Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

El objetivo general de este procedimiento es examinar el control respiratorio en las mitocondrias, aisladas del tejido del músculo esquelético biopsiado. Esto se logra obteniendo primero una pequeña cantidad de músculo mediante una biopsia percutánea con aguja. El segundo paso es aislar las mitocondrias del músculo biopsiado mediante homogeneización.

A continuación, las mitocondrias aisladas se lavan y se separan de las fracciones no mitocondriales mediante centrifugación y se pasa la muestra a través de una gasa. El paso final es colocar una placa en las mitocondrias aisladas para realizar un análisis respirométrico a través de ensayos de flujo extracelular para visualizar la tasa de consumo de oxígeno. En última instancia, el analizador de flujo extracelular de caballito de mar se utiliza para examinar el control respiratorio en mitocondrias aisladas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que requiere una cantidad mínima de tejido muscular de tan solo 20 miligramos y limita la variabilidad interexperimental. Estas características hacen que esta técnica sea adecuada para aplicaciones de investigación clínica. Las implicaciones de esta técnica son para el diagnóstico de la disfunción mitocondrial en los pacientes.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la biopsia muscular y el aislamiento mitocondrial requieren manipulaciones precisas que se demuestran mejor visualmente en lugar de describirse únicamente en el texto. Para realizar la biopsia localmente, administrar lidocaína al 1%, teniendo cuidado de no infiltrar el músculo. Siga esto con un período de espera de 10 minutos.

Para permitir un adormecimiento suficiente, tome las biopsias de la región media del músculo entre la inserción y el origen, evitando las áreas subfasciales y miotendinosas. Para lograr esto primero, use una aguja percutánea y siga un estallido fascial o resistencia de la fascia como guía. Calcule la profundidad con la aguja de anestesia, luego tóquela con la hoja estrecha del bisturí y haga una incisión de cuatro a cinco milímetros a través de la fascia.

Haga avanzar la aguja a través de la incisión hasta que se inserte en el músculo. Recoja varias muestras con la ventana girada en diferentes direcciones. Aplique succión continua con una jeringa de 60 centímetros cúbicos mientras avanza y retira muestras de músculo en la aguja percutánea de dos a cuatro veces en diferentes direcciones.

Suspenda la succión y retire la aguja. Pídele a un asistente que aplique una presión firme en el sitio de la punción durante cinco minutos. Para establecer la hemostasia, desconecte la aguja del tubo de succión y retire con cuidado las muestras de músculo de la ventana y el barril.

Haga una segunda pasada si se necesita más músculo repitiendo este procedimiento. Retire los coágulos de sangre visibles de la muestra de músculo con pinzas. A continuación, pese la muestra y colóquela inmediatamente en un tubo que contenga hielo.

ECCO fríos, solución salina tamponada con fosfato o DPBS. Retire el tejido conectivo visible de la muestra con tijeras afiladas y pinzas. Minuciosamente. Lave las muestras de tres a cuatro veces con tampón DPBS helado.

Para extraer la sangre, mantenga las muestras en DPBS heladas y procese lo antes posible. Dentro de los 45 minutos posteriores a la biopsia, tome la precaución de extraer cuidadosamente cualquier tendón o tejido adiposo de la muestra de músculo. Retire una pequeña porción de cualquier tejido adicional para almacenarlo a menos 80 grados centígrados.

Esto se puede utilizar para otros experimentos, como las manchas occidentales. Corta inmediatamente el tejido muscular en trozos finos. Usando un par de tijeras estériles, luego suspenda en 500 microlitros a un mililitro de un inhibidor de la ECA de la proteína Sixtina, como nagars disueltos en CP un tampón a una concentración de 0,2 miligramos por gramo de tejido.

Picar la muestra hasta que aparezca bien suspendida. Siga esto con una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente antes de transferirlo a hielo, asegurándose de que el homogeneizador esté completamente lavado. De antemano. Homogeneizar el tejido picado tratado con nagars.

Utilizando un homogeneizador automatizado. Mantenga la muestra en hielo durante todo el proceso. Homogeneice cada muestra de tejido cuatro veces cada vez durante un pulso de dos segundos.

Utilizando el homogeneizador automático a una velocidad de 10.000 RPM, vuelva a colocar la muestra en hielo. Lave la sonda con etanol al 70% seguido de agua destilada entre pañuelos. A continuación, lavar el tejido homogeneizado con un volumen igual de tampón chapel Perry one o CP one.

A continuación, lave el pañuelo con el doble del volumen de tampón CP dos. Añada el tubo de equilibrio llevando el agua hasta el mismo volumen en otro tubo cónico. Recoja el contenido en un tubo de centrífuga y centrifuga a 600 GS, cuatro grados centígrados o 10 minutos, humedezca previamente la gasa para permitir que todas las partículas pasen y no queden atrapadas en la tela.

