Experimental glaucoma inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas
2 de febrero de 2015
Presentamos un método para inducir presión intraocular (PIO) elevada, mediante la inyección de microesferas magnéticas en el ojo de rata, para modelar el glaucoma. Esto conduce a fuertes aumentos de presión y muerte neuronal extensa. Este protocolo es fácil de realizar, no requiere inyecciones repetidas y produce aumentos estables y duraderos de la PIO.
El objetivo de este procedimiento es inducir una presión intraocular elevada en la rata mediante la inyección de microesferas paramagnéticas en la cámara anterior del ojo. Primero coloque un anillo magnético alrededor del ojo de un animal anestesiado, lave las microesferas magnéticas, vuelva a suspenderlas en solución y luego cárguelas en una jeringa. A continuación, inyecte las microesferas magnéticas en la cámara anterior del ojo.
Retire el anillo magnético durante la recuperación. Los datos de proceso obtenidos de análisis histológicos como la tinción de túnel o la tinción del nervio óptico pueden medir la muerte de las células ganglionares de la retina que resulta del aumento de la presión intraocular. Lave las perlas de microesferas magnéticas esterilizadas de ocho micras tres veces en un mililitro de solución salina tamponada de Hank por reus, suspendiendo y centrifugando a 10.000 veces G durante cinco minutos.
A continuación, reus suspender en 0,5 mililitros de HBSS para una solución de 30 miligramos por mililitro. Ahora, utilizando un sonómetro de rebote calibrado para su uso en el ojo de la rata, tome cinco mediciones de PIO de referencia en los animales despiertos. Después de la anestesia, las ratas aplican ungüento ocular en el ojo contralateral no clasificado para mantenerlo húmedo.
Durante la anestesia, aplique clorhidrato de propano al 0,5%, anestésico local, en el ojo operatorio. A continuación, lave este ojo con yodo de povidona al 5% en agua. Después de cinco minutos, retire la povidona yodada y lave el ojo con solución salina estéril al 0,9%.
Mantenga el ojo húmedo durante la anestesia con la aplicación regular de solución salina estéril. Ahora coloque un imán de esteroides alrededor del ojo para minimizar el riesgo de traumatismo del iris y minimizar la pérdida de cordones. Oriente la aguja tangencial a la superficie de la córnea lo más paralela posible al iris.
Se procede a inyectar 25 microlitros de 30 miligramos por mililitro, microesferas magnéticas irradiadas con rayos gamma en la cámara anterior. Deje la aguja en su lugar durante un minuto después de la inyección para asegurarse de que las perlas se asienten en el ángulo de la córnea IOC e impidan el drenaje acuoso de la malla trabecular. Trabaje ligeramente en ángulo de la aguja unos segundos después de que las perlas se hayan asentado inicialmente para permitir algunas fugas de líquido y minimizar los aumentos transitorios de la presión intraocular.
Para asegurar el uso continuo de la aguja en procedimientos separados, enjuague la aguja con PBS. Luego, 70% de etanol, seguido de agua destilada en esta etapa. Si es necesario, retire el imán y utilícelo para dibujar cuentas en áreas de cobertura incompleta.
Deje el imán en su lugar alrededor del ojo durante 10 minutos más después de la inyección. Para asegurar que las perlas se asienten bien en el ángulo córnea írido. Anestesia inversa usando 0.25 miligramos por kilogramo de clorhidrato ESOL.
Administre clorhidrato de propano 0.5 para analgesia y ungüento de cloranfenicol por vía tópica para prevenir infecciones. Deje que los animales se recuperen sobre una colchoneta térmica hasta que recuperen el movimiento. Luego transfiera a una caja tibia.
Utilice el ojo contralateral como un control no clasificado. Repetir las mediciones de PIO cada dos o tres días después de la administración de perlas y cada dos o tres días a partir de entonces, definir los criterios para incluir los ojos en los estudios, incluyendo la PIO se eleva por encima de la presión de control contralateral en cinco milímetros de mercurio, y la PIO no supera los 60 milímetros de los ojos de mercurio donde la presión vuelve a la línea de base una semana después de la inyección. Sin embargo, es posible volver a inyectar perlas en los ojos que no desarrollan una PIO alta si se desea.
Fijar los ojos disecados y el nervio óptico en paraldehído al 4%, evaluando el daño de las neuronas de la retina mediante tinción de túnel y el daño del nervio óptico mediante azul de toinea. Tinción. En este experimento, la inyección de perlas magnéticas en el ángulo córneo irid indujo consistentemente un aumento prolongado y robusto de la presión. Además, el aumento de presión se mantuvo durante todo el experimento.
La PIO media promediada durante todo el experimento para los ojos de control no inyectados con perlas fue de 19,7 más menos 0,3 milímetros de mercurio y de 40,5 más menos 2,8 milímetros de mercurio para los ojos inyectados con perlas. Además, la PIO máxima aumentó de 22,8 más menos 0,3 milímetros de mercurio a 49,9 más menos 2,3 milímetros de mercurio para determinar si la elevación de la PIO conduce a la muerte de las células ganglionares de la retina. La tinción de túnel se realizó en las retinas y la histología en las secciones del nervio óptico transverso en la retina.
