los En Ovo Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular

El objetivo general de este experimento es desarrollar un modelo fiable de xenoinjerto de CAM para el carcinoma hepatocelular. Esto se logra incubando primero los huevos para prepararlos para la inoculación. Como segundo paso, se deja caer la membrana choal y toica o la leva del huevo y se corta una ventana en la cáscara del huevo.

A continuación, el óvulo se inocula con células de carcinoma hepatocelular humano a través de la ventana de la cáscara del huevo para establecer el crecimiento del tumor. Los resultados muestran que los tumores vascularizados tridimensionales se cultivaron con éxito utilizando líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano. Con este protocolo se lograron tasas de supervivencia embrionaria de hasta el 93%.

Las principales ventajas del ensayo CAM frente a otras técnicas in vivo como los modelos tumorales de ratón es el corto tiempo de ensayo experimental, el bajo coste global del experimento y la preparación. Los ensayos CAM de reproducibilidad se pueden utilizar para estudiar la angiogénesis, el tumor, la invasión celular y la metástasis. También se pueden utilizar para determinar el efecto de moléculas pequeñas y fármacos en el crecimiento y desarrollo de tumores.

La demostración visual de este procedimiento es importante debido a los diferentes pasos que se llevan a cabo en la preparación del huevo, incluyendo la ovoscopia, la identificación de la vasculatura, la realización de pequeños pinchazos cerca del saco de aire y en la parte superior del huevo sin drenarlo. Cortar las ventanas sin romper la cáscara del huevo y asegurarse de que la cámara esté intacta durante todos los procesos podría ser un desafío para los nuevos usuarios. Para empezar a colocar.

Huevos de gallina nativos de ocho días de edad, libres de patógenos específicos, en una bandeja de huevos giratoria con un sello hacia arriba. Coloque la bandeja giratoria dentro de una incubadora de huevos a 36 grados centígrados con 50% de humedad e incube los huevos durante 48 horas. Después de la incubación, coloque los huevos en un estante para huevos con los extremos estampados hacia arriba y colóquelos en una campana de flujo laminar.

Apague la habitación y las luces del capó sujetan ligeramente el extremo estampado del huevo al candelabro para exponer la vasculatura del pollito Chorio Allen Toic, membrana conocida como leva y el saco de aire. Haz una marca entre los dos vasos sanguíneos principales con un lápiz. A continuación, haz un agujero en la punta del huevo por encima de la bolsa de aire en el extremo estampado y un segundo agujero en la marca del lápiz.

Con un alfiler estéril, el orificio debe tener unos tres milímetros de profundidad. Exprima el aire de una bombilla de seguridad y presione el extremo abierto firmemente contra el orificio sobre el saco de aire. Suelte lentamente la bombilla para aplicar succión, tirando del aire hacia el orificio en la marca del lápiz y haciendo que la leva se desprenda de la carcasa.

Confirme que el saco de aire se ha movido desde el extremo estampado del huevo hasta el agujero marcado con el lápiz con el candelabro. Si no es así, haga ambos orificios un poco más profundos y vuelva a aplicar la succión con la bombilla de seguridad. A continuación, sostenga el huevo en una mano con una herramienta giratoria con un accesorio de disco de corte de 1516 pulgadas.

Realice dos cortes de transferencia a través de la carcasa sin tocar la leva. El corte debe tener dos centímetros de largo y un centímetro de distancia. A continuación, realice cortes longitudinales en los extremos de los dos cortes transversales tocando ligeramente el disco de corte con la carcasa.

Para retirar la carcasa, deslice las pinzas estériles por debajo y paralelamente a la pieza de la concha. Agarra la pieza con las pinzas y retírala limpiamente. Sostenga un extremo de un trozo de cinta adhesiva sobre sí mismo y luego coloque la cinta sobre la abertura del huevo.

Cáscara: coloque el huevo en una bandeja de huevos y coloque la bandeja en la incubadora sin rotación durante no más de dos o tres horas antes de la inoculación. Para prepararse para la inoculación, coloque una mezcla de proteínas de la membrana basal, como matrigel, en hielo para evitar la polimerización. A continuación, utilice de cuatro a cinco mililitros de una solución de dos milimolares de EDTA por matraz para separar las células tumorales y coloque el matraz en la incubadora de cultivo de tejidos durante cinco minutos.

Reus, suspenda las células separadas en el medio y cuente el número de celda. Utilice entre 500, 000 y 2 millones de células para injertar en la leva, dependiendo de la línea celular. A continuación, transfiera el volumen necesario para obtener el número adecuado de células a un nuevo tubo y centrifugue durante cinco minutos.

A 500 veces la gravedad, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la célula de pellet. En 40 microlitros de PBS que contiene calcio y magnesio conocido como PBS plus plus y 20 microlitros de mezcla de membrana basal. En este punto, se pueden agregar medicamentos u otros agentes de prueba a la suspensión celular.

A continuación, coloque la bandeja de huevos en la campana de flujo laminar. Pele la cinta del huevo y deje caer un anillo de silicona estéril de un milímetro de un vial criogénico a través de la abertura y sobre el tubo de leva. Coloque la solución de 60 microlitros de células, PBS plus plus y la mezcla de membrana basal en el centro del anillo de silicona, vuelva a pegar la ventana con cinta adhesiva y mueva con cuidado la bandeja de huevos de regreso a la incubadora.

Permita que los tumores crezcan durante cinco a siete días. Para la recolección de los tumores. Coloque una almohadilla y una bolsa de riesgo biológico en el capó.

Prepare placas de 35 milímetros por 10 milímetros que contengan un mililitro de PBS plus plus y recipientes de formaldehído para formaldehído, según sea necesario para la histología. Inserte el extremo puntiagudo de la disección estéril, las tijeras en el huevo en el agujero cerca del extremo estampado y corte alrededor de la longitud de todo el huevo. La leva y el tumor con el anillo deben adherirse a la mitad superior de la cubierta con la abertura.

Extraiga el tumor de la leva con disección, tijeras y fórceps, y coloque el tumor en una placa de 35 milímetros por 10 milímetros. Mida y pese el tumor. Fijar el tumor en paraforma, aldehído y parafina incrustados para su uso en experimentos de histología e inmunohistoquímica.

Después de extraer el tumor, pica el tumor en la placa con unas tijeras de disección. A continuación, vierta el tumor picado en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y retire el PBS plus plus mediante pipeteo. Agregue dos mililitros de una solución de un miligramo por mililitro de colagenasa en PBS plus plus y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.

Incube el tubo a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos y hasta varias horas. A continuación, agregue cinco mililitros de medio al tubo y mezcle bien pipeteando de 20 a 40 veces. Esto es fundamental para disociar las células por completo.

Después de que el sedimento se haya asentado, transfiera el snat a un tubo nuevo, centrifugue el tubo a 500 veces, gravedad durante cinco minutos y deseche el sobrenadante dejando atrás la pelletizada de la célula disociada. Cuando la cámara estaba asentada con siete células tumorales HUH, un tumor vascularizado era visible dentro del anillo. Después de cinco días de crecimiento, la histología del tumor HUH seven del ensayo CAM mostró que las células tumorales se parecen a las células de carcinoma hepatocelular indiferenciado.

Al trabajar con este método, es importante recordar que es posible que se requieran ciertas optimizaciones en lo que respecta a diferentes células o diferentes fármacos. Por ejemplo, algunas líneas celulares pueden necesitar densidades más altas o más bajas para formar tumores tridimensionales.