Name: La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprende a canular el conducto linfático mesentérico en ratas para evaluar el transporte de lípidos y fármacos. Este modelo permite cuantificar la absorción intestinal y los niveles sistémicos en estudios de farmacología.

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Se agradece la financiación del Consejo Australiano de Investigación (ARC) y del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC).

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de rata mesentérica linfáticos canulación permite la cuantificación directa de la concentración y la velocidad de transporte de varias células y moléculas (tales como lípidos y fármacos) del intestino a la linfa y los cambios a estos que se producen en respuesta al desafío de diversas sustancias (dieta , antígenos, fármacos, formulaciones, etc.) 10,27 y la enfermedad (cáncer, los virus, la colitis, la resistencia a la insulina, etc.) 5-7. Los componentes recogidos en los...

La linfa fluye desde el intestino delgado a través de un proceso unidireccional que se origina en lactíferos individuales que están contenidos dentro de cada pequeño vellosidades intestinales 1. Lacteales son relativamente permeable al fluido, macromoléculas y células y la formación de la linfa por lo tanto comienza con la entrada de estos factores en lacteales. La linfa inicial en los lacteales fluye posteriormente desde el intestino a través de una red de microvasos linfáticos, la recolección (aferente) los vasos linfáticos, una serie de ganglios linfáticos mesentéricos y en última instancia los post-ganglionar (eferente) los vasos linfáticos. Dentro de los nodos, la linfa pasa a través de una serie de senos medulares donde se produce el intercambio con las células inmunes residentes nodo, así como material que entran en el nodo de la sangre. Todos los ganglios que fluye desde el intestino delgado finalmente converge en el conducto linfático eferente mesentérica superior y, posteriormente, la cisterna del quilo. La cisterna del quilo además contiene linfático de drenaje de los tejidos periféricos caudales, intestinal, regiones hepáticas y lumbares y se une al conducto linfático torácico junto con la linfa del mediastino y partes craneales del cuerpo. El conducto linfático torácico vacía linfático directamente en el sistema venoso en la unión de las venas yugular interna y subclavia izquierda. El protocolo descrito aquí, que permite la recogida de la linfa directamente desde el conducto linfático mesentérico superior, por lo tanto facilita el análisis de diversos factores que transitan directamente desde el intestino a la circulación (general) sistémica a través del sistema linfático intestinal. Las principales funciones fisiológicas asignados al sistema linfático intestinal son para mantener el equilibrio de fluidos, para facilitar la absorción de los lípidos y la molécula lipófila, y para permitir respuestas inmunes apropiadas 1. Las células tumorales y virus también se propagan a través de los vasos linfáticos intestinales 2-4 y principales cambios se producen dentro de los vasos linfáticos en diversas patologías inflamatorias y metabólicas 5-7. Latanulation del conducto linfático mesentérico para recoger la linfa en el mesenterio permite un análisis de flujo de fluido mayor a través de los vasos linfáticos intestinales, así como la cuantificación de la tasa de concentración y el transporte de varias células y moléculas. Los cambios en la concentración o el tránsito de estos factores en respuesta a diversos desafíos (por ejemplo, dietas, antígenos, drogas) y en modelos de enfermedad (por ejemplo, colitis, VIH, diabetes) pueden también ser evaluados. Si bien es imposible describir ampliamente cada componente linfático que puede ser analizada y comparada aquí, linfático mesentérico consiste simplista de acuosa, lípidos y las fases celulares. Componentes de interés en la fase acuosa incluyen péptidos y proteínas tales como antígenos o tolerógenos 8, mensajeros inmunes tales como citoquinas y mediadores de mastocitos, 9 y mediadores metabólicos tales como incretinas 10. La fracción celular de la linfa mesentérica post-nodal consiste casi completamente (más del 99%) de lymphocytes 11. Varias células inmunes (células dendríticas, mastocitos, etc.) entran en los vasos linfáticos mesentéricos pre-nodales pero permanecen dentro del nodo 12. Si las células dentro de la linfa aferente son de interés, es posible recoger estas células a través de la eliminación de la nódulos linfáticos mesentéricos varios días antes de la canulación del conducto linfático mesentérico 12. De esta manera los aferentes y eferentes conductos linfáticos están directamente conectados y las células en los ganglios linfáticos aferentes pasan directamente en el conducto linfático mesentérico. El tránsito y el fenotipo de varias células inmunes que pasan a través de los vasos linfáticos intestinales por lo tanto pueden ser examinados. Quizás la razón más común citada para la recogida de la linfa mesentérica hasta la fecha, sin embargo, es estudiar el procesamiento intestinal, la absorción y el transporte de lípidos de la dieta y las moléculas lipofílicas 10. Después de la ingestión, lípidos de la dieta son digeridos (por ejemplo, de triglicéridos de ácidos grasos y monoglicéridos, phospholipid a los ácidos grasos y lisofosfolípidos, colesterol y éster de ácido graso y colesterol, etc.) y dispersas dentro de la luz intestinal en pequeñas micela y las estructuras vesiculares por medio de