Un procedimiento quirúrgico para resecar la costilla del ratón: un modelo a gran escala Reparación huesos largos
21 de enero de 2015
El objetivo general de este procedimiento es resecar con éxito una porción de hueso de la costilla de un ratón. El procedimiento se desarrolló como modelo para estudiar la reparación de huesos largos a gran escala.
El objetivo de este procedimiento es crear una resección a gran escala en la porción ósea de una costilla como modelo para la reparación esquelética. Esto se logra primero creando y abriendo una incisión a través de la piel en el lado lateral del animal. El segundo paso consiste en exponer el hueso de la costilla que se va a eliminar.
A continuación, se extrae una porción del hueso costal junto con la vaina de tejido conjuntivo circundante o el periostio, o dejando el periostio en su lugar. El paso final consiste en cerrar las incisiones y permitir que el animal se recupere. En definitiva, este modelo de reparación ósea puede utilizarse para mostrar los eventos celulares y moleculares que ocurren durante la reparación esquelética a gran escala.
En un mamífero, la demostración visual de este método es fundamental, ya que la manipulación de los instrumentos quirúrgicos requiere precisión y una cirugía exitosa implica saber la ubicación de los diferentes tejidos. Marissa Roar y Nikita Tripper, ambas estudiantes de posgrado en mi laboratorio, realizarán la demostración del procedimiento. Después de preparar el área quirúrgica y las herramientas y suministros estériles necesarios, induzca la anestesia colocando un ratón en una cámara de inducción con 4 % de fluoruro de isoflurano.
Una vez que el ratón esté anestesiado, aplique ungüento en los ojos del ratón y confirme la profundidad de la anestesia. Al realizar un pellizco en el dedo del pie, no debe haber ninguna reacción al pellizco. Coloque el ratón sobre o adyacente a una almohadilla térmica en la plataforma de un microscopio estereoscópico, con el cono nasal del tubo de mantenimiento de anestesia colocado sobre la nariz del ratón.
Asegúrese de que el ratón esté en posición lateral. Ajuste el isoflurano a dos a 3 % para mantenimiento y observe la frecuencia respiratoria. A continuación, inyecte buprenorfina por vía subcutánea mediante una aguja de calibre 25.
Para el dolor postoperatorio preventivo, la pierna puede presentar espasmos, lo cual es una respuesta normal. Primero, seleccione la costilla deseada palpando desde la costilla más rostral, que se cuenta como número uno. En este video, se eliminará una porción de la costilla número 10.
Afeite el área sobre la costilla y luego limpie con yodo-povidona, seguido de isopropanol tres veces. Después de realizar una incisión de dos centímetros a través de las capas de piel, músculo y grasa por encima de la costilla que se va a extirpar, coloque las tres capas en un retractor para exponer el área quirúrgica, minimizando así el tamaño de la incisión. A continuación, utilice un escalpelo de cinco milímetros para cortar a través de los músculos intercostales por encima de la costilla en un punto ubicado cinco milímetros proximal a la articulación costovertebral, donde la costilla no tiene tanta curvatura. Luego, separe cuidadosamente el músculo del hueso con pinzas de punta fina.
A continuación, para crear una resección conservando el periostio en el animal, corte a través del periostio a lo largo del largo del hueso costal. Luego, utilice pinzas de punta fina para separar muy cuidadosamente el delicado periostio lateralmente del hueso subyacente. Si es necesario, mida la resección con un micrómetro en el microscopio o con una regla calibradora.
Luego, utilice tijeras microfinas para realizar una sección transversal a través del hueso. En un extremo, levante cuidadosamente el hueso del periostio y corte el otro extremo inmediatamente. Coloque la costilla extraída en paraformaldehído al 4% para su análisis posterior.
Si ocurre sangrado como resultado de cortar el hueso, aplique presión en el extremo cortado con un hisopo de algodón durante cuatro a cinco segundos para detener el sangrado. Para cerrar la incisión, sutúre los músculos intercostales sobre la parte superior de la vaina periostea restante con tres o cuatro suturas descontinuas de 9-0. Coloque las suturas directamente encima de los extremos cortados de la costilla para que sirvan como indicadores de la ubicación quirúrgica.
