Name: Un procedimiento quirúrgico para resecar la costilla del ratón: un modelo a gran escala Reparación huesos largos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a realizar una resección costal en ratones para estudiar la reparación ósea a gran escala. Este modelo quirúrgico permite observar eventos celulares y moleculares durante la regeneración esquelética in vivo.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Mariani por la lectura crítica del manuscrito. Nuestras fuentes de financiamiento fueron: la beca de investigación Baxter Medical Scholar (a M.K.S.), las becas de pregrado de la USC y las becas Provost, Dean Joan M. Schaeffer, y Rose Hills, (a M.K.S.). También reconocemos una beca CIRM BRIDGES a través de Pasadena City College (a T.T.T). y el Fondo de Investigación e Innovación James H. Zumberge, la Iniciativa de Medicina Regenerativa de la USC y el NIAMS NIH bajo el Premio Número R21AR064462 (a F.V.M).

NOTA: Todos los procedimientos se ajustan con un animal protocolo aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad del Sur de California. 1. Preparación para la Cirugía <ol><li> Coloque los instrumentos quirúrgicos y suministros necesarios (esterilizada, artículos 1 a 18 en la lista de materiales) y organizar un microscopio de disección y una fibra óptica de trans-iluminador en una campana o en una mesa de aspiración. </li><li> Coloque un ratón sexualmente maduros (20 - 30 g, 1 - 3 meses de edad) en una cámara de inducción con 4% de isoflurano para inducir la anestesia. </li><li> Confirme la anestesia con una pata y / o prueba del pellizco cola. </li><li> Aplique una pomada para los ojos del ratón para evitar la sequedad del ojo durante la cirugía. </li><li> Mueve el ratón a la platina del microscopio. Coloque el ratón en el cono de la nariz de la manguera de mantenimiento y posicionar lateralmente. Proporcionar una bolsa de calentamiento adyacente al animal para ayudar a mantener la temperatura corporal. NOE:. Posición del ratón depende de la preferencia y / o uso de las manos del cirujano personal, lateral izquierda o derecha está muy bien. </li><li> Ajuste isoflurano al 2-3% para el mantenimiento, y ver la frecuencia respiratoria. </li><li> Inyectar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea (flanco lateral de la pierna) para el dolor después de la cirugía con una aguja 25 G. La pierna puede contracción que es una respuesta normal. </li></ol> Incisión 2. Apertura <ol><li> Detectar la costilla deseada por palpación, y limpiar la zona de pelo con una maquinilla de afeitar. NOTA: Costillas 8-10 se recomiendan desde las costillas 1-7 están más cerca de los pulmones y 11-13 son considerablemente más cortos. Contando las costillas debe comenzar con la costilla más rostral como número 1. </li><li> Prepare el área con la alternancia de povidona yodada y el isopropanol (70%) hisopado (3x se recomienda a menudo por los protocolos de uso animal). </li><li> Cortar una incisión de 2 cm a través de la piel, directamente arriba y paralela a la costilla deseado con tijeras de microcirugía de tamaño medio. Inc¿Estee a través de las capas de músculo y grasa subyacentes. </li><li> Coloque todos los 3 capas (piel, músculo, grasa) en un retractor para exponer el área quirúrgica, y reducir al mínimo el tamaño de la incisión. </li></ol> 3. Ablación la costilla <ol><li> Corte a través de los músculos intercostales suprayacentes la sección deseada de la costilla con un bisturí 5,0 mm. Posición de esta incisión alrededor de 5 mm proximal a la articulación condrocostal ya que es donde la costilla no es tan altamente curvada. Separar cuidadosamente el músculo del hueso con unas pinzas de punta fina. </li><li> Para crear una resección al tiempo que conserva el periostio en el animal, cortar a través del periostio, a lo largo de la longitud de la costilla con un bisturí 5,0 mm. Separar cuidadosamente el periostio del hueso subyacente lateralmente con unas pinzas de punta fina. Proceda con precaución, ya que el periostio es muy delicada y tiene una consistencia gelatinosa. </li><li> Siguiente hacer una