la adición de anfífilos de la bilis (fosfolípidos, colesterol y sales biliares) y la acción de enzimas pancreáticas 10,13. De aquí que se absorben en los enterocitos. Una proporción de los componentes absorbidos se re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos y ésteres de colesterol dentro de las células absorbentes (enterocitos). Estas re-esterificados lípidos se ensamblan a partir de una combinación de componentes lipídicos exógena ingerida y componentes de lípidos endógenos de la bilis secretada, piscinas de lípidos de la mucosa o el suministro de sangre intestinal 13. Desde aquí los lípidos esterificados se almacenan ya sea dentro de los enterocitos o ensamblados en lipoproteínas intestinales (quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)), junto con diversos apoproteínas y otras moléculas lipófilas ( <em&gt; por ejemplo, vitaminas) 10,13. Después de salir de los enterocitos, lipoproteínas son transportados específicamente desde el intestino a la circulación sistémica a través del sistema linfático mesentérico como los lactíferos intestinales son más permeables a su entrada de los capilares sanguíneos intestinales. Una proporción de los componentes de lípidos absorbidos también son transportados desde el intestino a la circulación sistémica a través de los capilares sanguíneos y la vena porta como individuales, no de lipoproteínas asociadas, las moléculas 14. En general, sin embargo, la ruta de transporte de la vena porta es sólo un jugador significativo en la absorción de los lípidos de longitud de cadena corta y media. La recogida de la linfa mesentérica por lo tanto permite la evaluación del transporte de lipoproteínas y componentes asociados (lípidos, moléculas lipófilas, APO-proteínas) desde el intestino. Las lipoproteínas se pueden cuantificar y caracterizados con la ventaja de que las lipoproteínas ganglios mesentéricos, en general, están en una nascent estado, ya que no han sido ampliamente modificado por enzimas sistémicas tales como la lipoproteína lipasa 15. Mientras que el modelo de rata canulada linfático mesentérico ha históricamente quizás ha descrito más ampliamente para el análisis de transporte de lípidos / lipoproteínas de desde el intestino, un área de interés es la ampliación de la función de los vasos linfáticos en el transporte de fármacos lipófilos, profármacos y otros xenobióticos 13,16 que es el foco del modelo descrito aquí. Drogas lipofílicas (generalmente aquellos con log P&gt; 5 y solubilidad en cadena larga de triglicéridos&gt; 50 mg / g, aunque excepciones son evidentes) 17,18, profármacos 19 y otros xenobióticos 13,16 puede tener acceso a los linfáticos intestinales de forma pasiva o por integrando activamente en las vías de transporte de lipoproteínas intestinal 19. Así, la técnica de canulación linfático mesentérico de rata tiene muchas aplicaciones. Bollman et al. Descrita por primera vez un technique para canular el conducto linfático mesentérico en ratas en 1948 20. Desde entonces un número de variaciones sobre el modelo se han descrito. Por ejemplo, la colección se puede producir cuando la rata se anestesió con varios anestésicos 21,22, o en el estado consciente mientras refrenado 15 o se mueve libremente 23,24. Las ratas se pueden administrar diferentes soluciones de rehidratación y otras sustancias tales como lípidos y formulaciones de fármacos a diferentes velocidades en el estómago, intestino o parenteral (típicamente 0-5 ml / hr) 25. En algunos estudios, el conducto linfático torácico en lugar de conducto linfático mesentérico se canula para estimar el transporte desde el intestino a través de los vasos linfáticos aunque esto puede sobreestimar el tránsito en el intestino delgado, en función del factor de interés, ya que el conducto linfático torácico también recibe la linfa de otra regiones 22,26. Modelos de canulación linfáticos también se han descrito en varias otras especies, incluyendo ratones 15,27, mini-pigs 12, 28,29 ovejas, cerdos y perros 30 31. Sin embargo, el modelo de rata es la más amplia y coherente citado. Los protocolos detallados para la canulación del conducto linfático mesentérico seguida de la recogida de la linfa en consciente 25 o anestesiado 22 ratas y ratones 15,27 se han publicado previamente y el lector interesado se dirige a estos protocolos. Este protocolo es el primero en demostrar la técnica en un formato visualizado. El modelo de rata linfático canulado tiene ventajas sobre los modelos animales más grandes en términos de costo, la facilidad de la cirugía y las consideraciones éticas. Cuando se compara con el modelo de ratón, la cirugía canulación linfático mesentérico es también más fácil en la rata Aunque el modelo de ratón permite estudios más detallados en los animales transgénicos 27. Sin embargo, hay algunas limitaciones del modelo de rata, en particular aquellos asociados con diferencias en la fisiología, que extrapolat límiteiones a otras situaciones pre-clínicos y clínicos. Por ejemplo, en el flujo de bilis de rata es constante e independiente de la ingesta de alimentos mientras que en mayor alimentos especie o lípidos estimulan el flujo de bilis 32. Esto crea desafíos para la obtención de los entornos de pre y post-prandial de representación en la rata que reflejan lo que se ve en las especies y los seres humanos más grandes. Para los estudios de administración de fármacos, las especies más grandes también pueden ser preferidos cuando se evalúa el transporte linfático después de la administración de la dosis humana realista forma 