Name: Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprende a medir la actividad proteolítica de Granzima B mediante un ensayo colorimétrico específico que utiliza lisados celulares de células NK. Este método permite evaluar directamente la función enzimática en investigación inmunológica.

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Este trabajo recibió apoyo a través de la subvención HA 6136/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) a MH. JAT cuenta con el apoyo de subvenciones para programas y proyectos del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia.

NOTA: Los bazos fueron derivadas de ratones (6-10 semanas de edad) y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Ética Animal del Centro de Cáncer Peter MacCallum (E486). 1. Preparación de las muestras. <ol><li> Preparación de células de ratón NK activadas. <ol><li> Aislar las células NK ingenuos primarias a partir de suspensiones de una sola célula de bazo de C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) ratones por selección negativa utilizando kits disponibles en el mercado. </li><li> Siga el protocolo de los fabricantes. Brevemente, magnéticamente marcar las células NK &quot;no&quot;, tales como las células T y B, células dendríticas, granulocitos, macrófagos, y células rojas de la sangre utilizando anticuerpos conjugados con biotina contra sus marcadores de superficie específicos. Utilice separación magnética con cuentas anti-biotina para agotar las células NK &quot;no&quot;. </li><li> Aislado Cultura células NK durante 5-7 días en medio que contenía IL-2 (1000 U / ml) a 700,000 células / ml en placas de 24 pocillosa 37 &#160; ° C. </li><li> Alternativamente, el uso de células T activadas 19, CTL restringido el antígeno principal de OT1 receptor de células T de ratones transgénicos 20, CTL generados en cultivos mixtos de linfocitos 21, o los sobrenadantes de las células NK activadas para determinar la actividad de secretada GzmB 19. </li></ol></li><li> Mantenimiento de la línea humana de células NK y el aislamiento de células primarias NK. <ol><li> Mantener la leucemia NK humana (células YT) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Alternativamente, purificar células NK primarias de la sangre periférica de sujetos sanos y estimular durante 2-3 días en medio que contiene IL-2 a 100 U / ml como se ha descrito previamente 22. </li></ol></li><li> Generación de lisados ​​celulares. <ol><li> Lavar las células tres veces en PBS (pH 7,4), a continuación, suspender en Nonidet P-40 tampón de lisis (0,1% NP-40, NaCl 250 mM, 25 mM Hepes, EDTA 2,5 mM). Idealmente, la lisis de un mínimo de 5 x 10 6 </sarriba&gt; células NK, o 1 x 10 7 células T en 100 l de tampón. No añadir inhibidores de la proteasa, ya que muchos son inhibidores irreversibles de proteasas de serina, y en triptasas particulares como GzmA. Incubar en hielo durante 20 min, y luego sedimentar los núcleos en una microcentrífuga a 15.000 xg durante 10 min. Desechar el pellet nuclear y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. </li></ol></li><li> Determinar la concentración de proteína de los lisados. <ol><li> Use un protocolo disponible comercialmente de elección tales como, Bradford o ácido bicinconínico (BCA) y determinar la concentración de proteínas. Asegúrese de que la concentración es de ~ 2 mg mínimo / ml. Lisados ​​almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario (actividad granzima es estable durante muchos meses a -20 ° C). </li></ol></li></ol> 2. granzima B Ensayo de la actividad <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar una mM balance de los sustratos (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-PNA) 10 en DMSO (~ 5 mg / ml) y almacenar en alícuotas a -20 &amp; #176; C. Prepare una dilución de trabajo recién y desechar después de cada día, como Boc-AAD-S-Bzl hidroliza parcialmente en el almacenamiento en DMSO. </li><li> Preparar una población de 250 mM de reactivo colorimétrico (5,5&#39;-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico), DTNB) en DMSO (0,09 g / ml) y se almacena a -20 ° C. Prepare una dilución de trabajo nueva cada día. Este reactivo sólo se requiere para sustratos con grupos indicadores SBzl, no ANP. </li><li> Invente tampón fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) cada 2-3 semanas. </li></ol></li><li> Llevar DTNB y sustratos sintéticos a temperatura ambiente. Diluir sustratos (1:16, por ejemplo, 100 l en 1,6 ml de tampón) y DTNB (1: 250, por ejemplo, 10 l en tampón 2,5 ml) y mezclar bien. </li><li> Diluir un mínimo de 100 g de proteína de lisado de cada muestra en un tampón a un volumen final de 160 microlitros. Usando una pipeta multicanal añadir 50 l por pocillo por triplicado (~ 33,3 g / pocillo) en una &#39;&#39; U &#39;&#39; de vinilo del fondo placa de 96 pocillos.Incluir un &quot;búfer de sólo&quot; control (también por triplicado). </li><li> Añadir 100 l de diluirse DTNB para el control de muestras / tampón (omita este paso cuando se trabaja con Ac-IEPD-pNA. NOTA: La escisión de Ac-IEPD-pNA por GzmB libera directamente fluorogénica pNA (Figura 4B). </li><li> Utilizar una pipeta multicanal para añadir rápidamente 50 l de sustratos diluidas a cada conjunto de triplicados, empezando con el tampón entonces cualquier controles negativos y terminando con muestras positivas esperados. </li><li> Colocar la placa en el lector de placas. Medir la actividad Asp-asa por hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA en un lector de microplacas a OD 405 nm. Utilice un protocolo de ensayo cinético, tomar 25 lecturas, cada 15 segundos (aprox 6 min tiempo de lectura total). </li><li> Use las lecturas de absorbancia generadas en cada punto de tiempo para calcular manualmente la tasa de escisión de sustrato de si el software del lector de placas no puede generar un valor de Vmax. </li></ol> 3. Análisis de Data NOTA: Los datos generados se presenta como velocidad máxima, que se define como el cambio de OD en el tiempo (mod / min). <ol><li> Para analizar los datos, determinar la tasa máxima de escisión de sustrato, que se calcula a partir de la tasa de cambio en la absorbancia. Hacer esto automáticamente con el software lector de placas, que normalmente tiene esta opción. </li><li> Alternativamente después de ver las parcelas cinéticos de cambio en la absorbancia, que se generan durante el ensayo cinético en el lector de placas, seleccionar manualmente los puntos de datos que dan a la línea recta más empinada. Para la mayoría de los ensayos se consigue la tasa máxima dentro de la primera 2 min del ensayo. </li><li> Restar la lectura OD inicial a partir de la lectura más alta OD en esta línea recta y se dividen por el intervalo de tiempo. Transferir datos brutos a Microsoft Excel / Gráfico almohadilla para el análisis estadístico y gráfico. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Históricamente las granzimas fueron identificados como moléculas efectoras clave de linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) capaces de inducir una muerte apoptótica rápida en las células diana. Esto se debió principalmente a la acción de GzmB, que escinde moléculas de sustrato diana a aspartato (D) los residuos y por lo tanto fue capaz de activar la cascada de caspasas por ambas escisión pro-caspasas, así como varios de sus objetivos de abajo. Sin embargo, ahora se aprecia que la expresión GzmB no se limita a las célu...

