Alta definición Fourier Transform Infrared (FT-IR) espectroscópico de imágenes de cortes de tejidos humanos a la mejora de Patología

La imagen espectroscópica infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) es un enfoque rápido y sin etiquetas para obtener conjuntos de datos bioquímicos de células y tejidos. Aquí, demostramos cómo obtener imágenes FT-IR de alta definición de secciones de tejido para mejorar el diagnóstico de enfermedades.

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes infrarrojas de alta definición de muestras de tejido. Esto se logra seccionando primero las muestras de tejido en portaobjetos compatibles con infrarrojos. El segundo paso es configurar un aparato de imagen de alta definición mediante la instalación de los objetivos adecuados.

A continuación, se recoge el fondo del sustrato y se escanea la muestra de tejido. El último paso es utilizar un software adecuado para el procesamiento y la visualización de datos. En última instancia, las imágenes infrarrojas de alta definición se utilizan para visualizar y obtener información bioquímica de los tejidos biológicos de una manera no perturbadora.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía óptica, es que la bioquímica inherente del tejido se puede estudiar sin el uso de tintes o sondas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patología, como la predicción de la recurrencia de la nefropatía diabética y la clasificación de la progresión de la enfermedad hepática a través de la osteogénesis del coche HEPA. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad, dado que proporciona grandes cantidades de información bioquímica que no está disponible en la histopatología tradicional.

Aunque este método se puede utilizar para el diagnóstico. También se puede utilizar para rastrear los cambios en el proceso de cicatrización de heridas e identificar características clave de los tejidos, como las células madre en el tracto gastrointestinal y el cerebro. Primera sección de bloque de tejido incrustado en parafina formal y fija de cuatro micrómetros de espesor en un portaobjetos compatible con IR utilizando un micrótomo.

A continuación. Purgue el microscopio y el espectrómetro FTIR con aire seco para eliminar el agua atmosférica del sistema. Luego, enfríe tanto el detector de matriz de plano focal como el detector interno de telururo de mercurio y cadmio en el microscopio usando nitrógeno líquido, monte el portaobjetos de muestra en la etapa del microscopio para obtener imágenes FTIR después de asegurarse de que la luz visible esté encendida, concéntrese en la muestra usando el programa de captura de muestras.

A continuación, abra el paquete de software y haga clic en recopilar. Haga clic en diagnóstico y seleccione un espectrómetro de línea. A continuación, haga clic en configuración de imágenes para calibrar el sistema.

En la pestaña óptica, seleccione detector como detector de microscopio terrestre a la izquierda y, a continuación, seleccione transmitancia en modo óptico. Haga clic en configuración, lo que abrirá la ventana de control de lancer para el modo de transmisión en el control de lancer. Haga clic en raw con el joystick de control de escenario y observe cómo la vista en vivo de la imagen del interferograma FTIR se mueve a un área limpia de la diapositiva.

En este punto, ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 conteos y el objetivo del condensador inferior. Para aumentar el número de recuentos al máximo, observe la forma de la imagen inferior derecha en el control de lancer para asegurarse de que tenga un aspecto gaussiano y sea relativamente uniforme. Después de ajustar el tiempo de integración, nuevamente, mueva la etapa para encontrar un trozo de tejido con estructura, preferiblemente el borde de un tejido.

A continuación, perfecciona el enfoque de la imagen. Con el joystick de control de escenario, desplácese a un área limpia de la diapositiva. Presione el botón de calibración después de seleccionar.

Bien, dos veces en la pestaña de óptica, seleccione detector igual a MCT y detector de microscopio es igual a derecho. A continuación, haga clic en configuración. Una vez que se visualice el interferograma FTIR en la pantalla, haga clic en buscar ráfaga central y listo.

En la pestaña óptica, volver a seleccionar detector es igual a detector de microscopio de tierra es igual a izquierda. A continuación, seleccione configuración. Después de asegurarse de que la imagen todavía está en un área limpia en el control de lancer, haga clic en calibrar nuevamente y OK.

Para recopilar una imagen FTIR de fondo, vaya a la pestaña de electrónica y seleccione una resolución espectral adecuada, que suele ser de cuatro u ocho centímetros inversos. Para pañuelos, vaya a la pestaña de fondo y escriba 128 en escaneos para coad. Seleccione el botón nuevo archivo y coloque el archivo de fondo en la carpeta correspondiente.