sección transversal a través del hueso en un extremo con finas micro-tijeras. Si es necesario, medir la resección conuna retícula en el microscopio o un medidor de tipo regla. A continuación, levante con cuidado el hueso del periostio y cortar el otro extremo. NOTA: Proceda con precaución. Este es el paso más delicado, ya que tirando hacia arriba sin extirpar el nervio continuación se rompa la membrana pleural y dar lugar a un neumotórax. Si se rompe la membrana pleural este será fácilmente evidente como el interior de la cavidad torácica se hará visible. </li><li> Si el sangrado se produce como resultado de cortar el hueso, aplicar presión en el extremo de corte con un hisopo de algodón con punta de 4 - 5 segundos para detener el sangrado. NOTA: En las raras ocasiones en que el sangrado continúa, puede que sea necesario para detener y practicar la eutanasia del animal pérdida de sangre tan significativo comprometerá recuperación (sin reposición de líquidos, el volumen máximo de sangre que puede ser con seguridad se pierde es el 10% del volumen total de sangre o 7.7 -. 8 l / g Para un 25 g de ratón, esto es equivalente a alrededor de 180 a 200 l 9). </li><li> Coloque inmediatamente la costilla eliminado en4% PFA para el análisis futuro. NOTA: Si la resección de tanto el hueso y el periostio se llevará a cabo, omita la incisión periostio y la separación (paso 3.2). Desde el periostio está muy estrechamente unida a la membrana pleural proceder con cautela, las burlas la nervadura de distancia de la membrana pleural con pinzas para evitar que se rompa. </li></ol> 4. Cierre de la incisión <ol><li> Suturar los músculos intercostales sobre la parte superior de la manga perióstica restante con 9-0 suturas (2 suturas suelen ser suficientes). Coloque las suturas directamente sobre los extremos cortados de la costilla, para actuar como indicadores para la ubicación de la cirugía. </li><li> Retire el retractor. Suturar el músculo y la grasa que recubre con 9-0 suturas (3-4 suturas suelen ser suficientes). En ratones con capas particularmente gruesas de músculo y / o grasa, suturar cada capa por separado (por ejemplo, 1 capa de suturas para la capa muscular y 1 capa de suturas para la capa de grasa). </li><li> Cierre lapiel con 7-0 suturas (4-5 suturas suelen ser suficientes). </li><li> Asegure la incisión con pegamento de sutura, pellizcar los bordes juntos con grandes pinzas. </li><li> Lentamente destetar el ratón fuera isoflurano ajustando primero al 1% durante unos minutos y luego se apagará. </li><li> Coloque el ratón bajo una lámpara de calor y dejar hasta que se recupere la conciencia, 5-10 min. Después de la conciencia se recuperó y en todo el período de cicatrización, el ratón debe moverse y deambular normalmente y no muestran signos de sufrimiento. </li></ol> 5. Recuperación y análisis <ol><li> Proporcionar el manejo del dolor postoperatorio incluyendo la administración de buprenorfina en forma de gelatina oral a 0,5 mg / kg cada 12 horas durante 48 horas. La administración oral no requiere restringir el animal que puede provocar dolor a la región torácica. </li><li> Mantener el ratón en una jaula con libre acceso al alimento y agua durante el período de cicatrización. Después de la incisión es seco, las hembras pueden co-alojados mientras que el varóns debe permanecer aislado para evitar enfrentamientos. </li><li> Tras el período de cicatrización, siga el procedimiento aprobado por la eutanasia. Retire la caja torácica para la fijación y el análisis. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La primera vez que el aprendizaje de este protocolo, determinar dónde ubicar la incisión inicial puede ser un reto. Sin embargo, la práctica en los ratones sacrificados ayuda al cirujano a aprender dónde colocar la incisión inicial y exponer el nervio deseado para ser resecado. Trabajando en cadáveres también mejora las habilidades motoras finas requeridas para eliminar la porción de la costilla con o sin el periostio. Además, alguien nuevo en este procedimiento podría encontrar la manipulación de las herramientas y fin...