Granzimas son una familia de serina proteasas que se encuentran en los lisosomas secretores de las células (NK) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 1 asesino natural. Existen cinco granzimas diferentes en los seres humanos (A, B, H, K y M), y diez en ratones (A - G, K, M y N) 2,3. Granzima A y granzima B (GzmA, GzmB) son las más abundantes y han sido investigadas extensamente en el ambiente humano y de roedor. La función clásica de GzmB es la inducción de apoptosis en las células diana ejecutados en conjunción con la proteína de perforina de formación de poros, que permite la granzima para acceder al citosol de la célula diana 4. Aunque la expresión GzmB se encuentra de manera inequívoca en los linfocitos citotóxicos, estudios recientes se han ocupado de una variedad de otros tipos de células que expresan GzmB, incluyendo pero no limitado a los queratinocitos 5, 6 basófilos, mastocitos, células dendríticas 7 plasmacitoides 8, 9 y las células B, 10.En este contexto, las funciones GzmB no apoptóticas fueron revelados desde la participación en los procesos inflamatorios, la remodelación de tejidos y otras propiedades inmunorreguladoras 11-14. Dado que un papel biológico más amplio se ha propuesto para GzmB lo que se sospechaba previamente, los investigadores necesitan herramientas fiables y específicos para su detección. De la ventaja es requisito específico de GzmB para escindir en el lado carboxilo de residuos de ácido aspártico, una propiedad única entre serina proteasas eucariotas 15. Ratón, humano y de rata GzmB son estructuralmente muy similares, sin embargo, la especificidad de sustrato prolongado de GzmB ratón difiere sutilmente de que tanto de humano y de rata 16, lo que significa que ciertos sustratos genéricos con Asp en la terminal (P1) se pueden escindir eficientemente por GzmB de las tres especies, mientras que otros sustratos con secuencias más complicadas aguas arriba de P1 puede dar resultados muy variables. Tanto en el pasado y li más recienteterature, este hecho ha causado gran confusión y mala interpretación de la importancia biológica de algunos resultados experimentales, aunque cuidadosamente controlado, estudios cinéticos han tratado de corregir la situación 17. En este trabajo hemos tratado de ilustrar estos puntos usando dos sustratos disponibles en el mercado, a saber, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl y N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilida. Los dos reactivos hacer generar diferentes grupos reactivos después de la escisión (un sulfhidrilo libre versus un paranitroanilida libre fluorescente), pero esto no tiene efecto alguno sobre la escisión proteolítica. El protocolo descrito es una adaptación moderna de un protocolo muy antiguo 18, pero debería ayudar a los investigadores a utilizar los diferentes sustratos GzmB adecuadamente, mientras que también proporciona un marco metodológico para la detección de la actividad de otros granzimas, como GzmA y GzmH.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Sustrato Granzyme B (ratón y humano)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009</td><td></td><td>Sustrato Granzyme B (solo humano)</td></tr><tr><td>N-&#945;-CBZ-L-lisina-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Sustrato Granzyme A</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Sustrato Granzyme H</td></tr><tr><td>5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman' s Reactivo</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células NK II ratón</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>kit de selección de</td></tr><tr><td>negativos kit de aislamiento de células NK humano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657 kit de</td><td>selección de negativos</td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager versión del software MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster Vinilo con fondo en U Placa de 96 pocillos</td><td>Corning, MA, EE. UU</td>. <td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima b actividad proteolítica: la hidrólisis de boc-ala-ala-asp-s-bzl