Pasar el sobrenadante a través de una gasa casada, recogiendo el filtrado y desechando el pellet, eliminando así la mayoría de las fracciones no mitocondriales. A continuación, ultracentrífuga el sobrenadante a 10.000 GS cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Suspenda el pellet en cuatro mililitros de tampón CP dos antes de centrifugar por segunda vez de la misma manera después de la centrifugación.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el paté en dos mililitros de CP un tampón. En este punto, coloque una pequeña alícuota de esta suspensión en un tubo de ensayo separado que se utilizará para la estimación de proteínas. Resus, suspender la muestra restante en CP un tampón y centrífuga.

Al igual que antes, tenga en cuenta que la placa de proteínas debe configurarse con los estándares durante los pasos de centrifugación anteriores. Finalmente, vuelva a suspender el gránulo final en una cantidad mínima de solución o masa de ensayo mitocondrial. Realice ensayos XF para visualizar la tasa de consumo de oxígeno u OCR en picomoles de oxígeno por minuto o niveles absolutos de oxígeno y pH.

En la salida de datos. Agregue una concentración de 10 x de los compuestos en una masa X a los puertos A a D del respirómetro basado en placa para obtener una concentración final como se indica en el protocolo de texto. Prepare un volumen suficiente de compuestos para el número requerido de pozos.

Utilice los cálculos de proteínas medidos anteriormente para determinar las concentraciones de mitocondrias que se agregarán. Determine la cantidad óptima de mitocondrias ajustando un microgramo, 2,5 microgramos y cinco microgramos de mitocondrias por pocillo. De la placa de 24 pocillos para minimizar la variabilidad entre pozos.

Primero diluir 10 x mitocondrias en frío, una x masa más sustrato. A continuación, entregue 50 microlitros de esta suspensión a cada pocillo. Dejando cuatro pozos que contenían solo 50 microlitros de masa para ser utilizados como lecturas de fondo.

Coloque la placa de calibración preempapada junto con el cartucho superior de antes en el respirómetro para realizar la calibración del instrumento. Preparándose para la prueba de la placa, centrifugar la placa a 2000 GS durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación.

Agregue suavemente 450 microlitros de una x masa, más el succinato y la podredumbre conocida por cada uno. Observe las mitocondrias bajo el microscopio para garantizar una adherencia homogénea al pocillo antes de transferir la placa al analizador XF. Secuencialmente. Mida la respiración mitocondrial en tiempo real usando el respirómetro programándolo usando la configuración del respirómetro proporcionada en el protocolo de texto que se muestra aquí son perfiles métricos típicos de Respiro impulsados por el complejo dos usando un microgramo, 2.5 microgramos y cinco microgramos de mitocondrias como se esperaba.

En general, el OCR aumenta con mayores cantidades de mitocondrias. El índice de control respiratorio o RCR calculado para este ensayo es de 7,95, lo que indica que la preparación mitocondrial es de alta calidad con el fin de comparar la consistencia de los resultados al perfilar diferentes cantidades de mitocondrias, se realizó un análisis de variantes o Inova y se calculó la suma de cuadrados. La suma de cuadrados o SS se presenta para el estado dos, el estado tres, el estado tres, la antimicina A desacoplada y el RCR para las mediciones del estado dos y el estado tres de una manera.

Innova fue estadísticamente significativo, así como para ANTIMICINA y RCR. No se observaron diferencias significativas para el estado tres desacoplado entre los grupos. Estos resultados indican que cinco microgramos de mitocondrias por pocillo dieron el SS más bajo en comparación con otras concentraciones.

Este gráfico sirve como guía para indicar cuánta proteína mitocondrial se puede esperar en función del tamaño inicial de la muestra muscular. Como era de esperar, existe una fuerte correlación entre la cantidad de músculo procesado y el contenido total de proteínas mitocondriales de la muestra final. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de tres horas si se realiza correctamente.

Después de la biopsia muscular, es importante asegurarse de que el paciente no tome aspirina o ibuprofeno u otros medicamentos no esteroideos de venta libre durante los próximos tres días para garantizar que haya una buena cicatrización de los tejidos que hemos biopsiado. Lo siguiente es que queremos asegurarnos de que no hagan ninguna actividad extenuante también durante el próximo día y medio, por lo que nada como discordar. Eso sería un trampolín de baloncesto, pero pueden hacer sus propias actividades normales.

También pedimos que mantengan la zona seca durante 24 horas, pero la primera vez que se moje que estén en una ducha para que no entre en la incisión ningún tipo de bacteria que pueda haber en la piel que no hayamos limpiado. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo hacer una biopsia del tejido del músculo esquelético lateral S, aislar las mitocondrias y medir el control respiratorio.