Después de hacer clic en segundo plano y esperar a que finalice el escaneo, confirme dónde guardar el archivo. Haga clic en una región del fondo, imagen FTIR y compruebe el espectro. En este punto, haga clic en configuración y, en el control de Lancer, use la vista IR en vivo.

Para encontrar el área de interés, vaya a la pestaña de electrónica y escriba el número de escaneos que desea recopilar. Para preparar el microscopio FTIR para el análisis de alta definición, atornille el objetivo de gran aumento en lugar del objetivo de 15x. En este punto, abra el software de procesamiento y análisis de imágenes y cargue el archivo de datos IR.

Aplique un algoritmo de corrección de línea base a los datos IR seleccionando herramientas espectrales, desplácese hacia abajo y haga clic en espectros absorbentes. Cuando aparezca el menú emergente, seleccione Corrección de línea base. Realice la normalización espectral seleccionando espectros normalizados en las opciones del menú de espectros absorbentes.

A continuación, observe una lista de todas las frecuencias IR recogidas en la imagen. Haga clic en las frecuencias que corresponden a biomoléculas específicas para observar una imagen del tejido a la frecuencia seleccionada para crear imágenes que permitirán la visualización de diferentes componentes biomoleculares. Haga clic en herramientas espectrales y luego seleccione relaciones de altura de pico.

Escanee la sección de tejido teñido adyacente correspondiente utilizando un sistema de generación de imágenes de portaobjetos completo separado que captura imágenes de campo claro junto con la imagen IR. Abra la imagen digital del tejido teñido con el programa de imagen visible. A continuación, haga clic con el botón derecho en la imagen en una región de interés y seleccione el perfil Z para proporcionar la información espectral en el píxel seleccionado.

Para marcar píxeles específicos en la imagen, haga clic derecho en la imagen y seleccione la herramienta ROI. Cree las clases que se van a etiquetar, por ejemplo, las clases cápsula de Meum y Bowman. A continuación, seleccione el punto de tipo de ROI a continuación, seleccione la clase para seleccionar los píxeles y dibuje en los píxeles apropiados en la imagen IR.

Derive los espectros promedio para cada una de las clases utilizando la herramienta ROI promedio. Por último, compare los espectros derivados mediante trazados. En el software de gráficos, las imágenes FT IR permiten la derivación de imágenes IR de tejido que pueden dar diferentes contrastes dependiendo de la frecuencia IR.

Cada píxel está compuesto por todo el espectro con diferentes picos correspondientes a diferentes biomoléculas que pueden dar información sobre las propiedades bioquímicas de los tipos de células o los estados de enfermedad. La instrumentación FTIR ha evolucionado desde la medición en un modo de mapeo de un solo punto utilizando aperturas opacas hasta el modo de imagen utilizando objetivos de grano CASA utilizando un objetivo iluminador, junto con un objetivo colector en modo de transmisión, o un solo objetivo que ilumina y recoge en modo de reflexión. Los avances en la resolución espacial de las imágenes de tejidos han sido de vital importancia, ya que ahora se pueden identificar los tipos de células y las estructuras de los tejidos.

En este caso, se observaron las unidades funcionales de los glomérulos renales en un núcleo de tejido hepático. Es posible visualizar hepatocitos y regiones de fibrosis infiltrante que dividen dos áreas distintas de displasia y cirrosis no displásica. El aumento de la resolución espacial permite el aislamiento de características estructurales específicas que pueden ser modificadas químicamente por la enfermedad antes de que los cambios histológicos sean evidentes.

Los cambios bioquímicos en las estructuras glomerulares del riñón, como la cápsula de Bowman, el meum, la membrana basal glomerular y la membrana basal tubular, se pueden identificar mediante imágenes FTIR. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe esperar completamente las diapositivas antes de escanear Después de este procedimiento. Otros métodos, como el análisis inmunoquímico tradicional, se pueden realizar en la misma sección de tejido para correlacionar las firmas bioquímicas y la morfología del tejido.

Nuestra primera técnica, nuestro primer desarrollo, allanó el camino para que los investigadores en el campo de la imagen de tejidos exploraran el estado biomolecular de los tipos de células pequeñas y las estructuras dentro de los tejidos. Después de ver este video, debe tener una comprensión básica de cómo obtener imágenes FTR de alta definición de muestras de tejido y realizar análisis espectrales básicos. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones de seguridad, como guantes crioseguros y gafas de seguridad, mientras se realiza este procedimiento.