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

La serina proteasa Granzyme B (GzmB) media la apoptosis de las células diana cuando es liberada por los linfocitos T citotóxicos (CTL) o las células asesinas naturales (NK). La GzmB es la granzima más estudiada en humanos y ratones, por lo que los investigadores necesitan herramientas específicas y fiables para estudiar su función y papel en la fisiopatología. Esto requiere especialmente ensayos que no reconozcan proteasas como caspasas u otras granzimas que estén estructural o funcionalmente relacionadas. Aquí, aplicamos la preferencia de GzmB por la escisión después de los residuos de ácido aspártico en un ensayo colorimétrico utilizando el péptido tioéster Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. La GzmB es la única serina proteasa de mamíferos capaz de escindir este sustrato. El sustrato es escindido con una eficiencia similar por el GzmB humano, de ratón y de rata, una propiedad que no comparten otros sustratos de péptidos disponibles comercialmente, incluso algunos que se anuncian como adecuados para este propósito. Este protocolo se demuestra utilizando lisados no fraccionados de células NK activadas o CTL y también es adecuado para proteasas recombinantes generadas en una variedad de sistemas procariotas y eucariotas, siempre que se utilicen los controles correctos. Este ensayo es un método altamente específico para determinar la actividad proapoptótica potencial de las moléculas citotóxicas en los linfocitos de mamíferos y de sus contrapartes recombinantes expresadas por una variedad de metodologías.

