Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 de noviembre de 2014
Describimos un ensayo colorimétrico cuantitativo simple que mide específicamente la actividad proteolítica de Granzima B (GzmB) humana, de ratón o de rata. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para determinar la actividad proteasa de otras proteasas de serina en gránulos mediante la hidrólisis de otros sustratos peptídicos sintéticos con una secuencia de reconocimiento adecuada.
El objetivo general del siguiente experimento es medir la actividad proteolítica de la enzima proteasa granzima B. Esto se logra primero preparando un lisado de las células de interés y luego agregando rápidamente el sustrato a las muestras. La actividad de la granzima B se mide entonces mediante una reacción colorimétrica. En última instancia, la escisión altamente específica de alla alla as s benzo por la granzima B puede evaluarse en función de su especificidad única para residuos de ácido aspártico.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la detección de la expresión de granzima B mediante PCR o Western blot, es que la hidrólisis del benciloxi es específica para la granzima B e indica además que la proteasa está activa. Para preparar la célula, los lisados aíslan primero células NK primarias a partir de suspensiones de células individuales de bazo procedentes de ratones C57 negro seis de tipo salvaje o de ratones control nulos para el gen de la granzima B, mediante selección negativa utilizando kits disponibles comercialmente, según las instrucciones del fabricante, tras haber activado las células. Lave el cultivo tres veces con PBS a velocidad máxima durante dos o tres segundos, y luego re suspenda el precipitado que contiene un mínimo de 5 millones de células NK en 100 microlitros de tampón de lisis NP-40 en hielo durante 20 minutos.
Luego, centrifugar el lisado en una microcentrífuga durante 10 minutos a 15.000 G y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Después de determinar la concentración de proteína según el protocolo comercialmente disponible apropiado, almacenar el lisado a una concentración mínima de aproximadamente dos miligramos por mililitro a -20 grados Celsius para realizar un ensayo de actividad de gránulo B. A continuación, diluir un mínimo de 100 microgramos de lisado proteico por muestra en tampón HEPES recién preparado hasta un volumen final de 160 microlitros.
Luego, utilizando una pipeta multicanal, cargue 50 microlitros de muestra por pocillo en tres réplicas en una placa de poliestireno de 96 pocillos con fondo en U. Teniendo cuidado de incluir tres pocillos de control con solo tampón, agregue 100 microlitros de DTNB diluido a cada uno. Luego, agregue rápidamente 50 microlitros de sustrato de alalasca benzoil recién diluido a cada uno de los pocillos con solo tampón, seguido de cualquier control negativo, y finalizando con las muestras positivas esperadas.
Mida la actividad de aase mediante la hidrólisis de alala como bencilo en un lector de microplacas a una densidad óptica de 405 nanómetros utilizando un protocolo de ensayo cinético que tome 25 lecturas cada 15 segundos. Finalmente, utilice el software del lector de placas para calcular la velocidad máxima de escisión del sustrato para cada pocillo, y luego transfiera los datos brutos al software adecuado de análisis estadístico utilizando ratones con eliminación génica de granzima. Se descubrió que el sustrato peptídico sintético alala como bencilo es hidrolizado específicamente por granzima B. Además, se puede medir una escisión más robusta del sustrato sintético en lisados celulares de células NK primarias de tipo silvestre, pero no en células NK de animales con eliminación de granzima B, como control.
En este experimento, la actividad proteolítica de la granzima A, que tiene una especificidad de sustrato similar a la tripsina y está presente en lisados de ambos tipos de células, fue igual medida mediante la hidrólisis de BLT bencilo, I-E-P-D-P-N-A se ha utilizado genéricamente para probar la actividad de la granzima B entre especies. En este experimento representativo, el análisis de las secuencias de tetrapéptidos reveló que la granzima B humana, pero no la de ratón, puede escindir eficientemente después de la secuencia IEPD, que coincide con la secuencia de reconocimiento en Bid humano y de ratón. En contraste, disminuir la cantidad de lisado de células leucémicas NK humanas de 30 microgramos a 10 microgramos aún resulta en suficiente enzima granzima B para hidrolizar el sustrato I-E-P-D-P-N-A.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elegir el sustrato y los controles experimentales adecuados para el análisis in vitro de la enzima B roja de humanos y ratones.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un ensayo colorimétrico cuantitativo para medir la actividad proteolítica de la granzima B (GzmB) en muestras humanas, de ratón o de rata. El método puede adaptarse para otras proteasas séricas de gránulos utilizando diferentes sustratos peptídicos sintéticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Actividad de proteasa
- Biología celular
Antecedentes
- La granzima B es una proteasa de serina implicada en las respuestas inmunitarias.
- Medir su actividad es crucial para comprender su papel en la citotoxicidad mediada por células.
- Los métodos existentes, como la PCR o el Western blot, no miden directamente la actividad de la proteasa.