25. En un estudio reciente, se encontró que las tasas de transporte de lípidos en la linfa mesentérica ser comparables entre especies (ratón, rata, perro) después de la administración de una masa equivalente y el tipo de lípidos que proporciona cierta confianza en la extrapolación de los datos de transporte de lípidos a través de especies 27. Sin embargo, el transporte de un modelo lipofílica drogas, halofantrina, clasificados en orden de tamaño de los animales (es decir, perro&gt; rata&gt; ratón). Un factor de escala puede, pues, ser obligado a exextrapolar los datos de transporte de drogas linfáticos de rata para otras especies. Una limitación de los modelos de canulación de la linfa, en general, es que la recogida pasiva linfático directamente de un conducto linfático puede modificar el flujo y transporte linfático desde los vasos linfáticos trabajan en contra de un gradiente de presión que se altera una vez que el recipiente se canula 33. El modelo canulación linfáticos también puede ser difícil de establecer en los laboratorios que no están familiarizados con la técnica. Así, se han descrito modelos alternativos. Por ejemplo, el tránsito de factores través del sistema linfático intestinal, tales como lipoproteínas y moléculas lipofílicas, se ha estudiado indirectamente a través de la colección de la sangre. Uno de estos modelos consiste en comparar las concentraciones sanguíneas de lípidos y / o drogas tras la administración oral en presencia y ausencia de inhibidores (por ejemplo, colchicina, Pluronic L81, cicloheximida) de la producción de lipoproteínas intestinal que bloquean el transporte linfático 34. Una ventajade los modelos que cuantifican el transporte linfático indirectamente a través de la recolección de muestras de sangre es que permite cierta evaluación del transporte linfático en los seres humanos como no se requiere cirugía invasiva 35. Sin embargo, los inhibidores de transporte linfático no son específicos y los factores que son transportados a través de los vasos linfáticos se diluyen y se modifican en la circulación sistémica que complica tales evaluaciones. In vitro alternativas también se han descrito. Por ejemplo, los cultivos de células Caco-2 o aislado de los enterocitos se han utilizado para estudiar en más detalle la secreción intestinal de moléculas que entran en los vasos linfáticos 36-38. Un modelo avanzado in vitro que es más representativo del microambiente intestinal humano también fue recientemente descrito 39. En este modelo de una capa de células endoteliales linfáticas es co-cultivadas con células Caco-2 que permite análisis más detallado de la transferencia de sustancias desde el intestino en los vasos linfáticos. Sin embargo, en vitro sistemas de células carecen de flujo de intercambio y transferencia denominado interconexión con un lumen intestinal y sangre subyacente y de aporte vascular linfático. En un enfoque alternativo, Kassis et al. Estableció un doble canal (vídeo de alta velocidad de campo claro y fluorescencia) en el sistema de formación de imágenes in situ que permite comparaciones cuantitativas entre contracción de los vasos, el flujo de la linfa y las concentraciones de lípidos fluorescentes en los vasos linfáticos mesentéricos 33. Una ventaja de este modelo sobre el mencionado en sistemas in vitro es que permite un seguimiento preciso del paso de las células inmunes a través de los vasos linfáticos. Las medidas absolutas de lípidos masa (o drogas) de transporte son, sin embargo, aún no se establecerán a partir de los métodos de imagen. In vitro e in silico enfoques para predecir específicamente el grado de transporte del fármaco lipofílico a través de los vasos linfáticos intestinales también se han publicado 40-42. Por ejemplo, la afinidad ex vivo de varios ccomuestos para quilomicrones plasma se encontró correlación razonablemente bien con su transporte linfático en vivo 41. Posteriormente, el mismo grupo estableció un modelo en silico para predecir la afinidad fármaco para quilomicrones basados ​​en múltiples propiedades fisicoquímicas 40. Holm et al. También estableció un relativamente complejo en el modelo de silico para predecir de plano de transporte linfático de compuestos lipófilos sobre la base de los descriptores moleculares 42. Estos modelos pueden proporcionar un enfoque útil para predecir el grado de transporte linfático de fármacos desconocidos. Será, sin embargo, se requerirá la validación de los modelos con una amplia gama de medicamentos y en los diferentes laboratorios para confirmar su exactitud y reproducibilidad. La canulación del conducto linfático mesentérico por lo tanto sigue siendo el único medio para examinar directamente el contenido de drenaje linfático del intestino delgado y la velocidad de tránsito de la compleja serie de factores (células, proteínas,péptidos, lípidos, drogas) en la linfa en una situación in vivo. Aquí se describe un protocolo para la canulación del conducto linfático y carótida arteria mesentérica que permite la recogida de la linfa mesentérica y la sangre sistémica de las ratas anestesiadas. Los datos representativos demuestran cómo el modelo puede ser utilizado para examinar los lípidos y el transporte del fármaco desde el intestino a través del sistema linfático mesentérico. Esto es seguido por una discusión de las dificultades que se pueden encontrar en el establecimiento del modelo y una guía para resolver problemas. Una vez establecido el modelo es una herramienta poderosa para investigar el transporte linfático intestinal.

