La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la velocidad y el grado de transporte de lípidos y fármacos hacia el sistema linfático intestinal tras la administración intestinal. Esto se logra primero aislándo y canulándo el conducto linfático mesentérico para la recolección de linfa. En una segunda etapa, se canula el duodeno para permitir la infusión en el intestino, y luego se canula la arteria carótida para permitir la recolección de muestras de sangre.

En el paso final, el tratamiento experimental se administra en el duodeno y se recoge la linfa y la sangre para la cuantificación de los niveles sistémicos de lípidos o fármacos. En definitiva, este modelo puede utilizarse para evaluar la absorción total y el transporte linfático intestinal de lípidos y fármacos tras la administración intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que permite la canulación directa del conducto linfático mesentérico y la recogida de linfa durante todo el período experimental.

Esto permite una estimación del material masivo absoluto que fluye hacia y a través de la linfa mesentérica. In vivo, aunque este modelo posibilita la evaluación in vivo del transporte de fármacos y lípidos, también puede utilizarse para medir el transporte linfático intestinal de cualquier factor de interés, así como los cambios en el transporte linfático de dichos factores en respuesta a diferentes desafíos o estados patológicos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la canulación del conducto linfático mesentérico es complicada y difícil debido a que el conducto es pequeño, frágil y aún más en animales en ayunas. La demostración del procedimiento estará a cargo de mi colega y fellow miembro del profesorado de la Universidad de Monash, la Dra. Natalie Cus, y un postdoctorado sénior del grupo, el Dr. LJ Hugh. El día anterior a la cirugía, corte las cánulas a las longitudes apropiadas y utilice una hoja quirúrgica estéril para realizar un bisel en la punta de cada tramo de tubo. A continuación, para preparar la cánula intraduodenal, enrolle la cánula sobre sí misma y luego caliente la cánula para crear un punto de anclaje en el tubo.

El día de la cirugía, afeite el vello de la región abdominal derecha, la región del cuello y la región de la clavícula izquierda de una rata adulta anestesiada, y luego limpie las áreas quirúrgicas asépticamente con tres aplicaciones sucesivas de solución de povidona yodada y alcohol al 70 % para canular el conducto linfático. Coloque al animal con el lado derecho hacia arriba y utilice una hoja de bisturí estéril para abrir la capa superior de la pared muscular abdominal mediante una incisión recta de cuatro centímetros que se extiende desde el apéndice xifoides hasta la región lateral derecha, aproximadamente dos centímetros por debajo del margen costal. Retraiga el intestino delgado por debajo de la pared abdominal izquierda y utilice dos o tres trozos de gasa estéril saturada con solución salina normal para mantenerla en su lugar.

Luego, coloque la rata sobre una jeringa de plástico de 10 mililitros colocada horizontalmente debajo de la espalda del animal, a la altura del riñón derecho. Para ayudar en la visualización del conducto linfático mesentérico, localice el conducto linfático mesentérico superior, que tiene aproximadamente de 0,5 a un milímetro de diámetro, es perpendicular al riñón derecho y se encuentra inmediatamente craneal y paralelo a la arteria mesentérica pulsátil de color rojo oscuro. Tenga en cuenta que en ratas no ayunadas, como se muestra aquí, el conducto linfático mesentérico superior es blanco, opaco y más fácil de visualizar que en ratas infestadas.

A continuación, pase un par de fórceps rectos a través del lecho adiposo perineal en el margen inferior del riñón derecho, paralelo al conducto linfático mesentérico superior y a través de las capas de tejido conectivo inmediatamente por debajo de la vena cava. Luego, utilizando la punta de los fórceps, tire de la cánula linfática a través del lecho adiposo perineal, de modo que un extremo quede inmediatamente adyacente al conducto linfático mesentérico y el otro exteriorizado del animal a la altura del riñón derecho. A continuación, utilizando un microscopio quirúrgico y fórceps de joyero, aísle el conducto linfático mesentérico a través de las capas superpuestas de tejido conectivo y adiposo mediante disección roma, comenzando por el extremo inferior y teniendo cuidado de no dañar el conducto linfático una vez que este haya sido aislado.

Utilice la punta de unas pinzas finas para hacer un pequeño orificio en el conducto linfático. Después de asegurarse de que la cánula linfática esté completamente llena de solución anticoagulante y no tenga burbujas de aire, use un par pequeño de pinzas para insertar la cánula linfática aproximadamente dos a cuatro milímetros dentro del conducto linfático mesentérico a través del orificio de punción. Si la canulación tiene éxito, se observará un flujo gradual de linfa intestinal proveniente del extremo colector libre de la cánula.

Cuando esto ocurra, coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato sobre el orificio de entrada al conducto linfático para asegurar la cánula, teniendo cuidado de no obstruir el vaso con exceso de pegamento al canular el duodeno. Primero, localice el tejido como la sección de color rosa brillante del intestino delgado, que al tirar suavemente hacia abajo revela el estómago. Luego, utilice una aguja estéril de calibre 23 para hacer un pequeño orificio de punción en el duodeno en la región del píloro, aproximadamente dos centímetros por debajo de la unión entre el estómago y el duodeno.

