSS parameters that correlate with disease progression.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying 13 consistently quantifiable swallow parameters using low-energy fluoroscopy, nearly doubling the detection sensitivity compared to high-energy systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking of targets affecting bulbar function.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking by quantifying swallow mechanics as a proxy for neural circuit function in disease models.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article through standardized protocols, blinded analysis, and consensus-driven parameter measurement.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including swallow rate, inter-swallow interval, and bolus transit timing derived from frame-by-frame VFSS video analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by demonstrating genotype-dependent differences in swallow physiology that mirror clinical dysphagia endpoints.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized chamber design, flavored contrast agent protocols, and remote-operated imaging setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in brainstem-mediated phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of swallow phenotyping across murine cohorts and laboratories.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying dysphagia early in preclinical pipelines.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on functional biomarker data from VFSS in disease models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neurobehavioral testing, video fluoroscopy operation, and frame-by-frame video analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include fluoroscopy systems (preferably low-energy for high-resolution murine imaging), remote-controlled positioning tables, and video editing software for blinded review.
- Cross-team standardization requirements involve harmonizing chamber design, contrast agent preparation (e.g., chocolate-flavored iohexol), and drinking bout selection criteria across sites.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting chamber size, contrast agent palatability, and positional protocols for different rodent strains and disease severities.
- Practical limitations supported by source material include dependency on fluoroscope energy level for parameter detectability, with high-energy systems limiting quantification to seven parameters versus thirteen with low-energy systems.