<table><tbody><tr><td>Suero fisiológico estéril</td><td>Baxter healthcare</td><td>AHB 1307</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Baxter de 100 ml de bolsas de solución salina, caja de 50</td></tr><tr><td>70 % de etanol en agua</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Solución de gluconato de clorhexidina (Microshield 4)</td><td>Livingstone International</td><td>JJ60243L</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L</td></tr><tr><td>Solución Betadine</td><td>Livingstone International</td><td>BU0510</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510</td></tr><tr><td>Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>KETA I 1</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Ilium Xylazil (Xilacina 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>TRO-3828</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>ACP 10 Inyección (Acepromazina 10 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/</td><td></td></tr> <tr><td>Pentobarbitona sódica</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>24529</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Lethabarb &reg; 325 mg/ml de pentobarbitona sódica, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au</td></tr><tr><td>Heparina (35000I.U. en 35 mL)</td><td>Sigma Pharmaceuticals</td><td>337220</td><td>http://sigmaco.com.au/</td></tr> <tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) sal disódica dihidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la sal disódica de EDTA de Sigma.</td></tr><tr><td>Cánula de polietileno (PE) diámetro exterior 0,96 mm x diámetro interno 0,58 mm</td><td>Extensiones de microtubos</td><td>PE8050</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el tubo de PE de 0,96 x 0,58 mm, 30 m</td></tr><tr><td>Cánula de polietileno (PE) de diámetro exterior 0,8 mm x diámetro interno 0,5 mm</td><td>Extensiones de microtubos</td><td>PE9658</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el tubo de PE de 0,8 x0,5 mm, 30 m</td></tr><tr><td>Regla</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Marcadores</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Encendedor de cigarrillos</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Adhesivo veterinario</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Agujas de calibre 23</td><td>Livingstone International</td><td>DN23GX0.75LV</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Livingstone Aguja Desechable, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6& search=DN23GX0.75LV</td></tr><tr><td>Agujas de calibre 25</td><td>Livingstone International</td><td>DN25GX1.0LV</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la Aguja Desechable Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= Jeringa DN25GX1.0LV</td></tr><tr><td>1 ml Livingstone</td><td>International T3SS01TA</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la jeringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml Livingstone</td><td>International T3SS10SA</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la jeringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA</td></tr><tr><td>Hisopos de gasa</td><td>Livingstone International</td><td>GSC075</td><td>Se puede utilizar cualquier marca y cortar a la medida requerida. Un ejemplo aquí es el hisopo de gasa relleno de algodón de 7,5x7,5 cm, 8 capas. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075</td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>Livingstone International</td><td>CTAST075DP</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el aplicador de algodón Livingstone de plástico de doble punta. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Ratek</td><td>WT1</td><td>Se puede utilizar cualquier marca que mantenga la temperatura a 37 ° C. Un ejemplo de ello es la bandeja de calentamiento Ratek.</td></tr><tr><td>Lámpara quirúrgica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-0215 con 72-0267</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el aparato de Harvard V-Lux 1000 Fuente de luz fría con guía de luz de cuello de cisne bifurcada, negro, fibra de 4,7 mm de diámetro (cada brazo). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail y&nbsp; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___</td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Zeiss</td><td>495005-0014-000</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el microscopio estereoscópico Zeiss Stemi 2000-C con Stand S Double Spot y KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143</td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>Livingstone International</td><td>DTSK163019F4</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es &nbsp; 3/8 círculo corte inverso sutura de seda 3/0 rosca 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10020-00</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la hoja de bisturí FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10004-13</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el mango de bisturí FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51</td></tr><tr><td>1 x Tijeras quirúrgicas pequeñas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14060-09</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Tijeras finas, de 9 cm con filo de 21 mm, afiladas, rectas. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17</td></tr><tr><td>2 x Pinzas con punta curva dentada</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11001-13</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la pinza de patrón estándar FST de 13 cm con punta curvada de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Tijeras de iridectomía</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15000-08</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16&nbsp;</td></tr><tr><td>1 x Pinza con punta recta dentada</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11650-10</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Graefe de 10 cm recto con punta dentada de 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Pinzas con punta lisa, afilada, recta y fina</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-10</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la pinza FST Dumont #5 recta de 11 cm con punta de 0,08 x 0,04 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29</td></tr><tr><td>1 x Pinzas con pinzas curvas finas lisas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11063-07</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello son las pinzas delicadas FST de 9 cm con punta lisa de 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td></tr><tr><td>2 x Hemostáticos</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13010-12</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. No todos los operadores utilizan los hemostáticos. Un ejemplo es FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats con 20 mm de largo x 1,3 mm de ancho dentado, punta recta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33</td></tr><tr><td>1 x Portaagujas de sutura</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12001-13</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el portaagujas Hasley FST de 13 cm con punta de 16 mm de largo x 1,9 mm de ancho. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70</td></tr><tr><td>1 x Pinza para arterias</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18050-28</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la mordaza recta FST Bulldog Serrefines, de 28 mm de largo y 9x1,6 mm con prensa de abrazadera mediana. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1008</td><td>Cuando se requiera, se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es ácido oleico puro al 99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Ácido 14C-oleico</td><td>Perkin&nbsp;</td><td>NEC317050UC&nbsp;</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el ácido oleico, [1-14C]-, 50&micro; Ci (1,85 MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td></tr><tr><td>Taurocolato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4009</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el ácido taurocólico, sodio, sal, hidrato, &ge; 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Halofantrine</td><td>Glaxo Smith Kline</td><td></td><td>La halofantrina fue amablemente proporcionada como regalo por Glaxo Smith Kline</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71507</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el fosfato de sodio monobásico monohidratado, BioXtra, para biología molecular, >99,5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Fosfato sódico dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td>Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el fosfato de sodio dibásico dihidratado, BioUltra, para biología molecular, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU</td></tr></tbody></table>