Debilitante lesión esquelética, la osteoartritis crónica y los problemas graves asociados con la cirugía reconstructiva impactar la productividad económica, el bienestar de la familia, y la calidad de vida. Mientras que las pequeñas roturas y lesiones pueden sanar bastante bien, los seres humanos no son capaces de reparar defectos grandes y por lo tanto deben confiar en los procedimientos de reconstrucción para restaurar la estructura y función. Reconstrucción puede implicar injertos alogénicos o heterogeneic, hueso morcelado, andamios implantados, o osteogénesis de distracción. Desafortunadamente, no sólo hay factores de morbilidad persistentes asociados con estos tratamientos, pero la resistencia original del hueso reparado raramente se alcanza. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques clínicos. De una vía para desarrollar métodos innovadores para el tratamiento de defectos segmentarios es estudiar situaciones en las que la reparación a gran escala se produce de forma natural. Anfibios famoso puede regenerar elementos esqueléticos, mientras que los mamíferos se consideran limitadas en ºes la capacidad. Sin embargo, desde principios del siglo 20, algunos informes de la regeneración de la costilla humana se han publicado lo que sugiere que los seres humanos no pueden ser tan limitados 1-4. Actualmente este fenómeno es el más conocido por los cirujanos plásticos que utilizan material de la costilla de la mandíbula, la cara y la oreja de reconstrucción, pero no es más ampliamente apreciado 5. Para estudiar esta reparación con más detalle, hemos desarrollado un modelo quirúrgico con el ratón. El uso de este protocolo, los investigadores pueden identificar los factores innatos involucrados y utilizar esta información para facilitar la curación esquelético en otros lugares. Hay muchas ventajas de utilizar las nervaduras como un modelo para estudiar la reparación esquelética. En primer lugar, las costillas que rodean proporcionan un fijador natural (en comparación con la resección del fémur 6,7). Esto disminuye el riesgo de morbilidad de fijadores internos y externos y simplifica el procedimiento quirúrgico. En segundo lugar, las capas musculares delgadas de los wa pecholl proporcionar un fácil acceso y una excelente visibilidad que hacen que el ensayo comparables a la comodidad de las resecciones de calota 8. En tercer lugar, en contraste con la calotas que forman por la osificación intramembranosa, la forma de las costillas por la osificación endocondral y crecer en longitud a través de la extensión en placas de crecimiento situados en cualquier extremo de una diáfisis central. Por lo tanto, la reparación de los nervios puede ser más comparable a la reparación de los huesos largos del esqueleto apendicular. Además, hemos encontrado que en comparación con el fémur, el periostio de la costilla es más gruesa y puede ser más fácilmente manipulada. Por lo tanto, los investigadores que desean ensayar la reparación del hueso con el propósito de estudiar el periostio o probar terapias celulares, agentes farmacológicos, y / o andamios de tejido pueden encontrar este modelo quirúrgica útil. En resumen, este modelo de resección de costilla proporciona un contexto en el que para estudiar la reparación ósea a gran escala natural en mamíferos como tal modelo de uso general en la actualidad existe.

<table><tbody><tr><td>Tijeras de microdisección de tamaño mediano (Vannas-T&uuml; Tijeras de resorte bingen 5 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección finas (Tijeras de resorte Vannas - borde de corte de 2 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td>la punta curva es beneficiosa</td></tr><tr><td>Microbisturí 5.0 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10315-12</td><td>otros bisturíes finos pueden ser sustituidos</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Retractor&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>17004-05</td> la <td>capacidad de ajuste es conveniente</td></tr><tr><td>Soportes de microagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>9.0 suturas de nailon (Ethilon), punta cónica mejor</td><td>Ethicon</td><td>2819G o punto cónico similar</td><td>mejor, pero el corte inverso también es bueno</td></tr><tr><td>7.0 suturas de prolene (Prolene)</td><td>Ethicon</td><td>8700H o similar</td><td>6-0 también se puede usar, la punta de la aguja puede variar</td></tr><tr><td>Pinzas grandes (Pinzas de Adson)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td>otras marcas son finas</td></tr><tr><td>Pomada lubricante para los ojos (Akwa Tears)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento para suturas (GLUture Topical Tissue Adhesive)</td><td>Abbot</td><td>32046-01</td><td>tiene un excelente tiempo de trabajo</td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Wahl</td><td>9918-6171 o similar</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de pinza</td><td>Zoo Med</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla infrarroja, 75W</td><td>Zoo Med</td><td>RS-75</td><td></td></tr><tr><td>RC2 Sistema de anestesia para roedores</td><td>VetEquip&nbsp;</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurano)</td><td>Abbot</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick</td><td>67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina aromatizada,</td><td>gelatina de</td> frambuesa <td>B000E1FYL0</td><td>firme, con la consistencia de 'jigglers'</td></tr></tbody></table>

un procedimiento quirúrgico para resecar la costilla del ratón: un modelo a gran escala reparación huesos largos