Observamos un aumento en la tinción de túnel en ojos inyectados con perlas con PIO elevada. El número de núcleos apoptóticos aumentó aproximadamente 15 veces con respecto a las retinas hipertensas de control contralateral, como se esperaba en los ojos en los que se inyectaron perlas magnéticas sin presión, el número de células positivas en túnel no fue significativamente diferente de las de los controles no inyectados. La investigación adicional de la patología del nervio óptico en el modelo de glaucoma mostró la acumulación de azul de odido en muchos de los axones, lo que indica la degeneración de estos procesos celulares.
Descripción general
Este estudio presenta un método para inducir una presión intraocular (IOP) elevada en ratas mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior del ojo, modelando el glaucoma. El procedimiento provoca aumentos significativos de presión y muerte neuronal, proporcionando un incremento estable y duradero de la IOP sin necesidad de inyecciones repetidas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Investigación sobre glaucoma
Antecedentes
- La PIO elevada es un factor de riesgo importante para el glaucoma.
- Los modelos actuales a menudo requieren múltiples intervenciones.
- Las microesferas magnéticas ofrecen un enfoque novedoso para inducir la PIO.
- Comprender la muerte neuronal en el glaucoma es crucial para desarrollar tratamientos.
Objetivo del estudio
- Establecer un modelo confiable para estudiar el glaucoma en ratas.
- Evaluar el impacto del aumento de la PIO sobre la muerte de las células ganglionares de la retina.
- Evaluar los efectos a largo plazo de las inyecciones de microesferas magnéticas sobre la PIO.
Métodos Utilizados
- Inyección de microesferas paramagnéticas en el ojo de la rata.
- Medición de la PIO mediante un tonómetro de rebote.
- Análisis histológico del daño retiniano y del nervio óptico.
- Evaluación de la muerte celular apoptótica mediante tinción TUNEL.
Resultados principales
- Elevación significativa y sostenida de la PIO en ojos inyectados con microesferas.
- Aumento de la muerte de células ganglionares retinianas correlacionado con niveles elevados de PIO.
- Evidencia histológica de degeneración del nervio óptico.
- Los ojos control mantuvieron niveles normales de PIO durante todo el estudio.
Conclusiones
- El método modela eficazmente el glaucoma en ratas.
- El aumento de la PIO provoca daños neuronales significativos.
- Este modelo puede utilizarse en investigaciones futuras sobre el glaucoma y en pruebas terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método proporciona un modelo robusto y reproducible para inducir un aumento sostenido de la presión intraocular en ratas, lo que permite estudios mecanicistas de la fisiopatología del glaucoma. Apoya la validación de objetivos al vincular el aumento de la presión con la muerte de las células ganglionares de la retina y la degeneración del nervio óptico, ofreciendo un valor predictivo para la selección de terapias neuroprotectoras. La simplicidad del modelo y su efecto duradero reducen la variabilidad experimental, facilitando la colaboración multifuncional en las líneas de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la relación causal entre la PIO y el glaucoma mediante la inducción de una elevación sostenida de la presión.
- Valor operativo: Proporciona un fenotipo consistente para evaluar la interacción con el blanco en las vías patogénicas.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de blancos implicados en la regulación de la malla trabecular y la dinámica del humor acuoso.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantificables de PIO y hallazgos histopatológicos para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Proporciona mediciones reproducibles de PIO basal y elevada para campañas de cribado de compuestos.
- Valor científico: Permite la evaluación de respuesta a la dosis de agentes reductores de la PIO mediante el monitoreo longitudinal de la presión.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Recapitula patologías clave del glaucoma, incluida la apoptosis de las células ganglionares de la retina y la degeneración axonal del nervio óptico.
- Valor operativo: Facilita la evaluación preclínica de compuestos neuroprotectores y moduladores de la PIO en un sistema relevante para la enfermedad.
- Valor científico: Permite la alineación de biomarcadores mediante el análisis correlativo de los niveles de PIO y las métricas de muerte neuronal.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en la continuación del descubrimiento del glaucoma, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica de la eficacia, respaldado por su capacidad para generar un aumento medible de la PIO y la neurodegeneración subsiguiente.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos impulsados por la PIO en la patología retiniana y del nervio óptico.
- Detección: Proporciona la PIO como biomarcador farmacodinámico para evaluar los efectos de compuestos sobre el drenaje del humor acuoso.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de la PIO y puntos finales histopatológicos para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona el aumento de la PIO con neurodegeneración relevante para el ser humano, apoyando la continuidad traslacional.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de inducción de PIO adaptable a diversos modelos de roedores para estudios longitudinales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la causalidad entre la PIO y el glaucoma mediante la elevación sostenida de la presión y la neurodegeneración.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante técnicas estandarizadas de inyección de microesferas y posicionamiento magnético.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la variabilidad biológica en estudios de eficacia basados en la PIO.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapias para el glaucoma según sus perfiles de reducción de la PIO y efectos neuroprotectores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía ocular en roedores y medición de la presión intraocular mediante tonometría de rebote.
- Depende del acceso a microesferas magnéticas estériles, equipo de esterilización y reactivos para tinción histológica.
- Necesita la estandarización entre equipos de los criterios de elevación de la presión intraocular y de los protocolos de evaluación histológica.
- Implica consideraciones de adaptación para la anatomía del ojo del ratón y su menor volumen de la cámara anterior.
- Limitado por la necesidad de monitoreo postoperatorio para excluir respuestas transitorias de presión y asegurar la consistencia del modelo.