El sustrato Boc-AAD-S-Bzl es específico para GzmB El GzmB serina proteasa es un constituyente principal de los linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) y es predominantemente responsable de inducir la rápida muerte apoptótica en las células diana, tales como células infectadas por virus o transformadas. Esto es en gran parte debido a su preferencia de sustrato para la escisión después de ciertos residuos de aspartato específicos en las proteínas seleccionadas, un atributo c...

Describimos un ensayo colorimétrico cuantitativo simple que mide específicamente la actividad proteolítica de Granzima B (GzmB) humana, de ratón o de rata. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para determinar la actividad proteasa de otras proteasas de serina en gránulos mediante la hidrólisis de otros sustratos peptídicos sintéticos con una secuencia de reconocimiento adecuada.

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir la actividad proteolítica de la enzima proteasa granzima B. Esto se logra primero preparando un lisado de las células de interés y luego agregando rápidamente el sustrato a las muestras. La actividad de la granzima B se mide entonces mediante una reacción colorimétrica. En última instancia, la escisión altamente específica de alla alla as s benzo por la granzima B puede evaluarse en función de su especificidad única para residuos de ácido aspártico.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la detección de la expresión de granzima B mediante PCR o Western blot, es que la hidrólisis del benciloxi es específica para la granzima B e indica además que la proteasa está activa. Para preparar la célula, los lisados aíslan primero células NK primarias a partir de suspensiones de células individuales de bazo procedentes de ratones C57 negro seis de tipo salvaje o de ratones control nulos para el gen de la granzima B, mediante selección negativa utilizando kits disponibles comercialmente, según las instrucciones del fabricante, tras haber activado las células. Lave el cultivo tres veces con PBS a velocidad máxima durante dos o tres segundos, y luego re suspenda el precipitado que contiene un mínimo de 5 millones de células NK en 100 microlitros de tampón de lisis NP-40 en hielo durante 20 minutos.Luego, centrifugar el lisado en una microcentrífuga durante 10 minutos a 15.000 G y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Después de determinar la concentración de proteína según el protocolo comercialmente disponible apropiado, almacenar el lisado a una concentración mínima de aproximadamente dos miligramos por mililitro a -20 grados Celsius para realizar un ensayo de actividad de gránulo B. A continuación, diluir un mínimo de 100 microgramos de lisado proteico por muestra en tampón HEPES recién preparado hasta un volumen final de 160 microlitros.Luego, utilizando una pipeta multicanal, cargue 50 microlitros de muestra por pocillo en tres réplicas en una placa de poliestireno de 96 pocillos con fondo en U. Teniendo cuidado de incluir tres pocillos de control con solo tampón, agregue 100 microlitros de DTNB diluido a cada uno. Luego, agregue rápidamente 50 microlitros de sustrato de alalasca benzoil recién diluido a cada uno de los pocillos con solo tampón, seguido de cualquier control negativo, y finalizando con las muestras positivas esperadas.Mida la actividad de aase mediante la hidrólisis de alala como bencilo en un lector de microplacas a una densidad óptica de 405 nanómetros utilizando un protocolo de ensayo cinético que tome 25 lecturas cada 15 segundos. Finalmente, utilice el software del lector de placas para calcular la velocidad máxima de escisión del sustrato para cada pocillo, y luego transfiera los datos brutos al software adecuado de análisis estadístico utilizando ratones con eliminación génica de granzima. Se descubrió que el sustrato peptídico sintético alala como bencilo es hidrolizado específicamente por granzima B. Además, se puede medir una escisión más robusta del sustrato sintético en lisados celulares de células NK primarias de tipo silvestre, pero no en células NK de animales con eliminación de granzima B, como control.En este experimento, la actividad proteolítica de la granzima A, que tiene una especificidad de sustrato similar a la tripsina y está presente en lisados de ambos tipos de células, fue igual medida mediante la hidrólisis de BLT bencilo, I-E-P-D-P-N-A se ha utilizado genéricamente para probar la actividad de la granzima B entre especies. En este experimento representativo, el análisis de las secuencias de tetrapéptidos reveló que la granzima B humana, pero no la de ratón, puede escindir eficientemente después de la secuencia IEPD, que coincide con la secuencia de reconocimiento en Bid humano y de ratón. En contraste, disminuir la cantidad de lisado de células leucémicas NK humanas de 30 microgramos a 10 microgramos aún resulta en suficiente enzima granzima B para hidrolizar el sustrato I-E-P-D-P-N-A.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elegir el sustrato y los controles experimentales adecuados para el análisis in vitro de la enzima B roja de humanos y ratones.