la linfa mesentérica conducto canulado rata modelo: aplicación de la evaluación de intestinal linfático transporte de drogas

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

El sistema linfático intestinal juega un papel clave en el transporte de líquidos, la absorción de lípidos y la función inmune. La linfa fluye directamente desde el intestino delgado a través de una serie de vasos linfáticos y los nodos que convergen en el conducto linfático mesentérico superior. La canulación del conducto linfático mesentérico por lo tanto permite la recogida de la linfa mesentérica que fluye desde el intestino. Linfático mesentérico consiste en una fracción celular de las células inmunes (99% de linfocitos), fracción acuosa (líquido, péptidos y proteínas tales como citocinas y hormonas intestinales) y la fracción de lipoproteínas (lípidos, moléculas lipófilas y apo-proteínas). Por consiguiente, el modelo de la canulación del conducto linfático mesentérico se puede utilizar para medir la concentración y la velocidad de transporte de una serie de factores del intestino a través del sistema linfático. Los cambios en estos factores en respuesta a diferentes retos (por ejemplo, las dietas, antígenos, fármacos) y en la enfermedad (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino, VIH, diabetes) puede también be determinada. Un área de expansión de interés es el papel del transporte linfático en la absorción de fármacos lipófilos administrados por vía oral y profármacos que se asocian con las vías de absorción de lípidos intestinales. Aquí se describe, en detalle, un modelo de rata canulado conducto linfático mesentérico, que permite la evaluación de la velocidad y extensión de los lípidos y el transporte del fármaco a través del sistema linfático durante varias horas después del parto intestinal. El método es fácilmente adaptable a la medición de otros parámetros en los ganglios. Proporcionamos una descripción detallada de las dificultades que se pueden encontrar al establecer este método quirúrgico complejo, así como los datos representativos de experimentos fallidos y exitosos para proveer instrucción sobre cómo confirmar el éxito experimental e interpretar los datos obtenidos.