A continuación, inserte el extremo del gancho en forma de js de la cánula duodenal a través del orificio y asegure la cánula en su lugar con una gota de pegamento acrílico Sano. Luego, use suturas para cerrar la incisión en la pared muscular abdominal. La canulación de la arteria carótida puede realizarse antes o después de la canulación del conducto linfático mesentérico. Por lo general, preferimos canular la arteria carótida antes de canular el conducto linfático, para reducir la posibilidad de desplazar la cánula linfática al mover al animal. Para canular la arteria carótida, primero marque la cánula de la arteria carótida a 2,5 centímetros desde la punta biselada, a fin de identificar la porción del tubo que se insertará en la arteria.

Luego, conecte el extremo no biselado de la cánula a una aguja de 25 gauge unida a una jeringa llena de solución anticoagulante y llene la cánula con la solución, asegurándose de que no haya espacios de aire. A continuación, realice una incisión longitudinal de uno a 1,5 centímetros a través de la capa de piel por encima del lado izquierdo de la tráquea en el plano sagital, y luego use pinzas de punta roma para disecar el tejido conectivo subcutáneo y exponer los músculos cervicales apareados subyacentes. Retraiga los músculos cervicales para revelar la arteria carótida izquierda pulsante ubicada aproximadamente a un centímetro por debajo de la superficie de la piel.

Luego, limpie el tejido conectivo sobreyacente de la arteria mediante disección roma y use pinzas de tejido romas para aislar una sección de aproximadamente un centímetro de la arteria. A continuación, use pinzas de punta fina para pasar dos suturas de seda por debajo de la arteria carótida, colocándolas en cada extremo de la sección aislada de la arteria. Después, ate la sutura más alejada del corazón y la clavícula de la rata y coloque un par de pinzas rectas de punta fina debajo de la carótida para ocluir el flujo sanguíneo a través de la arteria.

Ahora, utilizando tijeras de iris de punta fina, realice una pequeña incisión en la superficie superior de la arteria aproximadamente a un tercio del camino desde la parte superior del área aislada. Inserte la punta de la cánula en la arteria con una pinza de punta curva. Una vez insertada, retire la pinza de punta fina recta, ocluyendo el flujo sanguíneo, y avance la cánula 2,5 centímetros dentro de la arteria utilizando dos pares de pinzas.

Uno para sostener la cánula dentro de la arteria y evitar que la sangre retroceda, y otro para insertar la cánula. Luego, utilice una pinza pequeña para arterias para mantener la cánula dentro de la arteria. Inyecte solución anticoagulante en la cánula y, a continuación, retire una pequeña cantidad de sangre para confirmar la permeabilidad del tubo.

Luego, lave la cánula con solución anticoagulante y selle el extremo utilizando la llama de un encendedor. Finalmente, use los puntos de sutura para fijar la cánula en su lugar y retire el clamp arterial. A continuación, coloque un tercer punto de sutura alrededor de la arteria y la cánula, acorte la longitud de los puntos alrededor de la arteria y cierre la herida del cuello con más puntos de sutura tras el período de recuperación, infundiendo una formulación de interés en el animal a través de la cánula duodenal.

Como se ilustra en la gráfica tras la administración del modelo, el fármaco lipófilo halal faneno, la velocidad media de flujo linfático en las ratas con cannulación exitosa estuvo entre 0,4 y 1,3 mililitros por hora. En algunos animales, la velocidad de flujo linfático fue ligeramente menor durante la primera a tres horas posteriores a la cannulación antes de aumentar, un fenómeno comúnmente observado tras la cannulación linfática exitosa en ratas con cannulación fallida. Sin embargo, la velocidad de flujo permanece sustancialmente más baja en comparación con la observada en los experimentos exitosos durante todo el período de recolección.

De manera similar, en estos experimentos representativos, el transporte linfático acumulativo de triglicéridos y RIN halal fue sustancialmente menor en los animales con cannulación fallida. Mientras que en los grupos con cannulación exitosa, el transporte acumulativo de halalan fue del 15,1 % de la dosis y el transporte acumulativo de triglicéridos fue de 61 miligramos durante 10 horas. En este experimento representativo de transporte de lípidos, la proporción de la dosis de lípido exógeno marcado con radioisótopos administrada y transportada por la linfa fue del 54 %. Estos valores no fueron significativamente diferentes a los observados previamente.

Para una formulación similar, la velocidad de transporte tanto de triglicéridos como de fármacos hacia la linfa alcanza un pico poco después de la administración de lípidos y fármacos, y luego regresa a niveles basales. Como es habitual en los experimentos de transporte linfático intestinal de lípidos y fármacos. La velocidad de transporte del fármaco en la linfa durante cada período de tiempo refleja ese escenario para el transporte de triglicéridos, ya que el fármaco es transportado hacia la linfa.

En asociación con las lipoproteínas ricas en triglicéridos. Una vez dominada, la canulación puede completarse en menos de 30 minutos si no se presentan dificultades. Tras este procedimiento, los componentes presentes en la linfa recolectada pueden aislarse y utilizarse en experimentos adicionales, como la reinfusión en animales receptores para evaluar directamente su función, metabolismo, eliminación o patrones de distribución. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de las técnicas para aislar y canular el conducto linfático mesentérico, la arteria carótida y el duodeno.

Mediante estas técnicas, debería poder evaluar el transporte de fármacos, lípidos y otros factores desde el intestino a través y hacia la linfa mesentérica in vivo.