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

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Investigación

JoVE Journal

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Química

En este video, realizamos zimografía, una técnica electroforética, para analizar la actividad proteolítica dentro de muestras biológicas.

Zimografía de péptidos fluorescentes: una técnica modificada para detectar la actividad de la proteasa utilizando sustratos fluorogénicos en geles de zimograma

Este video describe un ensayo luminiscente in vitro de Caspasa-3/7 para cuantificar la muerte celular o la apoptosis. El ensayo mide la luminiscencia producida después de la escisión de caspasa-3/7 de un sustrato DEVD proluminiscente. La luminiscencia generada es proporcional a la actividad de la caspasa-3/7.

Ensayo de Caspasa-3/7: Un ensayo basado en luminiscencia para cuantificar la apoptosis midiendo las actividades de Caspasa-3/7 en explantes de piel de rana

Este video muestra un ensayo para detectar la actividad proteolítica de las proteasas utilizando péptidos fluorogénicos. La proteasa reconoce su sitio de escisión en el péptido, escindiéndolo y separando el extinguidor del fluoróforo, lo que permite su emisión de fluorescencia. La señal de fluorescencia se detecta y analiza para comprobar la eficiencia de escisión de diferentes variantes de péptidos.

Un ensayo de escisión de péptidos fluorogénicos para detectar la actividad proteolítica de las proteasas

Este video muestra un ensayo para monitorear la activación de neutrófilos y la exocitosis de gránulos a través de un ensayo de degranulación. Al ser activados por compuestos proinflamatorios, los gránulos citoplasmáticos dentro de los neutrófilos que contienen gelatinasa se fusionan con la membrana celular, descargando su carga. La presencia de gelatinasa en el sobrenadante se evalúa mediante la hidrólisis de un sustrato de gelatina conjugado con fluoróforos, lo que confirma la activación y...

Un ensayo de degranulación para controlar la activación de neutrófilos y la liberación de gelatinasa

Este video muestra un ensayo de degranulación de gránulos azurófilos en neutrófilos de ratón, que involucra la estimulación de neutrófilos para liberar gránulos azurófilos que contienen mieloperoxidasa. La reacción enzimática posterior se emplea para cuantificar los niveles de mieloperoxidasa, lo que proporciona información sobre la activación de los neutrófilos.

Un ensayo para monitorear la degranulación de gránulos azurófilos en neutrófilos después de la activación

Describimos aquí un sistema de expresión de granzima rentable utilizando células HEK293T que produce altos rendimientos de proteasa pura, totalmente glicosilada y enzimáticamente activa.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

Aquí, presentamos protocolos para cribar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión de microportaobjetos y el ensayo de liberación de colorante utilizan sustratos bacterianos objetivo para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimática.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.

Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN).  Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Este protocolo describe el desarrollo de un método de ensayo colorimétrico para determinar la capacidad de los compuestos para inhibir o activar la actividad de la elastasa.

Cuantificación de la modulación de la actividad de la enzima elastasa mediante análisis colorimétrico

Aprende a medir la actividad proteolítica de Granzima B mediante un ensayo colorimétrico específico que utiliza lisados celulares de células NK. Este método permite evaluar directamente la función enzimática en investigación inmunológica.

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

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