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

Este protocolo introduce investigadores a un nuevo modelo para la reparación ósea a gran escala utilizando el nervio de ratón. El procedimiento se detalla lo siguiente: preparación del animal para la cirugía, la apertura de la pared del cuerpo torácica, exponiendo la costilla deseado de los músculos intercostales circundantes, la escisión de la sección deseada de la costilla sin inducir un neumotórax, y el cierre de las incisiones. En comparación con los huesos del esqueleto apendicular, las costillas son muy accesibles. Además, no fijador interno o externo es necesario ya que las costillas adyacentes proporcionan una fijación natural. La cirugía utiliza comercialmente la oferta disponible, es fácil de aprender, y bien tolerado por el animal. El procedimiento puede llevarse a cabo con o sin retirar el periostio, y por lo tanto la contribución del periostio a la reparación se puede evaluar. Los resultados indican que si se mantiene el periostio, la reparación robusta se produce en 1 - 2 meses. Esperamos que el uso de este protocoloestimular la investigación en la reparación de costilla y que los hallazgos facilitarán el desarrollo de nuevas formas de estimular la reparación ósea en otros lugares del cuerpo.

Animales suelen recuperarse rápidamente de este procedimiento, la incisión cicatriza bien, y los animales presentan un comportamiento normal. El procedimiento utiliza los suministros disponibles comercialmente y después de la práctica, se puede completar en menos de 1 hr. Antes de utilizar este procedimiento para generar los datos experimentales, es importante analizar la resección en el punto de tiempo del día 0 para determinar si los fragmentos óseos grandes pueden permanecer dentro de la zona de resección. Una forma ...

El objetivo general de este procedimiento es resecar con éxito una porción de hueso de la costilla de un ratón. El procedimiento se desarrolló como modelo para estudiar la reparación de huesos largos a gran escala.

Un procedimiento quirúrgico para resecar la costilla del ratón: un modelo a gran escala Reparación huesos largos