Los resultados de un experimento representativo para cuantificar la medida acumulativa y la tasa de lípidos y el transporte del fármaco a través del sistema linfático intestinal después de la entrega utilizando el modelo de canulación linfático mesentérico se muestra en la Figura 4 y la Figura 5. En este experimento, 200 g de el modelo lipófilo halofantrina fármaco se administró en el duodeno de ratas durante 2 h en una formulación que contiene 40 mg de ácido oleico (incluyendo 2 - 5 Ci...

Aquí describimos una técnica para canular el conducto linfático mesentérico en ratas que permite cuantificar el transporte de lípidos y fármacos a través del sistema linfático después de la administración intestinal. La técnica se puede adaptar para evaluar las concentraciones de linfa mesentérica y/o el transporte de líquidos, células inmunitarias, péptidos, proteínas y moléculas lipofílicas.

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la velocidad y el grado de transporte de lípidos y fármacos hacia el sistema linfático intestinal tras la administración intestinal. Esto se logra primero aislándo y canulándo el conducto linfático mesentérico para la recolección de linfa. En una segunda etapa, se canula el duodeno para permitir la infusión en el intestino, y luego se canula la arteria carótida para permitir la recolección de muestras de sangre.En el paso final, el tratamiento experimental se administra en el duodeno y se recoge la linfa y la sangre para la cuantificación de los niveles sistémicos de lípidos o fármacos. En definitiva, este modelo puede utilizarse para evaluar la absorción total y el transporte linfático intestinal de lípidos y fármacos tras la administración intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que permite la canulación directa del conducto linfático mesentérico y la recogida de linfa durante todo el período experimental.Esto permite una estimación del material masivo absoluto que fluye hacia y a través de la linfa mesentérica. In vivo, aunque este modelo posibilita la evaluación in vivo del transporte de fármacos y lípidos, también puede utilizarse para medir el transporte linfático intestinal de cualquier factor de interés, así como los cambios en el transporte linfático de dichos factores en respuesta a diferentes desafíos o estados patológicos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la canulación del conducto linfático mesentérico es complicada y difícil debido a que el conducto es pequeño, frágil y aún más en animales en ayunas. La demostración del procedimiento estará a cargo de mi colega y fellow miembro del profesorado de la Universidad de Monash, la Dra. Natalie Cus, y un postdoctorado sénior del grupo, el Dr. LJ Hugh. El día anterior a la cirugía, corte las cánulas a las longitudes apropiadas y utilice una hoja quirúrgica estéril para realizar un bisel en la punta de cada tramo de tubo. A continuación, para preparar la cánula intraduodenal, enrolle la cánula sobre sí misma y luego caliente la cánula para crear un punto de anclaje en el tubo.El día de la cirugía, afeite el vello de la región abdominal derecha, la región del cuello y la región de la clavícula izquierda de una rata adulta anestesiada, y luego limpie las áreas quirúrgicas asépticamente con tres aplicaciones sucesivas de solución de povidona yodada y alcohol al 70 % para canular el conducto linfático. Coloque al animal con el lado derecho hacia arriba y utilice una hoja de bisturí estéril para abrir la capa superior de la pared muscular abdominal mediante una incisión recta de cuatro centímetros que se extiende desde el apéndice xifoides hasta la región lateral derecha, aproximadamente dos centímetros por debajo del margen costal. Retraiga el intestino delgado por debajo de la pared abdominal izquierda y utilice dos o tres trozos de gasa estéril saturada con solución salina normal para mantenerla en su lugar.Luego, coloque la rata sobre una jeringa de plástico de 10 mililitros colocada horizontalmente debajo de la espalda del animal, a la altura del riñón derecho. Para ayudar en la visualización del conducto linfático mesentérico, localice el conducto linfático mesentérico superior, que tiene aproximadamente de 0,5 a un milímetro de diámetro, es perpendicular al riñón derecho y se encuentra inmediatamente craneal y paralelo a la arteria mesentérica pulsátil de color rojo oscuro. Tenga en cuenta que en ratas no ayunadas, como se muestra aquí, el conducto linfático mesentérico superior es blanco, opaco y más fácil de visualizar que en ratas infestadas.A continuación, pase un par de fórceps rectos a través del lecho adiposo perineal en el margen inferior del riñón derecho, paralelo al