Retire el retractor y luego suture el músculo y la grasa superpuestos con puntos separados de calibre nueve cero. Suture cada capa por separado en ratones con capas particularmente gruesas de músculo o grasa. Cierre la piel con cuatro a cinco puntos de calibre 7 0 y luego asegure la incisión con adhesivo tisular.
Presionar los bordes juntos con fórceps grandes. Reducir lentamente la concentración de isoflurano ajustándola a 1 % durante unos minutos y luego apagar el isoflurano. Colocar al ratón bajo una lámpara de calor y dejarlo hasta que recupere la conciencia.
Después de que el ratón recupere la conciencia y durante todo el período de curación, debe moverse y desplazarse con normalidad y no mostrar signos de malestar. Una vez que la incisión esté seca, coloque al ratón en una jaula limpia con acceso libre a alimento y agua. Las hembras pueden alojarse juntas, pero los machos deben alojarse por separado para evitar peleas, y debe proporcionarse manejo del dolor posoperatorio, incluyendo la administración de buprenorfina en forma oral de gel a 0,5 miligramos por kilogramo cada 12 horas durante 48 horas.
La administración oral no requiere inmovilizar al animal, lo cual podría causar dolor en la región torácica. Esta imagen muestra una resección de 4,5 milímetros de una costilla recogida inmediatamente después de la cirugía. No quedan fragmentos óseos.
La muestra fue teñida con rojo de zarin y aclarada en glicerol al 80 %. La punta de flecha indica la ubicación de los extremos cortados. Esta es la porción de costilla removida de la caja torácica en la imagen anterior, sin el periostio adherido.
La sección histológica teñida con hematina y eosina que se muestra aquí ilustra que hay un periostio mínimo adherido al hueso, como indica la punta de flecha amarilla a la izquierda, y ningún periostio a la derecha. El asterisco amarillo indica la cavidad de la médula ósea. Esta imagen muestra un fragmento de costilla extraído con el periostio aún adherido, y esta sección histológica muestra el periostio intacto que recubre el hueso, como indica el corchete amarillo.
El asterisco amarillo indica nuevamente la cavidad de la médula ósea. Esta imagen muestra una preparación esquelética después de dos meses de curación tras la resección con el periostio intacto dentro del ratón; puede observarse una reparación completa de la región. Esta sección histológica de la preparación esquelética mostrada anteriormente demuestra la restauración de las paredes del hueso laminar y de la cavidad de la médula ósea.
Esta imagen muestra una preparación esquelética tras tres meses de cicatrización. Tras la eliminación de una porción de la costilla y del periostio circundante, solo hubo una reparación mínima en el extremo cortado, que se observa a la izquierda del panel. La punta de flecha amarilla señala la articulación chocos.
Esta sección histológica de la preparación esquelética mostrada previamente muestra tejido de granulación, tejido adiposo y células musculares rellenando el sitio de la resección. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora si se sigue correctamente este procedimiento. Otros métodos, como crear una resección en la porción cartilaginosa de la costilla, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cómo ocurre la reparación a gran escala del cartílago?
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una resección en la porción ósea del hueso costal con el fin de estudiar la reparación esquelética.
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Resumen
Este procedimiento tiene como objetivo crear una resección a gran escala en el hueso costal de un ratón, sirviendo como modelo para estudiar la reparación esquelética. El método implica una incisión, la exposición de la costilla y la eliminación del hueso, seguido del cierre de la incisión.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Reparación ósea
- Modelado esquelético
- Cirugía animal
Antecedentes
- Comprender los mecanismos de reparación esquelética es fundamental para desarrollar tratamientos.
- Este modelo permite a los investigadores observar eventos celulares y moleculares durante la cicatrización ósea.