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

El objetivo de este procedimiento es crear una resección a gran escala en la porción ósea de una costilla como modelo para la reparación esquelética. Esto se logra primero creando y abriendo una incisión a través de la piel en el lado lateral del animal. El segundo paso consiste en exponer el hueso de la costilla que se va a eliminar.A continuación, se extrae una porción del hueso costal junto con la vaina de tejido conjuntivo circundante o el periostio, o dejando el periostio en su lugar. El paso final consiste en cerrar las incisiones y permitir que el animal se recupere. En definitiva, este modelo de reparación ósea puede utilizarse para mostrar los eventos celulares y moleculares que ocurren durante la reparación esquelética a gran escala.En un mamífero, la demostración visual de este método es fundamental, ya que la manipulación de los instrumentos quirúrgicos requiere precisión y una cirugía exitosa implica saber la ubicación de los diferentes tejidos. Marissa Roar y Nikita Tripper, ambas estudiantes de posgrado en mi laboratorio, realizarán la demostración del procedimiento. Después de preparar el área quirúrgica y las herramientas y suministros estériles necesarios, induzca la anestesia colocando un ratón en una cámara de inducción con 4 % de fluoruro de isoflurano.Una vez que el ratón esté anestesiado, aplique ungüento en los ojos del ratón y confirme la profundidad de la anestesia. Al realizar un pellizco en el dedo del pie, no debe haber ninguna reacción al pellizco. Coloque el ratón sobre o adyacente a una almohadilla térmica en la plataforma de un microscopio estereoscópico, con el cono nasal del tubo de mantenimiento de anestesia colocado sobre la nariz del ratón.Asegúrese de que el ratón esté en posición lateral. Ajuste el isoflurano a dos a 3 % para mantenimiento y observe la frecuencia respiratoria. A continuación, inyecte buprenorfina por vía subcutánea mediante una aguja de calibre 25.Para el dolor postoperatorio preventivo, la pierna puede presentar espasmos, lo cual es una respuesta normal. Primero, seleccione la costilla deseada palpando desde la costilla más rostral, que se cuenta como número uno. En este video, se eliminará una porción de la costilla número 10.Afeite el área sobre la costilla y luego limpie con yodo-povidona, seguido de isopropanol tres veces. Después de realizar una incisión de dos centímetros a través de las capas de piel, músculo y grasa por encima de la costilla que se va a extirpar, coloque las tres capas en un retractor para exponer el área quirúrgica, minimizando así el tamaño de la incisión. A continuación, utilice un escalpelo de cinco milímetros para cortar a través de los músculos intercostales por encima de la costilla en un punto ubicado cinco milímetros proximal a la articulación costovertebral, donde la costilla no tiene tanta curvatura. Luego, separe cuidadosamente el músculo del hueso con pinzas de punta fina.A continuación, para crear una resección conservando el periostio en el animal, corte a través del periostio a lo largo del largo del hueso costal. Luego, utilice pinzas de punta fina para separar muy cuidadosamente el delicado periostio lateralmente del hueso subyacente. Si es necesario, mida la resección con un micrómetro en el microscopio o con una regla calibradora.Luego, utilice tijeras microfinas para realizar una sección transversal a través del hueso. En un extremo, levante cuidadosamente el hueso del periostio y corte el otro extremo inmediatamente. Coloque la costilla extraída en paraformaldehído al 4% para su análisis posterior.Si ocurre sangrado como resultado de cortar el hueso, aplique presión en el extremo cortado con un hisopo de algodón durante cuatro a cinco segundos para detener el sangrado. Para cerrar la incisión, sutúre los músculos intercostales sobre la parte superior de la vaina periostea restante con tres o cuatro suturas descontinuas de 9-0. Coloque las suturas directamente encima de los extremos cortados de la costilla para que sirvan como indicadores de la ubicación quirúrgica.Retire el retractor y luego suture el músculo y la grasa superpuestos con puntos separados de calibre nueve cero. Suture cada capa por separado en ratones con capas particularmente gruesas de músculo o grasa. Cierre la piel con cuatro a cinco puntos de calibre 7 0 y luego asegure la incisión con adhesivo tisular.Presionar los bordes juntos con fórceps grandes. Reducir lentamente la concentración de isoflurano ajustándola a 1 % durante unos minutos y luego apagar el isoflurano. Colocar al ratón bajo una lámpara de calor y dejarlo hasta que recupere la conciencia.Después de que el ratón recupere la conciencia y durante todo el período de curación, debe moverse y desplazarse con normalidad y no mostrar signos de malestar. Una vez que la incisión esté seca, coloque al ratón en una jaula limpia con acceso libre a alimento y agua. Las hembras pueden alojarse juntas, pero los machos deben alojarse por separado para evitar peleas, y debe proporcionarse manejo del dolor posoperatorio, incluyendo la administración de buprenorfina en forma oral de gel a 0,5 miligramos por kilogramo cada 12 horas durante 48 horas.La administración oral no requiere inmovilizar al animal, lo cual podría causar dolor en la región torácica. Esta imagen muestra una resección de 4,5 milímetros de una costilla recogida inmediatamente después de la cirugía. No quedan fragmentos óseos. La muestra fue teñida con rojo de zarin y aclarada en glicerol al 80 %. La punta de flecha indica la ubicación de los extremos cortados. Esta es la porción de costilla removida de la caja torácica en la imagen anterior, sin el periostio adherido.La sección histológica teñida con hematina y eosina que se muestra aquí ilustra que hay un periostio mínimo adherido al hueso, como indica la punta de flecha amarilla a la izquierda, y ningún periostio a la derecha. El asterisco amarillo indica la cavidad de la médula ósea. Esta imagen muestra un fragmento de costilla extraído con el periostio aún adherido, y esta sección histológica muestra el periostio intacto que recubre el hueso, como indica el corchete amarillo.El asterisco amarillo indica nuevamente la cavidad de la médula ósea. Esta imagen muestra una preparación esquelética después de dos meses de curación tras la resección con el periostio intacto dentro del ratón; puede observarse una reparación completa de la región. Esta sección histológica de la preparación esquelética mostrada anteriormente demuestra la restauración de las paredes del hueso laminar y de la cavidad de la médula ósea.Esta imagen muestra una preparación esquelética tras tres meses de cicatrización. Tras la eliminación de una porción de la costilla y del periostio circundante, solo hubo una reparación mínima en el extremo cortado, que se observa a la izquierda del panel. La punta de flecha amarilla señala la articulación chocos.Esta sección histológica de la preparación esquelética mostrada previamente muestra tejido de granulación, tejido adiposo y células musculares rellenando el sitio de la resección. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora si se sigue correctamente este procedimiento. Otros métodos, como crear una resección en la porción cartilaginosa de la costilla, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cómo ocurre la reparación a gran escala del cartílago?Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una resección en la porción ósea del hueso costal con el fin de estudiar la reparación esquelética.

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Investigación

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Medicine

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