conducto linfático mesentérico superior y a través de las capas de tejido conectivo inmediatamente por debajo de la vena cava. Luego, utilizando la punta de los fórceps, tire de la cánula linfática a través del lecho adiposo perineal, de modo que un extremo quede inmediatamente adyacente al conducto linfático mesentérico y el otro exteriorizado del animal a la altura del riñón derecho. A continuación, utilizando un microscopio quirúrgico y fórceps de joyero, aísle el conducto linfático mesentérico a través de las capas superpuestas de tejido conectivo y adiposo mediante disección roma, comenzando por el extremo inferior y teniendo cuidado de no dañar el conducto linfático una vez que este haya sido aislado.Utilice la punta de unas pinzas finas para hacer un pequeño orificio en el conducto linfático. Después de asegurarse de que la cánula linfática esté completamente llena de solución anticoagulante y no tenga burbujas de aire, use un par pequeño de pinzas para insertar la cánula linfática aproximadamente dos a cuatro milímetros dentro del conducto linfático mesentérico a través del orificio de punción. Si la canulación tiene éxito, se observará un flujo gradual de linfa intestinal proveniente del extremo colector libre de la cánula.Cuando esto ocurra, coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato sobre el orificio de entrada al conducto linfático para asegurar la cánula, teniendo cuidado de no obstruir el vaso con exceso de pegamento al canular el duodeno. Primero, localice el tejido como la sección de color rosa brillante del intestino delgado, que al tirar suavemente hacia abajo revela el estómago. Luego, utilice una aguja estéril de calibre 23 para hacer un pequeño orificio de punción en el duodeno en la región del píloro, aproximadamente dos centímetros por debajo de la unión entre el estómago y el duodeno.A continuación, inserte el extremo del gancho en forma de js de la cánula duodenal a través del orificio y asegure la cánula en su lugar con una gota de pegamento acrílico Sano. Luego, use suturas para cerrar la incisión en la pared muscular abdominal. La canulación de la arteria carótida puede realizarse antes o después de la canulación del conducto linfático mesentérico. Por lo general, preferimos canular la arteria carótida antes de canular el conducto linfático, para reducir la posibilidad de desplazar la cánula linfática al mover al animal. Para canular la arteria carótida, primero marque la cánula de la arteria carótida a 2,5 centímetros desde la punta biselada, a fin de identificar la porción del tubo que se insertará en la arteria.Luego, conecte el extremo no biselado de la cánula a una aguja de 25 gauge unida a una jeringa llena de solución anticoagulante y llene la cánula con la solución, asegurándose de que no haya espacios de aire. A continuación, realice una incisión longitudinal de uno a 1,5 centímetros a través de la capa de piel por encima del lado izquierdo de la tráquea en el plano sagital, y luego use pinzas de punta roma para disecar el tejido conectivo subcutáneo y exponer los músculos cervicales apareados subyacentes. Retraiga los músculos cervicales para revelar la arteria carótida izquierda pulsante ubicada aproximadamente a un centímetro por debajo de la superficie de la piel.Luego, limpie el tejido conectivo sobreyacente de la arteria mediante disección roma y use pinzas de tejido romas para aislar una sección de aproximadamente un centímetro de la arteria. A continuación, use pinzas de punta fina para pasar dos suturas de seda por debajo de la arteria carótida, colocándolas en cada extremo de la sección aislada de la arteria. Después, ate la sutura más alejada del corazón y la clavícula de la rata y coloque un par de pinzas rectas de punta fina debajo de la carótida para ocluir el flujo sanguíneo a través de la arteria.Ahora, utilizando tijeras de iris de punta fina, realice una pequeña incisión en la superficie superior de la arteria aproximadamente a un tercio del camino desde la parte superior del área aislada. Inserte la punta de la cánula en la arteria con una pinza de punta curva. Una vez insertada, retire la pinza de punta fina recta, ocluyendo el flujo sanguíneo, y avance la cánula 2,5 centímetros dentro de la arteria utilizando dos pares de pinzas.Uno para sostener la cánula dentro de la arteria y evitar que la sangre retroceda, y otro para insertar la cánula. Luego, utilice una pinza pequeña para arterias para mantener la cánula dentro de la arteria. Inyecte solución anticoagulante en la cánula y, a continuación, retire una pequeña cantidad de sangre para confirmar la permeabilidad del tubo.Luego, lave la cánula con solución anticoagulante y