- La resección de costillas proporciona información sobre los procesos de reparación ósea a gran escala.
- Los modelos animales son esenciales para estudios in vivo de regeneración ósea.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo para estudiar la reparación de huesos largos a gran escala.
- Investigar los procesos biológicos implicados en la reparación esquelética.
- Proporcionar un marco para investigaciones futuras sobre la cicatrización ósea.
Métodos Utilizados
- Incisión realizada en el lado lateral del ratón.
- Exposición del hueso costal seleccionado para su extracción.
- Resección de la costilla junto con el periostio o sin él.
- Cierre de las incisiones para permitir la recuperación.
Resultados principales
- El procedimiento demuestra con éxito la resección de costillas.
- Proporciona un modelo confiable para estudiar la reparación esquelética.
- Facilita la observación de los procesos de curación in vivo.
- Contribuye a la comprensión de los mecanismos de regeneración ósea.
Conclusiones
- Este modelo es eficaz para estudiar la reparación ósea a gran escala.
- Permite examinar los eventos celulares y moleculares durante la cicatrización.
- Estudios futuros pueden basarse en esta metodología para obtener mayores conocimientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La reparación a gran escala del hueso sigue siendo un desafío crítico en la investigación traslacional del sistema músculo-esquelético, con modelos preclínicos limitados que recapitulan dinámicas robustas de curación. El modelo de resección de costilla en ratón ofrece un sistema reproducible y accesible para investigar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la regeneración del hueso largo. Este modelo permite a los equipos de biofármacos evaluar los procesos de reparación y las contribuciones del periostio, aportando información para la validación de dianas y la reducción de riesgos en programas tempranos de reparación ósea.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación mecanicista de las vías de reparación ósea dependientes e independientes del periostio.
- Apoya la validación funcional de dianas candidatas implicadas en la regeneración esquelética.
- Facilita la reducción del riesgo biológico al distinguir los contribuyentes celulares a la cicatrización ósea.
- Proporciona una plataforma para estudios comparativos de la eficacia de reparación en diferentes intervenciones genéticas o farmacológicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece un sistema estandarizado y reproducible in vivo para evaluar los resultados de la reparación ósea.
- Permite la evaluación cuantitativa de la reparación mediante puntos finales histológicos y de imagen.
- Apoya el desarrollo de ensayos para medir las contribuciones del periostio y de la médula a la regeneración.
- Posibilita la selección de compuestos o biológicos con actividad pro-regenerativa en un entorno controlado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad de lesiones esqueléticas a gran escala y su reparación.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de estrategias de curación ósea.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos con eficacia demostrada in vivo.
- Apoya la identificación de biomarcadores para estudios traslacionales en regeneración ósea.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este modelo se integra en la continuación de descubrimiento a preclínico para la reparación del sistema músculo-esquelético, conectando estudios mecanicistas iniciales y la evaluación de candidatos traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre los roles del periostio y la médula en la regeneración ósea.
- Selección: Proporciona puntos finales cuantitativos y reproducibles para la evaluación de la reparación.
- Análisis: Permite mediciones basadas en histología e imágenes de la cicatrización ósea y la composición de los tejidos.
- Investigación Traducional: Ofrece un sistema relevante para enfermedades en la validación preclínica de estrategias regenerativas.
- Reutilización Empresarial: Sirve como una plataforma reutilizable para diversas investigaciones sobre reparación ósea en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los mecanismos de reparación ósea y en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza la evaluación de la reparación ósea in vivo con una metodología escalable y accesible.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de activos para la regeneración ósea al proporcionar datos preclínicos sólidos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos con eficacia de reparación demostrada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia quirúrgica en modelos de animales pequeños y manejo preciso de los tejidos.
- Necesita acceso a infraestructura para análisis histológicos, de imágenes y cuantitativos.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos quirúrgicos y analíticos para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a estudios de mecanismos de reparación dependientes e independientes del periostio.
- Limitado a la investigación preclínica; la extrapolación traslacional requiere validación adicional.