- Este ensayo proporciona una medición específica y directa de la actividad de GzmB.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo sencillo para cuantificar la actividad de la granzima B.
- Proporcionar un método que pueda adaptarse para otras proteasas.
- Mejorar las técnicas existentes ofreciendo especificidad para la actividad de la granzima B.
Métodos Utilizados
- Preparación de lisados celulares a partir de linfocitos NK primarios.
- Uso de una reacción colorimétrica para medir la actividad de GzmB.
- Aislamiento de linfocitos NK a partir de bazo de ratones de tipo salvaje y ratones nulos para el gen de granzima B.
- Hidrólisis del sustrato para evaluar la actividad de la proteasa.
Resultados principales
- El ensayo mide con éxito la actividad de la GzmB mediante la escisión específica de sustratos.
- Demuestra una alta especificidad para la GzmB en comparación con otros métodos.
- Los resultados indican que la proteasa está activa según la hidrólisis del sustrato.
- El método es adaptable para otras proteasas serina de gránulos.
Conclusiones
- El ensayo desarrollado es una herramienta confiable para medir la actividad de la GzmB.
- Ofrece ventajas frente a los métodos tradicionales al evaluar directamente la función de la proteasa.
- Este enfoque puede mejorar la investigación sobre las respuestas inmunitarias y la biología de las proteasas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición precisa de la actividad proteolítica de la granzima B es esencial para validar la función de los linfocitos citotóxicos en el desarrollo de inmunoterapias. Este ensayo colorimétrico proporciona una lectura directa y específica de la actividad de la proteasa, permitiendo reducir los riesgos mecanicistas relacionados con la interacción con el blanco y el potencial proapoptótico en modelos preclínicos. Su compatibilidad entre especies favorece la continuidad traslacional desde estudios en roedores hasta aplicaciones humanas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las vías de apoptosis dependientes de la granzima B en linfocitos citotóxicos.
- Valor operativo: Distingue la proteasa activa de la mera expresión, reduciendo los falsos positivos en la validación de dianas.
- Valor predictivo: Apoya la confirmación funcional de la granzima B como impulsora mecanicista en la eliminación inmunitaria de tumores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Utiliza el sustrato Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizado exclusivamente por la granzima B en sistemas humanos, de ratón y de rata.
- Resultado cuantitativo: Mide las velocidades iniciales de hidrólisis mediante una reacción colorimétrica acoplada a DTNB a 405 nm para análisis cinético.
- Control de especificidad: Excluye interferencias de caspasa y otras granzimas debido a la preferencia única por aspartato.
- Reproducibilidad: Compatible con lisados no fraccionados y proteasas recombinantes cuando se incluyen controles adecuados.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicable a modelos de inmunovigilancia tumoral, infección viral y patología autoinmune en los que la granzima B media la muerte celular del blanco.
- Continuidad traslacional: Permite la medición consistente de la actividad entre especies, facilitando la extrapolación de datos de ratón a humano.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona un biomarcador basado en la actividad para priorizar candidatos con potencial citotóxico confirmado.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde la actividad funcional de la proteasa informa sobre la eficacia biológica y el mecanismo de acción.
- Biología del Descubrimiento: Confirma la hipótesis de que la granzima B induce la apoptosis en linfocitos efectorores mediante escisión específica del sustrato.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas de actividad para comparar condiciones o perturbaciones genéticas.
- Análisis: Genera datos cinéticos (Vmax) que permiten la comparación entre muestras y la evaluación estadística de la capacidad proteolítica.
- Investigación Traducional: Apoya la validación preclínica al verificar la actividad conservada entre la granzima humana, de ratón y de rata.
- Reutilización Empresarial: Plataforma adaptable a otras proteasas de gránulos mediante la sustitución del sustrato, lo que aumenta su utilidad a largo plazo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: La medición directa de la función proteolítica reduce la dependencia de marcadores sustitutos como los niveles de ARNm o de proteína.
- Valor operativo: Formato sencillo basado en placas, con tiempo mínimo de manipulación manual y compatibilidad con lectores estándar de microplacas.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en la actividad funcional y no solo en la expresión, mejorando la confianza predictiva.
- Impacto en la cartera: Facilita el avance de inmunoterapias ajustado al riesgo al confirmar tempranamente la potencia mecanicista durante el desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células inmunitarias primarias y en la lisis bajo condiciones controladas para preservar la actividad de las proteasas.
- Depende del acceso a un lector de microplacas capaz de realizar mediciones cinéticas de OD405 y de software de análisis compatible.
- Necesita la inclusión de controles con eliminación de granzima B para confirmar la especificidad del ensayo, tal como se demuestra en la fuente.
- La adaptación a otras proteasas requiere la validación de sustratos alternativos para mantener una especificidad y una ventana de señal equivalentes.
- Limitación práctica: el ensayo mide la actividad total del lisado y puede requerir fraccionamiento para estudios de localización subcelular.