selle el extremo utilizando la llama de un encendedor. Finalmente, use los puntos de sutura para fijar la cánula en su lugar y retire el clamp arterial. A continuación, coloque un tercer punto de sutura alrededor de la arteria y la cánula, acorte la longitud de los puntos alrededor de la arteria y cierre la herida del cuello con más puntos de sutura tras el período de recuperación, infundiendo una formulación de interés en el animal a través de la cánula duodenal.Como se ilustra en la gráfica tras la administración del modelo, el fármaco lipófilo halal faneno, la velocidad media de flujo linfático en las ratas con cannulación exitosa estuvo entre 0,4 y 1,3 mililitros por hora. En algunos animales, la velocidad de flujo linfático fue ligeramente menor durante la primera a tres horas posteriores a la cannulación antes de aumentar, un fenómeno comúnmente observado tras la cannulación linfática exitosa en ratas con cannulación fallida. Sin embargo, la velocidad de flujo permanece sustancialmente más baja en comparación con la observada en los experimentos exitosos durante todo el período de recolección.De manera similar, en estos experimentos representativos, el transporte linfático acumulativo de triglicéridos y RIN halal fue sustancialmente menor en los animales con cannulación fallida. Mientras que en los grupos con cannulación exitosa, el transporte acumulativo de halalan fue del 15,1 % de la dosis y el transporte acumulativo de triglicéridos fue de 61 miligramos durante 10 horas. En este experimento representativo de transporte de lípidos, la proporción de la dosis de lípido exógeno marcado con radioisótopos administrada y transportada por la linfa fue del 54 %. Estos valores no fueron significativamente diferentes a los observados previamente.Para una formulación similar, la velocidad de transporte tanto de triglicéridos como de fármacos hacia la linfa alcanza un pico poco después de la administración de lípidos y fármacos, y luego regresa a niveles basales. Como es habitual en los experimentos de transporte linfático intestinal de lípidos y fármacos. La velocidad de transporte del fármaco en la linfa durante cada período de tiempo refleja ese escenario para el transporte de triglicéridos, ya que el fármaco es transportado hacia la linfa.En asociación con las lipoproteínas ricas en triglicéridos. Una vez dominada, la canulación puede completarse en menos de 30 minutos si no se presentan dificultades. Tras este procedimiento, los componentes presentes en la linfa recolectada pueden aislarse y utilizarse en experimentos adicionales, como la reinfusión en animales receptores para evaluar directamente su función, metabolismo, eliminación o patrones de distribución. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de las técnicas para aislar y canular el conducto linfático mesentérico, la arteria carótida y el duodeno.Mediante estas técnicas, debería poder evaluar el transporte de fármacos, lípidos y otros factores desde el intestino a través y hacia la linfa mesentérica in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Canulación del conducto linfático mesentérico en un modelo de rata para recolectar líquido linfático

Este video muestra la canulación intraduodenal en un modelo de rata. Después de anestesiar a la rata, se localiza el duodeno y se crea una pequeña punción. Se inserta y asegura cuidadosamente una cánula en forma de J con una punta biselada, y se cierra la incisión. El modelo de rata canulada permite la infusión intraintestinal para estudios de inmunopatología.

Canulación intraduodenal en un modelo de rata para estudios de inmunopatología

En este video, demostramos un procedimiento quirúrgico para canular la arteria carótida izquierda en un modelo de rata.

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Presentamos un procedimiento quirúrgico para cateterizar el tronco linfático intestinal en cerdos neonatos para recolectar grandes cantidades de componentes del metabolismo lipídico de la linfa eferente.

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El acceso para la infusión a largo plazo en la arteria mesentérica superior (AME) de ratas es un procedimiento quirúrgico que consiste en la canulación de una rama proximal de la AME. La cánula sale de la herida abdominal y se tuneliza a través del espacio subcutáneo de regreso al pliegue interescapular.

Dirigido al intestino delgado de la rata: infusión a largo plazo en la arteria mesentérica superior

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

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Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

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